專利名稱：蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法
技術領域：
本發明是一種蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，屬化工技術領域。
背景技術：
蜂花粉含有一定量的蛋白質、游離氨基酸、多種活性酶、多種維生素、核酸、礦物質、胡蘿卜素、生長素、磷脂、糖類等營養成分，是一種無毒無副作用的純天然高級綠色食品，被人們譽為營養素的濃縮體。現代研究證明，蜂花粉能夠提成高機體T淋巴細胞(T淋巴細胞來源于胚肝或骨髓的原T細胞，在胸腺微環境中分化、發育，成熟后在外周血定居于淋巴組織；T細胞可介導細胞免疫應答，并輔助機體針對T細胞依賴性抗原產生體液免疫能力。)和巨噬細胞，具有提高血清免疫蛋白G (蛋白G具有高含量的人體免疫球蛋白，占總血清免疫球蛋白的80%左右，分子質量150kDa，是再次抗體應答中所產生的主要免疫球蛋 白。)功能，增強人體機體免疫力，從而起到抑制腫瘤和抗癌作用，并且能夠有效阻止放化療損傷，保護人體機體。蜂花粉的生物活性與其含有豐富的多糖有著密切的關系，蜂花粉中的糖類主要是葡萄糖和果糖，還有雙糖(麥芽糖和蔗糖)和多糖(淀粉、纖維素和果膠物質)。來源不同的蜂花粉中碳水化合物的含量也有差別，正常情況下，干蜂花粉所含碳水化合物中，平均值葡萄糖占9. 9%、果糖占19%、總糖為31%、半纖維素為7. 2%、纖維素為0. 52%，其它成分所占比例不盡相同，不同植物品種對其含量有著直接影響。蜂花粉中含豐富的多糖，研究表明，從天然產物中分離出的多糖往往是一種免疫調節劑，它能激活免疫細胞，提高機體免疫功能，而對正常細胞沒有毒和副作用。多糖作為免疫治療藥物正越來越受到重視，已經成為新藥研究的熱點之一；本發明的技術設計，是專用于蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法。蜂花粉多糖的提取現有技術多糖是極性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇。現有技術常見的多糖提取方法有水提法、酸提法、堿提法、酶提法、超聲提取法、微波提取法，目前研究中通常采用的方法是水提取法，因為這種方法具有不需要特殊設備、成本低等優點，但現有技術所述的水提法，未經酶解破壁，蜂花粉與水混合加熱，細胞壁未完全破壞，提取效率低且費時；近幾年來引入超聲、微波提取法，提高了花粉多糖的提取效率，但是這些方法目前還僅限于實驗室研究。而酸提法、堿提法會引起多糖的水解，破壞多糖的立體結構和活性，而且對于酸堿的濃度確定也比較困難。因此這兩種方法一般不應用于花粉多糖的提取。現有技術蜂花粉多糖的脫蛋白方法有Sevage脫蛋白法、NaOH脫蛋白法、TCA脫蛋白法和雙氧水脫蛋白法，其方法都是一次脫蛋白，脫蛋白后的水茚三酮反應均呈陽性，結果表明多糖中仍有蛋白質殘留，證明現有技術取得的蜂花粉多糖含有蛋白質。專利號為20名稱為五味子藥渣中活性成分多糖的制備方法和專利號為20名稱為一種石斛多糖的分離純化方法的兩個發明中，都采用了Sevage脫蛋白法，其缺點是都需要用Sevage脫蛋白法重復脫蛋白5次左右，才能得到純度較高的多糖，其操作步驟較繁瑣。

發明內容
本發明的目的在于提供一種多糖提取效率高、脫蛋白效果好的蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是該蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法包括以下步驟
a、將蜂花粉干燥、除雜和篩選后進行機械粉碎，粉碎后過篩，形成蜂花粉末；
b、在蜂花粉末中加入0.1% - 1%質量的纖維素酶，再加入6 — 9倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液；
C、將所述纖維素酶蜂花粉末混合液加熱至42度恒溫90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液；
d、將所述破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液加熱至82度恒溫，并用400W超聲功率浸提，每次2. 5小時，浸提2次；
e、將浸提后的蜂花粉水溶液與30%- 40%質量的純食用乙醇混合，靜置24小時后分離將下層含蜂花粉多糖物質進行脫水、真空冷凍、干燥后形成蜂花粉粗多糖；
f、在蜂花粉粗多糖中加入30%-40%質量的高氯酸水溶液，充分混合后經離心、過慮除去蛋白質沉淀，取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
g、將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纖維素柱層析，依次用質量濃度為3% - 6%的Na2CO3溶液和質量濃度為1% - 3%的NaOH溶液進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
h、在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%- 9%質量的十六烷基三甲基溴化銨(簡稱CTAB)，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀；
i、將蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。作為優選，所述的蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法包括以下步驟
a、將蜂花粉干燥、除雜和篩選后進行機械粉碎，粉碎后過篩，形成蜂花粉末；
b、在蜂花粉末中加入0.5%質量的纖維素酶，再加入9倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液；
C、將所述纖維素酶蜂花粉末混合液加熱至42度恒溫90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液；
d、將所述破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液加熱至82度恒溫，并用400W超聲功率浸提，每次2. 5小時，浸提2次；
e、將浸提后的蜂花粉水溶液與1/3質量的純食用乙醇混合，靜置24小時后分離將下層含蜂花粉多糖物質進行脫水、真空冷凍、干燥后形成蜂花粉粗多糖；
f、在蜂花粉粗多糖中加入1/3質量的高氯酸水溶液，充分混合后經離心、過慮除去蛋白質沉淀，取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
g、將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纖維素柱層析，依次用質量濃度為5%的Na2CO3溶液和質量濃度為2%的NaOH溶液進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
h、在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%質量的CTAB，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀；
i、將蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。本發明所述的i步驟中包括以下步驟
a、將含酸性多糖沉淀用水溶解后離心過濾，得到蜂花粉酸性多糖水溶液；將含中性多糖沉淀用水溶解后離心過濾，得到蜂花粉中性多糖水溶液；
b、將蜂花粉酸性多糖水溶液和蜂花粉中性多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。
做為優選，本發明所述的i步驟中包括以下步驟
a、將含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，離心過濾得到蜂花粉多糖水溶液；
b、將蜂花粉多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。本發明二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中含有蜂花粉酸性多糖和蜂花粉中性多糖。CTAB在低離子強度的溶液里，能沉淀核酸和酸性多聚糖，而蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里；在高離子強度的溶液里，與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。CTAB復合物沉淀用水溶解后多糖類物質可重新溶解到水中，而蛋白質等其他大分子物質仍不溶解。利用上述的這些特性對二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液進行分離純化。本發明和現有技術相比具有以下優點
I、本發明應用酶解破壁，其特征是蜂花粉與水和纖維素酶混合，在纖維素酶的作用下，使蜂花粉細胞壁得到酶解完全破壞融合在水中，形成破壁后呈糊狀的蜂花粉的水溶液。而現有技術所述的水提法，未經酶解破壁，蜂花粉與水混合加熱，細胞壁未完全破壞。所以本發明提取的多糖比與現有技術相比，提取多糖比例提高66. 03%，多糖得率高達18. 54mg /g，比現有技術提取法提高了 2. 02倍；
2、本發明形成粗多糖后進行三次脫蛋白純化多糖，取得的蜂花粉多糖水相對茚三酮反應均呈陰性，無蛋白質殘留，實現本發明取得無雜質高純度的蜂花粉多糖。現有技術脫蛋白方法有Sevage脫蛋白法、NaOH脫蛋白法、TCA脫蛋白法和雙氧水脫蛋白法，其方法都是一次脫蛋白，脫蛋白后的水茚三酮反應均呈陽性，結果表明多糖中仍有蛋白質殘留，證明現有技術取得的蜂花粉多糖含有蛋白質。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。實施例I :本實施例由以下步驟組成
1、首先將蜂花粉進行干燥、除雜和篩選，機械粉碎后過篩，形成蜂花粉末；
2、在蜂花粉末中加入0.5%質量的纖維素酶，再加入9倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液；3、將纖維素酶蜂花粉末混合液進行加熱，溫度控制42度，酶分解反應時間90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液；
4、將破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液進行加熱，溫度控制82度，超聲功率400W，浸提2次，每次2. 5小時，呈糊狀的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；
5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入有機溶劑純食用乙醇(蜂花粉水溶液與純食用乙醇混合質量比為3 1)脫水，混合后形成分層，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下層，靜置分層時間控制24小時，分離后取下層物質真空冷凍，干燥后形成蜂花粉粗多糖；
6、蜂花粉粗多糖在常溫中進行三次脫蛋白，其方法是
一次脫蛋白是蜂花粉粗多糖與高氯酸水溶液混合(蜂花粉粗多糖與高氯酸水溶液混合質量比為3 :1)，強酸使蛋白質變性形成沉淀，通過離心除去蛋白質；取濾液得到一次脫蛋 白蜂花粉粗多糖水溶液；
二次脫蛋白是將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纖維素柱層析(柱層析是根據蛋白質混合物中不同蛋白組，在流動中經過多次反復分配，將不同蛋白組逐一分離)，依次用濃度為5%的Na2COjP濃度為2%的NaOH進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
三次脫蛋白是在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%質量的CTAB，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀；
7、將含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，離心過濾得到蜂花粉多糖水溶液；
8、將蜂花粉多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。實施例2 :本實施例由以下步驟組成
1、首先將蜂花粉進行干燥、除雜和篩選，機械粉碎后過篩，形成蜂花粉末；
2、在蜂花粉末中加入0.1%質量的纖維素酶，再加入6倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液；
3、將纖維素酶蜂花粉末混合液進行加熱，溫度控制42度，酶分解反應時間90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液；
4、將破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液進行加熱，溫度控制82度，超聲功率400W，浸提2次，每次2. 5小時，呈糊狀的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；
5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入30%質量的有機溶劑純食用乙醇脫水，混合后形成分層，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下層，靜置分層時間控制24小時，分離后取下層物質真空冷凍，干燥后形成蜂花粉粗多糖；
6、蜂花粉粗多糖在常溫中進行三次脫蛋白，其方法是
一次脫蛋白是蜂花粉粗多糖與30%質量的高氯酸水溶液混合，強酸使蛋白質變性形成沉淀，通過離心除去蛋白質；取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
二次脫蛋白是將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纖維素柱層析(柱層析是根據蛋白質混合物中不同蛋白組，在流動中經過多次反復分配，將不同蛋白組逐一分離)，依次用濃度為3%的Na2COjP濃度為1%的NaOH進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；三次脫蛋白是在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%質量的CTAB，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀；
7、將含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，離心過濾得到蜂花粉多糖水溶液；
8、將蜂花粉多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。實施例3 :本實施例由以下步驟組成 1、首先將蜂花粉進行干燥、除雜和篩選，機械粉碎后過篩，形成蜂花粉末；
2、在蜂花粉末中加入1%質量的纖維素酶，再加入8倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液；
3、將纖維素酶蜂花粉末混合液進行加熱，溫度控制42度，酶分解反應時間90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液；
4、將破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液進行加熱，溫度控制82度，超聲功率400W，浸提2次，每次2. 5小時，呈糊狀的蜂花粉水溶液中的多糖在水溶液中完全分解；
5、在浸提后的蜂花粉水溶液中加入40%質量的有機溶劑純食用乙醇脫水，混合后形成分層，由于蜂花粉多糖易溶于水不溶于乙醇，使多糖重新析出到溶液的下層，靜置分層時間控制24小時，分離后取下層物質真空冷凍，干燥后形成蜂花粉粗多糖；
6、蜂花粉粗多糖在常溫中進行三次脫蛋白，其方法是
一次脫蛋白是蜂花粉粗多糖與40%質量的高氯酸水溶液混合，強酸使蛋白質變性形成沉淀，通過離心除去蛋白質；取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
二次脫蛋白是將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中用二乙胺基乙基纖維素柱層析(柱層析是根據蛋白質混合物中不同蛋白組，在流動中經過多次反復分配，將不同蛋白組逐一分離)，依次用濃度為6%的Na2CO3和濃度為3%的NaOH進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液；
三次脫蛋白是在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入8%質量的CTAB，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀；
7、將含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，離心過濾得到蜂花粉多糖水溶液；
8、將蜂花粉多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。本發明二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中含有蜂花粉酸性多糖和蜂花粉中性多糖。CTAB在低離子強度的溶液里，能沉淀核酸和酸性多聚糖，而蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液里；在高離子強度的溶液里，與蛋白質和大多數酸性多聚糖以外的多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。CTAB復合物沉淀用水溶解后多糖類物質可重新溶解到水中，而蛋白質等其他大分子物質仍不溶解。利用上述的這些特性對二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液進行分離純化。本發明所述實施例中發實施例I效果最佳，本發明提取多糖比例提高66. 03%，多糖得率高達18. 54mg / g，比現有技術提取法提高了 2. 02倍；取得的蜂花粉多糖水相對茚三酮反應均呈陰性，無蛋白質殘留，取得的蜂花粉多糖無雜質高純度。此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其配比、工藝所取名稱等可以不同。凡依本發明專利構思所述的構造、特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發明專利的保護范圍內。本發明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發明的結構或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發明的保護范圍。 雖然本發明已以實施例公開如上，但其并非用以限定本發明的保護范圍，任何熟悉該項技術的技術人員，在不脫離本發明的構思和范圍內所作的更動與潤飾，均應屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1. 一種蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，其特征在于包含以下步驟 a、將蜂花粉干燥、除雜和篩選后進行機械粉碎，粉碎后過篩，形成蜂花粉末； b、在蜂花粉末中加入0.1% - 1%質量的纖維素酶，再加入6 — 9倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液； C、將所述纖維素酶蜂花粉末混合液加熱至42度恒溫90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液； d、將所述破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液加熱至82度恒溫，并用400W超聲功率浸提，每次2. 5小時，浸提2次； e、將浸提后的蜂花粉水溶液與30%- 40%質量的純食用乙醇混合，靜置24小時后分離將下層含蜂花粉多糖物質進行脫水、真空冷凍、干燥后形成蜂花粉粗多糖； f、在蜂花粉粗多糖中加入30%-40%質量的高氯酸水溶液，充分混合后經離心、過慮除去蛋白質沉淀，取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液； g、將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纖維素柱層析，依次用質量濃度為3% - 6%的Na2CO3溶液和質量濃度為1% - 3%的NaOH溶液進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液； h、在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入6%- 9%質量的十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀； i、將蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。
2.根據權利要求I所述的蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，其特征在于 a、將蜂花粉干燥、除雜和篩選后進行機械粉碎，粉碎后過篩，形成蜂花粉末； b、在蜂花粉末中加入0.5%質量的纖維素酶，再加入9倍質量的水，混合形成纖維素酶蜂花粉末混合液； C、將所述纖維素酶蜂花粉末混合液加熱至42度恒溫90分鐘；形成破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液； d、將所述破壁后呈糊狀的蜂花粉水溶液加熱至82度恒溫，并用400W超聲功率浸提，每次2. 5小時，浸提2次； e、將浸提后的蜂花粉水溶液與1/3質量的純食用乙醇混合，靜置24小時后分離將下層含蜂花粉多糖物質進行脫水、真空冷凍、干燥后形成蜂花粉粗多糖； f、在蜂花粉粗多糖中加入1/3質量的高氯酸水溶液，充分混合后經離心、過慮除去蛋白質沉淀，取濾液得到一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液； g、將一次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液用二乙胺基乙基纖維素柱層析，依次用質量濃度為5%的Na2C03溶液和質量濃度為2%的NaOH溶液進行洗脫，得到二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液； h、在二次脫蛋白蜂花粉粗多糖水溶液中加入9%質量的CTAB，充分混勻后離心，取含酸性多糖沉淀；取濾液加入離子強度調節劑后離心過濾，取含中性多糖沉淀； i、將蜂花粉酸性多糖沉淀和蜂花粉中性多糖沉淀用水溶解，然后脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。
3.根據權利要求I或2所述的蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，其特征在于所述的i步驟中包括以下步驟 a、將含酸性多糖沉淀用水溶解后離心過濾得到蜂花粉酸性多糖水溶液；將含中性多糖沉淀用水溶解后離心過濾得到蜂花粉中性多糖水溶液； b、將蜂花粉酸性多糖水溶液和蜂花粉中性多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。
4.根據權利要求I或2所述的蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，其特征在于其特征在于所述的i步驟中包括以下步驟 a、將含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀混合后用水溶解，離心過濾得到蜂花粉多糖水溶液； b、將蜂花粉多糖水溶液進行脫水、真空冷凍、干燥后得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。
全文摘要
本發明是一種蜂花粉多糖酶解破壁結合熱水超聲浸提方法，包括以下步驟將蜂花粉干燥、除雜、粉碎、過篩；酶解破壁；加熱超聲浸提；脫水；高氯酸除蛋白；二乙胺基乙基纖維素柱層析，洗脫；CTAB分離含酸性多糖沉淀和含中性多糖沉淀；溶解多糖深沉后經脫水、真空冷凍、干燥得到高純度無雜質的蜂花粉多糖。本發明提取多糖比例提高66.03%，多糖得率高達18.54mg／g，比現有技術提取法提高了2.02倍；取得的蜂花粉多糖水相對茚三酮反應均呈陰性，無蛋白質殘留,取得的蜂花粉多糖無雜質高純度。
文檔編號C08B37/00GK102746413SQ20121024443
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者袁文明 申請人:桐廬興源保健品有限公司