本發明屬于天(tian)然(ran)產物(wu)提取分離(li)技術(shu)領域，尤其(qi)涉及單羽火筒樹抗癌活性部位(wei)LA-D，其(qi)藥(yao)物(wu)組合物(wu)，及其(qi)化學成分分離(li)和(he)鑒定方法。

背景技術：
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單羽火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]，又(you)名九(jiu)節貍(li)，為(wei)葡萄科火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)屬植(zhi)物。單羽火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)的(de)(de)根具(ju)有(you)清熱利(li)但的(de)(de)功能，用于治(zhi)療(liao)黃疸肝炎(yan)[朱兆云(yun)(yun),云(yun)(yun)南天然藥(yao)物圖(tu)鑒(第5卷).昆(kun)明(ming):云(yun)(yun)南科技(ji)出版社.2009:285]。本(ben)申(shen)請(qing)人調查(cha)發現，在云(yun)(yun)南德宏(hong)，當(dang)地(di)居民稱單羽火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)為(wei)“九(jiu)節貍(li)”，用其(qi)治(zhi)療(liao)扁桃腺炎(yan)、三腺炎(yan)、乳房纖(xian)維瘤、子宮肌瘤、卵巢囊(nang)腫、毛囊(nang)炎(yan)等疾病。前人曾(ceng)報道(dao)該植(zhi)物甲醇提取物具(ju)有(you)抗腸道(dao)寄生蟲和抗氧化的(de)(de)作用[Sen S,De B,Devanna N,Chakraborty R.Anthelmintic and in vitro antioxidant evaluation of fractions of methanol extract of Leea asiatica leaves.Ancient Science of Life 2012,31(3),101-106]。單羽火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)的(de)(de)化學(xue)成分及其(qi)提取物的(de)(de)抗癌(ai)活(huo)性尚未見(jian)報道(dao)。因此，闡明(ming)單羽火(huo)筒(tong)(tong)樹(shu)抗癌(ai)活(huo)性的(de)(de)化學(xue)物質(zhi)基(ji)礎(chu)，對進(jin)一步的(de)(de)新(xin)藥(yao)研發和質(zhi)量控制具(ju)有(you)重要的(de)(de)意義。

技術實現要素：
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本發明(ming)針對現(xian)有技術存在了(le)上述問(wen)題(ti)，提(ti)供(gong)單(dan)羽火(huo)筒(tong)樹[Leea asiatica(Linnaeus)Ridsdale]抗癌(ai)癥活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)部(bu)(bu)位LA-D，以其活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)成(cheng)分的(de)藥物組合物，以及LA-D中的(de)化學成(cheng)分的(de)提(ti)取和鑒定(ding)方(fang)法(fa)。由于(yu)單(dan)羽火(huo)筒(tong)樹具有一(yi)定(ding)的(de)抗癌(ai)癥活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)，但是其活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)部(bu)(bu)位及其化學成(cheng)分不清楚，不能建(jian)立(li)質量控制標準(zhun)。所(suo)以，本發明(ming)提(ti)供(gong)了(le)單(dan)羽火(huo)筒(tong)樹的(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)部(bu)(bu)位乙酸乙酯部(bu)(bu)位LA-D分離(li)鑒定(ding)方(fang)法(fa)用于(yu)解(jie)決這(zhe)個技術問(wen)題(ti)。

為了(le)實現本發明的(de)上述(shu)目(mu)的(de)，本發明提供了(le)如(ru)下的(de)技術方案：

單羽火筒樹(shu)提取(qu)(qu)物(wu)乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取(qu)(qu)部(bu)位LA-D，所述的LA-D由下述方(fang)法(fa)制備而(er)得：單羽火筒樹(shu)干燥全株(zhu)粉碎后用(yong)甲(jia)醇冷(leng)浸7天，過濾，濾渣繼續提取(qu)(qu)，總共提取(qu)(qu)4次，合并濾液，回收溶劑(ji)，得浸膏(gao)，將(jiang)浸膏(gao)用(yong)水制成混懸液，分(fen)(fen)別用(yong)石油醚(mi)、氯仿(fang)和乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯萃(cui)取(qu)(qu)，回收溶劑(ji)獲(huo)得石油醚(mi)部(bu)分(fen)(fen)、氯仿(fang)部(bu)分(fen)(fen)、乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯部(bu)分(fen)(fen)，乙(yi)(yi)酸乙(yi)(yi)酯部(bu)分(fen)(fen)為LA-D。

如所(suo)述的(de)(de)(de)單羽火筒(tong)樹提取物乙酸乙酯萃取部(bu)位LA-D，其中所(suo)述的(de)(de)(de)LA-D中化學成(cheng)分山奈(nai)酚、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷、槲皮素(su)、異槲皮苷、槲皮素(su)-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷、楊(yang)(yang)梅素(su)、楊(yang)(yang)梅素(su)-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素(su)和山楂(zha)酸的(de)(de)(de)總含量(liang)以(yi)重(zhong)量(liang)百分比(bi)計，占(zhan)LA-D的(de)(de)(de)10-95％。

如(ru)所述(shu)的單(dan)羽(yu)火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(wei)LA-D，其中所述(shu)的LA-D中化學成分(fen)山(shan)奈酚(fen)、山(shan)萘酚(fen)-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)(gan)(gan)、槲皮(pi)素、異槲皮(pi)苷(gan)(gan)(gan)、槲皮(pi)素-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)(gan)(gan)、楊梅(mei)素、楊梅(mei)素-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)(gan)(gan)、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶(cha)素和山(shan)楂酸是(shi)從(cong)單(dan)羽(yu)火筒樹乙酸乙酯部位(wei)LA-D分(fen)離得到(dao)，步(bu)驟為(wei)：

(1)LA-D經硅膠柱層析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段，得到Fr.A₁、Fr.A₂、Fr.B₁、Fr.B₂、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10個部(bu)分；

(2)取Fr.A₁部分經C₁₈反相硅(gui)膠(jiao)柱層析，10:90→100:0的甲醇-水，得(de)到80％甲醇洗脫部(bu)分純化得(de)到化合物(wu)山楂酸；

(3)取Fr.B₁部分經C₁₈反相(xiang)硅(gui)膠柱層析，10:90→100:0的甲(jia)醇-水，得到5％甲(jia)醇洗(xi)脫部分，過LH-20凝膠柱層析，甲(jia)醇洗(xi)脫后得到B1-2-3和B1-2-5兩個主要部分。B1-2-3經(jing)半制(zhi)備高效液相(xiang)色譜純(chun)(chun)化(hua)得到山(shan)奈酚(fen)、山(shan)萘酚(fen)-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖苷、Europetin和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5經(jing)半制(zhi)備高效液相(xiang)色譜純(chun)(chun)化(hua)得到(-)-兒(er)茶素；

(4)取Fr.B₂部分和Fr.C部分合并后經C₁₈反相(xiang)硅膠柱(zhu)(zhu)層析(xi)，10:90→100:0的甲醇-水，得(de)到(dao)(dao)15％和(he)20％甲醇洗脫部(bu)分。15％甲醇洗脫部(bu)分用半(ban)制備(bei)高效液相(xiang)色譜純化得(de)到(dao)(dao)異槲(hu)皮苷；20％甲醇洗脫部(bu)分經(jing)LH-20凝膠柱(zhu)(zhu)層析(xi)得(de)到(dao)(dao)槲(hu)皮素(su)、楊梅素(su)-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷和(he)一個(ge)混合物，后者(zhe)經(jing)半(ban)制備(bei)高效液相(xiang)色譜純化得(de)到(dao)(dao)楊梅素(su)；

(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合并后經C₁₈反相硅膠(jiao)(jiao)柱層析，10:90→100:0的甲醇(chun)-水，得到40％甲醇(chun)洗脫部分(fen)，40％甲醇(chun)洗脫部分(fen)經LH-20凝(ning)膠(jiao)(jiao)層析柱得到槲皮素(su)-3-O-α-L-吡喃鼠李(li)糖苷；

其中，(3)所述B1-2-3的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脫部分的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脫部分的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(shui)(含(han)0.05％三氟乙(yi)酸)，比例30:70，流速(su)2mL/min。

本發(fa)明還提供了一種藥物(wu)組合(he)物(wu)，其(qi)中含有治療有效(xiao)量的(de)(de)所(suo)述的(de)(de)單(dan)羽火筒樹乙(yi)酸乙(yi)酯萃取部位LA-D和藥學(xue)上可接受的(de)(de)載體。

本發明另外還(huan)提(ti)供了一(yi)種單羽火筒(tong)樹乙(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)酯萃取(qu)部位LA-D的化學成分分離(li)鑒定方(fang)法，該(gai)方(fang)法是(shi)從單羽火筒(tong)樹乙(yi)酸(suan)(suan)乙(yi)酯萃取(qu)部位LA-D分離(li)得到(dao)山奈酚、山萘酚-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)、槲皮素(su)、異槲皮苷(gan)、槲皮素(su)-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)、楊(yang)梅素(su)、楊(yang)梅素(su)-3-O-α-L-吡(bi)喃鼠李(li)糖(tang)苷(gan)、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素(su)和山楂(zha)酸(suan)(suan)，其步驟(zou)為：

(1)LA-D經硅膠柱層析用20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1的氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段，得到Fr.A₁、Fr.A₂、Fr.B₁、Fr.B₂、Fr.C、Fr.D、Fr.E、Fr.F、Fr.G、Fr.H等10個(ge)部(bu)分；

(2)取Fr.A₁部分經C₁₈反相硅膠(jiao)柱層析，10:90→100:0的甲醇(chun)-水，得(de)到80％甲醇(chun)洗脫(tuo)部(bu)分純化(hua)得(de)到化(hua)合物(wu)山楂酸(suan)(maslinic acid)；

(3)取Fr.B₁部分經C₁₈反相(xiang)硅膠柱(zhu)層析，10:90→100:0的甲醇-水(shui)，得(de)(de)到5％甲醇洗脫部(bu)分(fen)，過LH-20凝(ning)膠柱(zhu)層析，甲醇洗脫后得(de)(de)到B1-2-3和(he)B1-2-5兩個(ge)主(zhu)要部(bu)分(fen)。B1-2-3經(jing)半制備高(gao)效液相(xiang)色譜純化(hua)得(de)(de)到山奈酚(fen)、山萘酚(fen)-3-O-α-L-吡喃鼠李(li)糖苷、Europetin和(he)Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside；B1-2-5經(jing)半制備高(gao)效液相(xiang)色譜純化(hua)得(de)(de)到(-)-兒茶(cha)素；

(4)取Fr.B₂部分和Fr.C部分合并后經C₁₈反相硅(gui)膠(jiao)柱(zhu)層析，10:90→100:0的甲(jia)醇(chun)(chun)-水，得(de)到15％和20％甲(jia)醇(chun)(chun)洗脫部(bu)分。15％甲(jia)醇(chun)(chun)洗脫部(bu)分用半(ban)制(zhi)(zhi)備高效(xiao)液相色譜純化得(de)到異槲皮(pi)苷(gan)(isoquercitrin)；20％甲(jia)醇(chun)(chun)洗脫部(bu)分經(jing)LH-20凝膠(jiao)柱(zhu)層析得(de)到槲皮(pi)素、楊(yang)梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(gan)和一個(ge)混(hun)合(he)物，后(hou)者經(jing)半(ban)制(zhi)(zhi)備高效(xiao)液相色譜純化得(de)到楊(yang)梅素；

(5)取Fr.D部分和Fr.E部分合并后經C₁₈反相硅膠柱(zhu)層析，10:90→100:0的甲醇-水，得到40％甲醇洗脫部分。40％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠層析柱(zhu)得到槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷；

其中，(3)所述B1-2-3的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例40:60，流速2mL/min；B1-2-5的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；(4)所述15％甲醇洗脫部分的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，色譜柱大小4.6×300mm，洗脫劑為甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例15:85，流速2mL/min；20％甲醇洗脫部分的半制備高效液相色譜是用安捷倫1200液相色譜儀，Ultimate AQ-C₁₈色譜(pu)柱(zhu)(zhu)，色譜(pu)柱(zhu)(zhu)大小4.6×300mm，洗脫劑為(wei)甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，比例(li)30:70，流速2mL/min。

根據所述的(de)一(yi)種單羽火筒樹乙(yi)酸乙(yi)酯萃取部位LA-D的(de)化學成分分離鑒定方法，該方法從(cong)LA-D中(zhong)分離得(de)到11個化合(he)物，通過(guo)質譜MS及核(he)磁共振波普NMR對其進行化學結構的(de)確定。

根據所(suo)述(shu)的一種單羽火筒樹乙(yi)酸乙(yi)酯(zhi)萃取部位(wei)LA-D的化學(xue)成分分離鑒定(ding)方(fang)法(fa)，該方(fang)法(fa)從(cong)LA-D中分離提取得到化學(xue)成分山(shan)(shan)奈酚(fen)、山(shan)(shan)萘酚(fen)-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷(gan)、槲皮(pi)(pi)素(su)(su)(su)、異槲皮(pi)(pi)苷(gan)、槲皮(pi)(pi)素(su)(su)(su)-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷(gan)、楊梅素(su)(su)(su)、楊梅素(su)(su)(su)-3-O-α-L-吡喃鼠(shu)李糖苷(gan)、Europetin、Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside、(-)-兒茶素(su)(su)(su)和山(shan)(shan)楂酸，用(yong)于(yu)建立LA-D的質量(liang)控制標準。

本發明同(tong)時還提供了(le)所述的單羽火筒樹乙(yi)酸乙(yi)酯萃取部位LA-D在制備治療或預防癌(ai)癥疾病的藥物中(zhong)的應(ying)用。

根(gen)據(ju)所述(shu)的單羽火筒樹乙(yi)(yi)酸(suan)乙(yi)(yi)酯萃取部位LA-D在(zai)制備治(zhi)療(liao)或預防癌(ai)(ai)(ai)癥疾病的藥物(wu)中的應用，其(qi)所述(shu)的癌(ai)(ai)(ai)癥為白(bai)血病、肝癌(ai)(ai)(ai)、肺(fei)癌(ai)(ai)(ai)。

本發明(ming)的(de)(de)乙酸(suan)乙酯萃取部位用(yong)(yong)作(zuo)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)時，可(ke)(ke)(ke)以(yi)直接使(shi)用(yong)(yong)，或(huo)(huo)者以(yi)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)形(xing)式(shi)使(shi)用(yong)(yong)。也(ye)可(ke)(ke)(ke)以(yi)與其他藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組成復方的(de)(de)形(xing)式(shi)使(shi)用(yong)(yong)，該藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)含(han)有10～99％，優選為30～90％的(de)(de)本發明(ming)的(de)(de)乙酸(suan)乙酯萃取部位，其余(yu)為藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)學上(shang)可(ke)(ke)(ke)接受(shou)的(de)(de)，對(dui)人和(he)動物(wu)(wu)(wu)無毒和(he)惰(duo)性的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)制(zhi)(zhi)劑(ji)常用(yong)(yong)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)用(yong)(yong)載(zai)體(ti)和(he)/或(huo)(huo)賦形(xing)劑(ji)。將本發明(ming)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)以(yi)單(dan)位體(ti)重服(fu)用(yong)(yong)量的(de)(de)形(xing)式(shi)使(shi)用(yong)(yong)。可(ke)(ke)(ke)以(yi)使(shi)用(yong)(yong)不同的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)用(yong)(yong)輔(fu)料(liao)，制(zhi)(zhi)成固體(ti)制(zhi)(zhi)劑(ji)(片劑(ji)、膠囊劑(ji)、顆粒劑(ji)、散(san)劑(ji)等)或(huo)(huo)液(ye)體(ti)制(zhi)(zhi)劑(ji)(注(zhu)射(she)劑(ji)、溶液(ye)劑(ji)、混懸劑(ji)、乳劑(ji)、糖漿(jiang)劑(ji)等)。本發明(ming)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)可(ke)(ke)(ke)經口(kou)服(fu)和(he)注(zhu)射(she)(靜(jing)脈注(zhu)射(she)、靜(jing)脈滴注(zhu)、肌肉注(zhu)射(she)、皮下(xia)注(zhu)射(she)等)形(xing)式(shi)給藥(yao)(yao)(yao)(yao)(yao)。

與現有(you)技(ji)術相(xiang)比，本發明具有(you)下述(shu)的優異效果：單羽火筒樹提取物，特別(bie)是乙酸乙酯(zhi)部(bu)位(LA-D)對(dui)白血(xue)病HL-60細胞(bao)、肝癌SMMC-7721細胞(bao)、肺癌A-549細胞(bao)有(you)抑制(zhi)(zhi)活(huo)性(xing)。本發明首次(ci)闡明了單羽火筒樹抗癌活(huo)性(xing)部(bu)位LA-D的主要化學成分(fen)，這(zhe)些成分(fen)可以用于制(zhi)(zhi)定(ding)LA-D的質量控制(zhi)(zhi)標(biao)準。

具體實施方式：

下面用本發(fa)明(ming)(ming)的(de)實施例來(lai)進一步說明(ming)(ming)本發(fa)明(ming)(ming)的(de)實質性(xing)內容，但并不(bu)以此來(lai)限(xian)定本發(fa)明(ming)(ming)。

實施例1：

本發(fa)明的(de)(de)(de)LA-D的(de)(de)(de)制(zhi)備及(ji)其所含化學成分(fen)的(de)(de)(de)分(fen)離(li)：

LA-D的制(zhi)備(bei)：單羽(yu)火(huo)筒樹(shu)的干燥全(quan)株(zhu)(1.3kg)粉碎后用甲醇(4L)浸泡7天，過濾(lv)，濾(lv)渣(zha)繼續(xu)提(ti)取(qu)(qu)。總共提(ti)取(qu)(qu)4次，合并濾(lv)液，回(hui)收(shou)溶劑，得浸膏(編(bian)號LA)167g。將(jiang)LA用水(shui)(500mL)制(zhi)成(cheng)混懸(xuan)液，分(fen)別(bie)用石(shi)油醚(0.5L×3)、氯(lv)仿(0.5L×3)萃(cui)取(qu)(qu)，萃(cui)取(qu)(qu)后的母液繼續(xu)用乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(0.5L×3)萃(cui)取(qu)(qu)，回(hui)收(shou)乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯，得乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯萃(cui)取(qu)(qu)部(bu)位(編(bian)號LA-D)18g。

LA-D所含化學成(cheng)分(fen)的分(fen)離：

取重量為18g的LA-D經硅膠柱層析用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A₁(1.34g)、Fr.A₂(1.54g)、Fr.B₁(1.40g)、Fr.B₂(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等(deng)10個(ge)部分；

取Fr.A₁部分1.34g過C₁₈反相硅膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)洗脫，得到80％甲醇洗脫部分，純化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B₁部分1.40g經C₁₈反相硅膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)洗脫，得到5％甲醇洗脫部分690.4mg，過LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫后得到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)兩個主要部分。B1-2-3經半制備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min]純化得到山奈酚(3.1mg，保留時間11.368min)、山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg，保留時間4.980min)、Europetin(3.0mg，保留時間16.187min)和Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside(3.0mg，保留時間33.208min)；B1-2-5經半制備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]純化得到(-)-兒茶素(3.3mg，保留時間8.284min)。取Fr.B₂部分0.67g和Fr.C部分2.38g合并后為3.05g經C₁₈反相硅膠柱層析甲醇-水(10:90→100:0)得到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脫部分。15％甲醇洗脫部分用半制備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min]純化得到異槲皮苷(isoquercitrin，3.0mg，保留時間37.685min)；20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析得到槲皮素(1.9mg)、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一個混合物(48.6mg)，后者經半制備高效液相色譜[安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟乙酸)，30:70，流速2mL/min]純化得到楊梅素(5.3mg，保留時間12.082min)。取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合并后為4.91g經C₁₈反相硅(gui)膠(jiao)柱層析甲(jia)(jia)醇-水(10:90→100:0)得到(dao)40％(599.8mg)甲(jia)(jia)醇洗脫部分。40％甲(jia)(jia)醇洗脫部分經LH-20凝膠(jiao)層析柱得到(dao)槲(hu)皮素-3-O-α-L-吡喃(nan)鼠(shu)李糖苷(quercitrin，18.3mg)。

實施例2

本發明的LA-D化學成(cheng)分的結構鑒定(ding)：

山奈酚(kaempferol)，黃色針狀晶體，分子式C₁₅H₁₀O₆，CAS登記號520-18-3。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ:6.19(1H,s),6.41(1H,s),6.91(2H,d,J＝8.6Hz),8.10(2H,d,J＝8.6Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:179.4,165.6,162.5,160.6,158.3,148.1,136.5,130.7,130.7,123.7,116.3,116.3,104.5,99.2,99.4。ESI-MS m/z 285[M-H]^-。其¹H NMR跟文獻[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents of Lindera glauca.Journal of the Chinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中有報道(dao)的(de)一致。

山萘酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黃色粉末，分子式C₂₁H₂₀O₁₀，CAS登記號5041-73-6。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ:6.21(1H,d,J＝2.0Hz),6.39(1H,d,J＝2.0Hz),7.77(2H,d,J＝8.8Hz),6.93(2H,d,J＝8.8Hz),5.38(1H,d,J＝1.6Hz),0.92(1H,d,J＝5.7Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:179.6,165.8,162.2,161.6,159.3,158.6,136.2,131.8,131.8,122.6,123.7,116.5,116.5,105.9,103.5,99.8,94.7,73.2,72.1,72.0,71.9,17.7。ESI-MS m/z 430[M-H]^-。其(qi)NMR數據跟文獻[汪瓊(qiong),王易芬,鞠鵬,羅士德(de).錐序(xu)蜜(mi)心果中酚性成(cheng)分的(de)研(yan)究(英文).天然產(chan)物研(yan)究與開發,2008,4:641-643]中的(de)數據基本一致。

槲皮素(quercetin)，黃色顆粒狀結晶，分子式C₁₅H₁₀O₇，CAS登記號117-39-5。¹H NMR(CD₃OD,400MHz)δ:6.18(1H,d,J＝2.1Hz),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),7.63(1H,dd,J＝8.8Hz),7.78(1H,d,J＝2.0Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:177.4,165.6,162.5,158.2,148.8,147.9,146.2,136.8,124.1,121.6,116.2,115.9,104.5,99.2,94.4。ESI-MS m/z 301[M-H]^-。其NMR數(shu)據(ju)跟文(wen)獻[Chang Y C,Chang F R,Wu Y C.The constituents of Lindera glauca.Journal of the Chinese Chemical Society,2000,47(2),373-380.]中(zhong)的(de)數(shu)據(ju)基本一致(zhi)。

異槲皮苷(isoquercitrin)，黃色粉末，分子式C₂₁H₂₀O₁₂，CAS登記號21637-25-2。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ7.84(1H,d,J＝2.1Hz),7.59(1H,dd,J＝8.5,2.1Hz),6.86(1H,d,J＝8.5Hz),6.41(1H,s),6.21(1H,d,J＝1.8Hz),5.17(1H,d,J＝7.8Hz),3.87–3.43(7H,m)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:179.5,166.1,163.0,158.8,158.5,149.9,145.8,135.7,122.9,122.8,117.7,116.1,105.6,105.3,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z 463[M-H]^-。其NMR數據(ju)與文獻[王志(zhi)偉,譚曉杰,馬(ma)婷(ting)婷(ting),陳曉輝,畢(bi)開順(shun).茵陳化(hua)學成(cheng)分的(de)分離與鑒定(ding).沈陽藥科大學學報(bao),2008,25(10):781-783]中的(de)數據(ju)基本一致。

槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)，黃色針晶，分子式C₂₁H₂₀O₁₁，CAS登記號522-12-3。¹H NMR(500MHz,CD₃OD)δ7.39–7.23(m,2H),6.97–6.80(m,1H),6.43–6.11(m,2H),5.35(d,J＝1.6Hz,1H),4.46–4.09(m,1H),3.95–3.66(m,1H),3.65–3.11(m,5H),0.94(d,J＝6.2Hz,3H)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ:179.6,165.8,163.2,159.3,158.5,149.8,146.4,136.2,122.9,122.8,116.9,116.4,105.8,103.5,99.8,94.6,77.2,75.1,73.1,69.3,61.9。ESI-MS m/z 447[M-H]^-。其NMR數據(ju)與(yu)文獻(xian)[楊秀嶺(ling),袁(yuan)志芳(fang),許慧(hui)君,范(fan)麗芳(fang),霍(huo)長虹,張蘭桐(tong).照山白黃酮類(lei)化(hua)學成分的研(yan)究.藥物分析雜(za)志,2010,30(9):1750-1752]中的數據(ju)基本一(yi)致(zhi)。

楊梅素(myricetin)，黃色針狀晶體，分子式C₁₅H₁₀O₈，CAS登記號529-44-2。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ7.33(1H,s),6.37(1H,d,J＝2.1Hz),6.17(1H,d,J＝2.1Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ177.3,165.6,162.5,158.2,147.9,146.7,137.4,136.9,123.1,108.5,104.5,99.2,94.3。ESI-MS m/z 316[M-H]^-。其NMR數據與(yu)文獻[周(zhou)志(zhi)宏,楊(yang)崇(chong)仁.矮(ai)楊(yang)梅(mei)鮮(xian)葉的(de)酚性化學成分.云(yun)南(nan)植物(wu)研究,2000,22(2):6219-224]中的(de)數據基本一致(zhi)。

楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，黃色片狀晶體，分子式C₂₁H₂₀O₁₂，CAS登記號17912-87-7。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ6.94(2H,s),6.36(1H,d,J＝2.1Hz),6.20(1H,d,J＝2.1Hz),5.31(1H,d,J＝1.5Hz),4.21(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.78(1H,dd,J＝9.5,3.4Hz),3.51(1H,m),3.30(1H,t,J＝9.2Hz),0.96(3H,d,J＝6.2Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ179.7,165.8,163.2,159.4,158.5,146.8,137.8,136.3,121.8,105.8,103.6,99.7,94.6,73.3,72.1,72.0,71.8,17.6。ESI-MS m/z 463[M-H]^-。其NMR數據與文(wen)獻(xian)[Chung S K,Kim Y C,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methyl mearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidant effect.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(15),4664-4668]中(zhong)的數據基本一致。

Europetin，分子式C₁₆H₁₂O₈，CAS登記號16280-27-6。¹H NMR(CDCl₃,400MHz)δ7.30(2H,s),6.36(1H,s),3.85(3H,s)。¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ175.5,164.6,160.1,155.7,147.1,145.5,135.9,135.8,120.5,107.2,103.6,97.2,91.5,55.8。ESI-MS m/z 331[M-H]^-。其¹³C NMR數據與文獻[Matsuda H,Morikawa T,Toguchida I,Yoshikawa,M.Structural requirements of flavonoids and related compounds for aldose reductase inhibitory activity.Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2002,50(6),788-795]中的數據基本一致。

Europetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside，分子式C₂₂H₂₂O₁₂。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ6.86(2H,s),6.35(1H,d,J＝1.8Hz),6.19(1H,d,J＝2.0Hz),5.29(1H,d,J＝1.6Hz),4.20(1H,dd,J＝3.3,1.7Hz),3.85(s,4H),0.92(3H,t,J＝5.6Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ179.5,165.9,163.1,158.9,158.4,151.8,149.4,139.4,136.6,126.8,109.6,105.8,103.5,99.7,94.6,73.0,71.9,71.7,60.7,17.6。ESI-MS m/z 477[M-H]^-。其NMR數(shu)據與文(wen)獻[Chung S K,Kim Y C,Takaya Y,Terashima,K.,&Niwa,M.Novel flavonol glycoside,7-O-methyl mearnsitrin,from Sageretia theezans and its antioxidant effect.Journal of agricultural and food chemistry,2004,52(15),4664-4668]中的數(shu)據基本一致(zhi)。

(-)-兒茶素(ent-catechin)，白色粉末，分子式C₁₅H₁₄O₆，CAS登記號18829-70-4。[α]_D²⁶-11.9°(c＝0.33,MeOH)。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ6.84(1H,d,J＝2.0Hz),6.78–6.74(1H,m),6.72(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz),5.93(1H,d,J＝2.0Hz),5.85(1H,d,J＝2.3Hz),4.56(1H,d,J＝7.5Hz),3.97(1H,td,J＝8.0,5.5Hz),2.85(1H,dd,J＝16.1,5.4Hz),2.50(1H,dd,J＝16.1,8.2Hz)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ157.8,157.6,156.9,146.3,146.3,132.2,120.0,116.1,115.2,100.8,96.3,95.5,82.9,68.1,28.53。ESI-MS m/z 289[M-H]^-。其NMR數據與文獻(xian)[李(li)勇軍,何(he)迅,劉麗(li)娜,蘭燕宇,王(wang)愛民,王(wang)永林(lin).葒草化學成分的研究.中國中藥雜志,2005,30(6):444-446]中的數據基本一致。

山楂酸(maslinic acid)，白色粉末，分子式C₃₀H₄₈O₄，CAS登記號4373-41-5。¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ5.24(1H,m),3.64(1H,m),3.30(1H,m),1.32(3H,m),1.12(3H,s),1.01(3H,s),0.96(3H,s),0.87(3H,s),0.84(3H,s),0.84(3H,s)。¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ181.6,139.7,126.7,84.4,69.5,56.6,48.9,48.8,48.6,48.5,43.3,40.8,40.5,40.4,39.2,38.1,34.2,31.7,30.8,29.3,29.1,25.3,24.4,24.1,21.6,19.5,17.8,17.6,17.5,17.2。ESI-MS m/z 471[M-H]^-。其(qi)NMR數(shu)(shu)據與文獻[王東(dong),崔征,董炎,付明耀(yao),宋德(de)蘭.榆樹根皮的(de)化學(xue)成(cheng)分.沈陽藥科(ke)大學(xue)學(xue)報,2004,21(6):426-429]中的(de)數(shu)(shu)據基(ji)本(ben)一(yi)致。

實施例3：

單羽火筒樹提取物(wu)乙酸(suan)乙酯部(bu)位(LA-D)對腫瘤(liu)細(xi)胞生長抑(yi)制作用：

1.將LA-D進行分(fen)段。

取重量為18g的LA-D經硅膠柱層析用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫劃段(20:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)的，得到Fr.A₁(1.34g)、Fr.A₂(1.54g)、Fr.B₁(1.40g)、Fr.B₂(0.67g)、Fr.C(2.38g)、Fr.D(4.77g)、Fr.E(0.47g)、Fr.F(0.83g)、Fr.G(0.68g)、Fr.H(0.51g)等(deng)10個(ge)部(bu)分(fen)；

2.從重量(liang)大的部(bu)分中取(qu)少量(liang)樣(yang)品，利(li)用(yong)柱層析(xi)及半制備高(gao)效液(ye)相色譜(pu)技術快速獲取(qu)化學成分。

取Fr.A₁部分1.34g，過C₁₈反相硅膠柱層析(甲醇-水洗脫)，得到80％甲醇洗脫部分，過LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫)純化得到化合物山楂酸(3.0mg)。取Fr.B₁部分1.40g經C₁₈反相(xiang)硅膠柱層(ceng)析(xi)(甲醇(chun)-水洗脫(tuo))，得(de)到5％甲醇(chun)洗脫(tuo)部分690.4mg，過LH-20凝膠柱層(ceng)析(xi)(甲醇(chun)洗脫(tuo))，后得(de)到B1-2-3(157.0mg)和B1-2-5(222.4mg)兩個(ge)主要部分。

取B1-2-3經半制備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含(han)0.05％三氟乙酸)，40:60，流速2mL/min)純(chun)化得到(dao)山奈酚(fen)(3.1mg，保(bao)留時(shi)間(jian)11.368min)、山萘酚(fen)-3-O-α-l-吡(bi)喃鼠李(li)糖苷(5.1mg，保(bao)留時(shi)間(jian)4.980min)、Europetin(3.0mg，保(bao)留時(shi)間(jian)16.187min)和Europetin 3-O-α-l-rhamnopyranoside(3.0mg，保(bao)留時(shi)間(jian)33.208min)。

取B1-2-5經半制備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜(pu)柱，4.6×300mm；甲醇-水(含(han)0.05％三氟乙酸)，15:85，流速2mL/min)純化得到(dao)(-)-兒茶素(3.3mg，保(bao)留時間8.284min)。

取Fr.B₂部分0.67g和Fr.C部分2.38g合并后為3.05g經C₁₈反(fan)相硅膠(jiao)柱層析(甲醇-水洗脫)得(de)到15％(362.1mg)和20％(368mg)甲醇洗脫部分

取15％甲醇洗脫部分用半制備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟(fu)乙(yi)酸)，15:85，流(liu)速2mL/min)純化得到異槲皮(pi)苷(isoquercitrin)(3.0mg，保(bao)留時(shi)間37.685min)。

取20％甲醇洗脫部分經LH-20凝膠柱層析(甲醇洗脫)得到槲皮素(1.9mg)、楊梅素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(5.1mg)和一個混合物(48.6mg)，后者經半制備高效液相色譜(安捷倫1200，Ultimate AQ-C₁₈色譜(pu)柱，4.6×300mm；甲醇-水(含0.05％三氟(fu)乙酸(suan))，30:70，流速2mL/min)純化得到(dao)楊(yang)梅素(5.3mg，保留時間12.082min)。

取Fr.D部分4.77g和Fr.E部分0.47g合并后為4.91g經C₁₈反(fan)相硅(gui)膠(jiao)柱層析(xi)(甲(jia)醇(chun)-水洗(xi)脫)得(de)到(dao)40％(599.8mg)甲(jia)醇(chun)洗(xi)脫部分。40％甲(jia)醇(chun)洗(xi)脫部分經LH-20凝膠(jiao)層析(xi)柱(甲(jia)醇(chun)洗(xi)脫)得(de)到(dao)槲皮(pi)素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercitrin)(18.3mg)。

本次(ci)發明(ming)首闡明(ming)了單羽火筒樹抗癌(ai)活(huo)性部位LA-D的(de)主要化學成分(fen)，這些成分(fen)可以(yi)用于制定LA-D的(de)質量(liang)控制標準。

將單羽火筒樹及經(jing)過(guo)處理的各部位進行(xing)細胞毒(du)活性測試，結(jie)果(guo)見表1，結(jie)果(guo)表明，乙酸(suan)乙酯萃取部位(LA-D)對白(bai)血病HL-60細胞、肝癌(ai)SMMC-7721細胞、肺癌(ai)A-549細胞有抑制(zhi)活性。

表1單(dan)羽(yu)火筒(tong)樹提取物乙(yi)酸乙(yi)酯萃取部位(LA-D)對(dui)腫瘤細(xi)胞生長抑制作用

實施例4：

注射液制劑的制備：

按實施例1的(de)方法先制得(de)本發(fa)明的(de)單羽火筒樹提(ti)取物乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯萃取部位(LA-D)，按常規加(jia)注射(she)用水，精濾，灌封滅菌制成注射(she)液。

實施例5：

粉針劑的制備：

按實(shi)施例1的方法先制得(de)本(ben)發明的單羽火筒樹(shu)提取物乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯(zhi)萃取部(bu)位(wei)(LA-D)，將其溶于無菌(jun)(jun)注射(she)用(yong)水中，攪拌使溶，用(yong)無菌(jun)(jun)抽濾(lv)漏斗(dou)過濾(lv)，再無菌(jun)(jun)精濾(lv)，分裝于2安(an)瓿(bu)中，低溫冷凍干(gan)燥后無菌(jun)(jun)熔封(feng)得(de)粉針劑。

實施例6：

粉劑的制備：

按實施例1的(de)(de)方法先制得本(ben)發明的(de)(de)單羽火筒樹提取物乙酸乙酯萃取部位(LA-D)，與賦(fu)形劑重量比為9:1的(de)(de)比例加(jia)入賦(fu)形劑，制成粉劑。

實施例7：

片劑的制備：

按(an)實施例1的(de)方法先制(zhi)得本發(fa)明的(de)單羽火筒(tong)樹提取(qu)物(wu)乙酸乙酯萃取(qu)部位(LA-D)，按(an)其與(yu)賦(fu)形(xing)劑重量比(bi)為(wei)1:5‐1:10的(de)比(bi)例加入賦(fu)形(xing)劑，制(zhi)粒壓(ya)片。

實施例8：

口服液制劑的制備：

按(an)實施例1的(de)方法(fa)先(xian)制得本(ben)發明的(de)單羽火筒樹(shu)提取物乙酸乙酯萃取部位(wei)(LA-D)，按(an)常規口服(fu)液制法(fa)制成口服(fu)液。

實施例9：

膠囊劑(ji)(ji)、顆粒劑(ji)(ji)、或沖(chong)劑(ji)(ji)的制(zhi)備：

按實施(shi)例1的(de)(de)方法先(xian)制得本(ben)發明的(de)(de)單羽火筒樹提取(qu)物乙酸乙酯萃(cui)取(qu)部位(wei)(LA-D)，按其與賦形(xing)劑(ji)重(zhong)量比為5:1的(de)(de)比例加入賦形(xing)劑(ji)，制成膠囊或顆粒(li)劑(ji)或沖(chong)劑(ji)。