本發明涉及一種聽力學基礎實驗研究替代方法，特別涉及分離小鼠內耳毛細胞的方法。

背景技術：

鑒于人類內耳毛細胞的特殊解剖位置及數目甚少，應用模型動物內耳毛細胞替代是聽力學研究的基礎。由于成熟的毛細胞不能分裂增殖，建立及完善單個內耳毛細胞的分離方法利于更多更深入的科學實驗研究。

在本發明作出之前，主要是針對豚鼠、沙鼠內耳毛細胞的分離方法研究，而小鼠的基因型研究最透徹，已成為應用最廣泛的模式動物。目前對于耳蝸體積較小技術操作難度高的小鼠內耳毛細胞分離方法尚無系統描述。豚鼠、沙鼠等模式動物體積較大，操作難度相對較小，且先前的研究方法主要為用胰蛋白酶消化后機械吹打基底膜組織分離篩選毛細胞。胰蛋白酶雖為最廣泛的細胞消化劑，但其化學酶作用對感覺上皮細胞(尤其是敏感脆弱的內耳毛細胞)組織損傷大，且機械吹打法定位差，須在多量細胞中篩選查找數目比例極低的毛細胞，耗時長，工作量大，同時對毛細胞機械性損傷大，獲取的細胞數量少，質量低，從而影響研究的可靠性和真實性。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服上述事實已清楚的缺陷，詳細描述分離小鼠內耳毛細胞的方法。

本發明的技術方案是：

分離小鼠內耳毛細胞的方法，其主要技術特征在于步驟如下：

(1)取出小鼠耳蝸去除表面骨質，分離取得耳蝸膜迷路；

(2)去除周邊組織，分離出帶柯替氏器的基底膜；

(3)膠原酶消化作用后顯微分割出內毛細胞區及外毛細胞區，得到小段細胞簇；

(4)用帶緩沖液的玻璃吸管分別吸取分割后的內外毛細胞簇，再吹出于載玻片上，即可獲得離單的內外毛細胞。

本發明的優點和效果在于定位準確，組織損傷小，耗時短，單細胞活性質量高，篩選單細胞工作量大大減少，工作效率提高。

附圖說明

圖1——本發明中小鼠耳蝸示例圖。

圖2——本發明中剝除頂轉骨壁后耳蝸示例圖。

圖3——本發明中耳蝸膜迷路示例圖。

圖4——本發明中基底膜示例圖。

圖5——本發明中顯微分割后得一排內毛細胞示意圖。

圖6——本發明中離單的內外毛細胞(ihc：內毛細胞，ohc：外毛細胞)。

具體實施方式

本發明的技術思路是：

本發明結合顯微切割和膠原酶消化共分離獲取更多更高質量的小鼠內耳毛細胞。相較先前的分離方法克服了上述耗時長，數量質量低的諸多缺陷。本發明 的優點和效果在于：應用顯微細絲行顯微分割定位明確，分離細胞個體精準，不需在大量細胞中篩選查找，機械損傷小；同時膠原酶主要作用于細胞間膠原等結締組織，消化分離組織損傷小，對作用于耳蝸基底膜消化分離單個內耳毛細胞更有針對性，更好地保持了單個細胞的活性，保證樣品的純度，更利于進行可靠的實驗研究。

下面具體說明本發明。

本發明的技術步驟如下：

一、以c57bl/6小鼠為例，深度麻醉后斷頸，剝離外耳道及聽泡，取出帶前庭底座的耳蝸；

二、去除耳蝸頂后側骨壁后，完整剝除耳蝸外層骨壁，分離取得耳蝸膜迷路；

三、去除螺旋韌帶、血管紋、蓋膜等周邊組織，分離出帶柯替氏器的基底膜；

四、37℃預熱iv型膠原酶消化作用后顯微細絲分割出一排內毛細胞及三排外毛細胞，使成小段細胞簇；

五、用尖端直徑約50um的玻璃吸管，先吸入一段緩沖液后，再分別吸取小段內外毛細胞簇，再吹出于載玻片上，即可獲得離單的內外毛細胞。

內耳毛細胞是聽力學實驗研究的主要對象之一，離體的毛細胞只能培養幾天不能傳代。故而有效地分離內耳毛細胞技術是進行聽力學相關機制實驗研究的基礎。豚鼠、沙鼠等耳蝸體積相對較大，毛細胞分離容易方便，但基因相關分子機制研究不透徹。小鼠是目前應用最廣泛最普遍的模式動物，許多人類疾病動物模型都是依賴小鼠健全的基因序列建立的，同樣越來越多的聽力學研究也有賴于小鼠作為動物模型。有效分離一定數目且活性良好的內耳毛細胞是有效進行形態學觀察研究及分子生物學研究的基礎。

本發明旨在介紹一種結合顯微切割和膠原酶消化共分離，更快獲取更多更優質的小鼠內耳毛細胞的方法。

以2月齡c57bl/6小鼠為例(不分性別)，斷頸后剪開耳廓皮膚，順外耳道挑除聽泡，取出耳蝸，如圖1為帶前庭底座的右側小鼠耳蝸。

低溫(冰上)等滲緩沖液中體式解剖顯微鏡下去除耳蝸頂后側及頂轉薄層骨壁，得如附圖2中去除局部骨壁后的耳蝸，其頂轉血管紋螺旋韌帶暴露清晰可見。依此法，由耳蝸頂轉至底轉剝除耳蝸表面骨壁，即可得如圖3的去除外周骨質耳蝸膜迷路，去除螺旋韌帶、血管紋、蓋膜等周邊組織，沿蝸頂螺旋向下，分段分離出基底膜，如附圖4中即為頂轉帶柯替氏器(主要包括一排內毛細胞及三排外毛細胞)的基底膜。將基底膜平鋪于小平皿(直徑為3.5cm)上，滴加少量預熱于37℃的iv型膠原酶(1mg/ml)后，37℃孵育2-4分鐘后在倒置相差顯微鏡下以顯微細絲(直徑為30μm的不銹鋼金屬絲)分別分割內外毛細胞區域。附圖5為顯微分割后的一排內毛細胞。此顯微分割步驟為該技術之關鍵，也是此技術相較于先前方法大大改進之處，先前酶消化后整體吹打基底膜的方法，操作盲目定位差，組織損傷大，且之后需篩選全部打散的細胞簇，篩選效率大大降低，耗費時間長，同時不利于保存細胞活性，篩選出的單細胞質量低。本發明中于倒置相差顯微鏡直視下行顯微分割操作細微精準，顯微金屬細絲直徑小，損傷小，僅需于切割區域細胞中進行篩選，耗時短，能夠達到提高分離效率，減少分離損傷，細胞活性保存好，取得更多量更高質量的單個毛細胞的目的。

顯微細絲分割后，再用連接微型濾器(過濾直徑為0.22μm)的尖端直徑約50μm長約5cm的玻璃吸管，先吸入一段緩沖液后，分別吸取分割后的內外毛細胞簇，再吹出于載玻片上，即可獲得如圖6中離單的內外毛細胞，內外毛細胞頂 端表皮板平且厚，均有短纖毛附著，內毛細胞形似燒瓶狀，核位于中央；外毛細胞呈圓柱狀，核位于胞體底端。微型濾器的連接可增加吸取細胞時的阻力，利于觀察吸取轉移單個細胞。

該分離法即應用膠原酶消化后結合了顯微細絲分割大大優于胰蛋白酶消化后細針吹打分離方法。胰蛋白酶是目前應用最廣泛的消化細胞間質用于細胞傳代培養的消化劑，然而其適用于消化細胞間質較少的軟組織。而膠原酶對膠原有很強的消化作用，僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大，適用于消化分離上皮細胞，對原代細胞本身損傷小。內耳毛細胞屬于感覺上皮細胞，相較而言，膠原酶更適用于消化分離毛細胞周圍的纖維結締組織，對毛細胞本身損傷小。同時先前的分離方法中細針盲目吹打整塊組織易損傷毛細胞且丟失細胞多，篩選率低，工作量大。

本發明結合顯微細絲分割膠原酶消化后的基底膜組織，倒置相差顯微鏡下行顯微細絲原位分區分割內外毛細胞，定位明確，細胞損傷小，再以連接微型濾器玻璃吸管吹吸得到離單的毛細胞，此法細胞丟失少，篩選獲得量多，大大提高了工作效率。此方法能有效地分離小鼠內耳毛細胞成單個，被分離出的內外毛細胞可用于單個或單種細胞基因或蛋白水平等特異性分子機制研究及基本的形態學觀察。除此之外，由于本發明方法耗時短，單個細胞活性保存好。由于毛細胞的特殊屬性，分離出的單個毛細胞可被用來觀察不同的環境刺激對毛細胞形態的影響。如不同滲透壓溶液刺激前后觀察細胞形態變化來檢測細胞骨架相關蛋白的功能(已應用一個細胞骨架相關蛋白毛細胞特異性敲除小鼠來證實)。此分離方法的良好應用使得更多內耳毛細胞單細胞相關研究方法得以建立起來，促進了聽力學研究的深入及研究領域的開拓。

本發明所創新的方法形成一個研究領域內的新型模型和規制，即建立了一種分離小鼠內耳毛細胞的模型，按照此模型規制有利于研究活動的進行。