本發(fa)明屬于(yu)植物提取(qu)多糖(tang)的方法技術領域，具體(ti)涉及(ji)川貝母多糖(tang)的提取(qu)與(yu)分離純化(hua)工藝。
背景技術：
川貝母(mu)(mu)為百合科貝母(mu)(mu)屬植物，多年(nian)生草(cao)本(ben)，分布(bu)于四川、云南和四川等地。川貝母(mu)(mu)有(you)潤肺止咳的功效，目(mu)前，川貝母(mu)(mu)主要(yao)集中在其生物堿(jian)的研究(jiu)(jiu)，對(dui)川貝母(mu)(mu)多糖的提取與(yu)藥(yao)理(li)研究(jiu)(jiu)較少。
目前，川(chuan)貝母多糖的提(ti)取(qu)(qu)(qu)與分離方法有熱(re)水浸(jin)提(ti)、乙醇提(ti)取(qu)(qu)(qu)，超(chao)聲波提(ti)取(qu)(qu)(qu)和索式提(ti)取(qu)(qu)(qu)等方法。但這些常規(gui)方法提(ti)取(qu)(qu)(qu)率都偏低(2％左右(you))、純度(du)不高(80％左右(you))。
所以研究一種高效的(de)川(chuan)貝母(mu)多糖(tang)的(de)提取(qu)與分離純化技(ji)術對于川(chuan)貝母(mu)產(chan)業的(de)發展是至關(guan)重要的(de)。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種川貝母多糖的提取與分離純化工藝，所述工藝利用超臨界CO2萃取(qu)(qu)(qu)技術提(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)川貝母多糖后，蛋白(bai)(bai)酶K處理除(chu)蛋白(bai)(bai)，CPC季銨(an)鹽(yan)沉淀，再(zai)經過離子(zi)交換層析進一步純(chun)(chun)化。該(gai)法提(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)率及(ji)純(chun)(chun)度高，可克服常規方法存在的提(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)率偏(pian)低(di)、純(chun)(chun)度不高等缺點。
為實現上述發明目的，具體提供(gong)了(le)如下的技(ji)術方案(an)：
川貝母多糖的提取與分離純化(hua)工(gong)藝，包括如下步驟：
(1)川(chuan)貝(bei)母多(duo)糖粗品(pin)的提取
(1.1)萃取：取川貝母鱗莖，烘干并粉碎至粒徑小于60目，將粉碎后的川貝母鱗莖放至超臨界CO2萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)釜(fu)中，封釜(fu)，排除空氣，通入攜(xie)帶劑進行萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)得提取(qu)(qu)液，萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)溫度為47.3℃，萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)壓力為23.7MPa，萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)二氧化碳流量為20-28L/h，攜(xie)帶劑為蒸餾(liu)水，用量為390ml/kg，萃(cui)(cui)(cui)取(qu)(qu)2.5h；
(1.2)脫色(se)：將步驟(1.1)所(suo)得提(ti)取液用(yong)1mol/L NaOH調至pH 7.8，并加入硅(gui)藻(zao)土加熱煮沸5min脫色(se)，減(jian)壓過(guo)濾得濾液，所(suo)加入硅(gui)藻(zao)土與提(ti)取液的質(zhi)量比(bi)為1.5％；
(1.3)濃縮(suo)干燥：將步驟(zou)(1.2)所得濾液于75℃水(shui)浴條件才減壓濃縮(suo)至(zhi)原體積(ji)(ji)的30％，再加入4倍體積(ji)(ji)的95wt％乙(yi)(yi)醇(chun)，攪拌，在3000r/min條件下離心(xin)10min得沉淀I，沉淀I分別用無水(shui)乙(yi)(yi)醇(chun)和乙(yi)(yi)醚洗滌，真空(kong)干燥得川貝母多糖粗品；
(2)川貝(bei)母多糖(tang)粗品(pin)的純化
(2.1)除蛋白：以質量體(ti)(ti)積比(bi)1％取莼菜(cai)多糖粗品及蒸餾水并混合均(jun)勻，3000r/min離心(xin)10min除去不(bu)溶物，取上清液加入1/5體(ti)(ti)積的(de)氯仿和戊醇混合液，3000r/min離心(xin)10min得上層清液I，所述混合液中(zhong)氯仿和戊醇的(de)體(ti)(ti)積比(bi)為5:1；
(2.2)純(chun)化(hua)：向上(shang)層(ceng)清液I加十(shi)六烷基氯化(hua)吡啶至沉(chen)淀完全，靜(jing)置5h，3000r/min離(li)心10min得沉(chen)淀II，沉(chen)淀II用70℃熱(re)水(shui)洗(xi)滌三(san)次，然(ran)后向沉(chen)淀II加入2mol/L的NaCl溶液在60℃溫度條件下解(jie)離(li)4h，并(bing)在3000r/min離(li)心10min得上(shang)層(ceng)清液II；
(2.3)離(li)子交換層析進一(yi)步純(chun)化：將上(shang)層清液II通過(guo)DEAE-Sephadex柱吸附，冰水洗(xi)至澄清，用0.1mol/LNaCl洗(xi)脫(tuo)，流速為0.2ml/min，收集洗(xi)脫(tuo)液；
(2.4)透(tou)析(xi)、濃(nong)縮、干(gan)燥：將(jiang)步驟(zou)(2.3)所得洗(xi)脫(tuo)液使用蒸餾水透(tou)析(xi)18h，將(jiang)所得透(tou)析(xi)液在75℃水浴條件下(xia)減壓濃(nong)縮至原(yuan)體積的30％，再加(jia)入4倍體積的95wt％乙醇(chun)，攪拌，3000r/min離心10min得沉(chen)淀(dian)III，沉(chen)淀(dian)III分別(bie)用無水乙醇(chun)和乙醚(mi)洗(xi)滌，真空干(gan)燥，得精制川貝母多糖(tang)。
優選(xuan)的(de)，步驟(2.2)所述十六烷基氯化吡啶質(zhi)量分數為2％。
本發明的有益(yi)效果(guo)在(zai)于：
1)本發明采用超臨界CO2萃取(qu)(qu)新技術，克服(fu)了常規方法存在(zai)的提取(qu)(qu)率偏低、純度(du)不高等缺(que)點；
2).季(ji)銨鹽十六烷基氯(lv)化(hua)吡啶能與貝母多(duo)糖在低離子(zi)強度的水溶(rong)液中沉(chen)淀出來，當高(gao)離子(zi)強度時，沉(chen)淀又(you)可(ke)以溶(rong)解、解離、釋放，純化(hua)效果(guo)好；
3)利用(yong)DEAE-Sephadex離子(zi)交(jiao)換層析，進一步去(qu)除一些(xie)不帶電和(he)帶正電荷(he)的雜質，分(fen)離純化效果更好。
具體實施方式
下面對本發明(ming)的優(you)選(xuan)實(shi)施(shi)例進行詳細的描述。實(shi)施(shi)例中未注(zhu)明(ming)具體條(tiao)件(jian)的實(shi)驗方(fang)法(fa)，通常(chang)按照常(chang)規條(tiao)件(jian)或按照制造(zao)廠商所建(jian)議(yi)的條(tiao)件(jian)。
以下(xia)實施例所用試劑及器材：超臨界萃取系(xi)統(美國STF-100)、透析袋(Sigma)、DEAE-Sephadex離子交換(huan)樹脂(上海恒信化學(xue)試劑有限公(gong)司)、常規化學(xue)試劑均購自北京鼎國生物技(ji)術有限公(gong)司。
實施例1
(1)川貝母(mu)多糖粗品的提取
(1.1)萃取：取川貝母鱗莖，烘干并粉碎至粒徑小于60目，將粉碎后的川貝母鱗莖放至超臨界CO2萃取(qu)(qu)(qu)釜(fu)中，封釜(fu)，排除空氣，通入攜帶劑進(jin)行萃取(qu)(qu)(qu)得提取(qu)(qu)(qu)液，萃取(qu)(qu)(qu)溫度為47.3℃，萃取(qu)(qu)(qu)壓力為23.7MPa，萃取(qu)(qu)(qu)二氧化碳流量(liang)為20-28L/h，攜帶劑為蒸餾水，用量(liang)為390ml/kg，萃取(qu)(qu)(qu)2.5h；
(1.2)脫色(se)：將步驟(1.1)所(suo)得提(ti)取液用1mol/L NaOH調(diao)至pH 7.8，并(bing)加(jia)(jia)入(ru)硅藻土(tu)加(jia)(jia)熱(re)煮沸5min脫色(se)，減壓過濾得濾液，所(suo)加(jia)(jia)入(ru)硅藻土(tu)與提(ti)取液的質(zhi)量比(bi)為1.5％；
(1.3)濃(nong)縮干燥：將步驟(1.2)所得濾(lv)液于75℃水浴條件才減(jian)壓濃(nong)縮至原體積的30％，再加(jia)入4倍體積的95wt％乙醇，攪拌(ban)，在3000r/min條件下(xia)離心10min得沉淀I，沉淀I分別用(yong)無水乙醇和(he)乙醚洗(xi)滌，真空干燥得川貝母(mu)多糖粗品；
(2)川(chuan)貝母(mu)多糖粗品的純化
(2.1)除蛋(dan)白：以質量體(ti)積比1％取(qu)莼菜(cai)多(duo)糖(tang)粗(cu)品及蒸餾水并混(hun)(hun)(hun)合(he)均勻，3000r/min離心(xin)10min除去不溶(rong)物，取(qu)上(shang)清(qing)液(ye)加入1/5體(ti)積的氯(lv)仿和戊醇混(hun)(hun)(hun)合(he)液(ye)，3000r/min離心(xin)10min得上(shang)層清(qing)液(ye)I，所(suo)述(shu)混(hun)(hun)(hun)合(he)液(ye)中氯(lv)仿和戊醇的體(ti)積比為5:1；
(2.2)純(chun)化：向上層清(qing)液I加(jia)質量分數(shu)為2％的十六(liu)烷基氯化吡啶至沉(chen)淀完(wan)全，靜置5h，3000r/min離心10min得(de)沉(chen)淀II，沉(chen)淀II用70℃熱水洗(xi)滌三次，然后向沉(chen)淀II加(jia)入(ru)2mol/L的NaCl溶液在(zai)60℃溫度條件下(xia)解(jie)離4h，并在(zai)3000r/min離心10min得(de)上層清(qing)液II；
(2.3)離子交換層(ceng)析進一步純化：將上層(ceng)清(qing)液II通過DEAE-Sephadex柱吸附，冰水洗(xi)(xi)至澄清(qing)，用0.1mol/LNaCl洗(xi)(xi)脫(tuo)，流速(su)為0.2ml/min，收集洗(xi)(xi)脫(tuo)液；
(2.4)透析(xi)(xi)、濃(nong)縮、干燥(zao)(zao)：將(jiang)步驟(zou)(2.3)所(suo)得(de)(de)洗脫液使用蒸(zheng)餾(liu)水(shui)(shui)透析(xi)(xi)18h，將(jiang)所(suo)得(de)(de)透析(xi)(xi)液在75℃水(shui)(shui)浴條(tiao)件下減壓(ya)濃(nong)縮至(zhi)原體積(ji)(ji)的30％，再加(jia)入4倍體積(ji)(ji)的95wt％乙醇，攪拌，3000r/min離心10min得(de)(de)沉淀III，沉淀III分別用無水(shui)(shui)乙醇和乙醚洗滌，真空干燥(zao)(zao)，得(de)(de)精制川貝母多糖(tang)。
多糖含量的測定
多糖(tang)含量(liang)采(cai)用(yong)(yong)硫酸-苯酚(fen)(fen)法(fa)進(jin)行(xing)檢測。多糖(tang)在濃(nong)硫酸的(de)作(zuo)用(yong)(yong)下，脫水(shui)生(sheng)成糖(tang)醛及其衍生(sheng)物，與(yu)苯酚(fen)(fen)結合(he)后產生(sheng)黃(huang)色(se)物質(zhi)，該物質(zhi)在490nm有最大吸光值，吸光值的(de)大小(xiao)與(yu)多糖(tang)含量(liang)呈正(zheng)比。
(1)葡(pu)萄糖標準曲線(xian)的制作(zuo)：
稱取一定量的葡萄糖于105℃烘干至恒重后，準確稱取0.100g，純水定容至100mL，即得葡萄糖標準儲備液。分別準確吸取0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL儲備液，分別置于100mL容量瓶以純水定容，配制成0，20，40，60，80，100μg/mL待測液。準確吸取1.0mL待測液于試管中，依次加入1mL 6％苯酚，5mL濃硫酸，混勻，室溫靜置30min。另取一只試管，準確吸取1.0mL純水，依次加入1mL6％苯酚，5mL濃硫酸，混勻，室溫靜置30min，作為空白對照。490nm處測吸光值，以吸光度對葡萄糖濃度進行回歸，得到回歸方程y＝0.0111x-0.0098，R2＝0.9661。式中：y為在波(bo)長(chang)490nm處的吸光值(zhi)，x為葡萄糖的濃度.(μg/mL)。
以總糖(tang)(tang)浸出率來評(ping)價多糖(tang)(tang)得(de)率，總糖(tang)(tang)含量按(an)以下(xia)公式計(ji)算：
總糖含量％＝(m’×V×N)/(Vs×m×106)×100％，式中：
m’：標準曲線上查得的葡萄糖含量(liang)，μg；
V：樣(yang)液體積，mL；
N：稀釋倍數；
Vs：測定(ding)時吸取樣液(ye)的體積，mL；
m：樣品的質(zhi)量，g。
將(jiang)川貝母多糖提(ti)取(qu)液(ye)定容(rong)(rong)至250mL容(rong)(rong)量瓶，準(zhun)(zhun)確(que)吸(xi)(xi)取(qu)1.0mL于10mL容(rong)(rong)量瓶中，以(yi)純(chun)水定容(rong)(rong)。混勻(yun)后(hou)準(zhun)(zhun)確(que)吸(xi)(xi)取(qu)1.0mL待(dai)測液(ye)于試管(guan)中，依次(ci)加入1mL新鮮(xian)配制的6％苯酚(fen)，5mL濃(nong)硫(liu)酸(suan)混勻(yun)，室(shi)溫靜置(zhi)30min。另取(qu)一(yi)只試管(guan)，準(zhun)(zhun)確(que)吸(xi)(xi)取(qu)1.0mL純(chun)水，依次(ci)加入1mL6％苯酚(fen)，5ml濃(nong)硫(liu)酸(suan)，混勻(yun)，室(shi)溫靜置(zhi)30min，作為(wei)空白對(dui)照，于490nm處測定吸(xi)(xi)光值。
經(jing)含量測定(ding)，川貝母多糖(tang)提(ti)取率達到(dao)80％，純度(du)達到(dao)90.8％。
本發明采用超臨界CO2萃取新技術(shu)，克(ke)服了常規方法(fa)存在的(de)提取率偏低、純度(du)不高等缺(que)點；季銨鹽(yan)十六烷基氯(lv)化(hua)吡(bi)啶(ding)能與貝母多糖在低離(li)子強(qiang)度(du)的(de)水溶液中沉淀(dian)(dian)出來，當高離(li)子強(qiang)度(du)時，沉淀(dian)(dian)又可以溶解、解離(li)、釋放，純化(hua)效(xiao)果好(hao)；利(li)用DEAE-Sephadex離(li)子交換層析，進一步去除一些不帶電和帶正電荷的(de)雜質，分離(li)純化(hua)效(xiao)果更好(hao)。
最(zui)后說明(ming)(ming)的(de)是，以上優選實施(shi)例僅用以說明(ming)(ming)本發(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)技(ji)術(shu)方案而非限制，盡管通(tong)過上述優選實施(shi)例已經(jing)對(dui)本發(fa)(fa)明(ming)(ming)進行(xing)了(le)詳細的(de)描述，但本領域技(ji)術(shu)人員(yuan)應當理解，可以在形式上和細節上對(dui)其作出各(ge)種各(ge)樣的(de)改變(bian)，而不偏離本發(fa)(fa)明(ming)(ming)權利要求書所限定的(de)范圍。