專利名稱：土壤桿菌ZX09,用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β-葡聚糖及其制備方法及在降低血糖上的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物及微生物胞外多糖技術領域，特別是一種土壤桿菌 Agrobacteriumsp. ΖΧ09,該菌生產的新型水溶性β -葡聚糖分子及其制備方法和在降低血 糖上的應用。
背景技術：
葡聚糖廣泛地分布于真菌、細菌和植物體內，目前藥用、食用菌β-葡聚糖主 要來源于食用、藥用擔子真菌和子囊酵母菌的細胞壁，谷物中的葡聚糖主要存在于燕 麥和大麥胚乳的細胞壁中，從這些物質中提取葡聚糖的工藝較復雜，且產量較低。葡聚糖不僅在各種生物體內發揮多種生物學活性，而且在各種生物間的相 互影響過程中也具有多種功能，是高效的生物反應調節因子(BRM)。據報道，β-葡聚糖 具有抗腫瘤、抗氧化等功能，長時間食用含葡聚糖的食物能夠降低高膽固醇的人血 液中的膽固醇，燕麥中提取的β-葡聚糖可降低糖尿病人的餐后血糖(Jenkins，A. L.， D. J. A. Jenkins, U. Zdravkovic, P. Wiirsch and V. Vuksan. 2002. Depression of the glycemic index byhigh levels of β -glucan fiber in two functional foods tested in type 2diabetes. EuropeanJournal of Clinical Nutrition 56,622-628)。然而，β-葡 聚糖功效的發揮需要一定溶解度、空間結構和合適的分子量的支撐。很多葡聚糖的水 溶性較低，例如，可得然膠是由土壤桿菌或產堿桿菌產生的一種水不溶的凝膠多糖型葡聚 糖，它由D-葡萄糖殘基經β-葡萄糖苷鍵在Cl，C3線性連接而成(Kim，Μ. K.，K. Ε. Ryu, W. A. Choi, Y. H. Rhee,andl. Y. Lee. 2003. Enhanced production of (1 — 3)-β-D-glucan by a mutant strain ofAgrobacterium species. Biochem. Eng. J. 16 163-168)；香對 腫瘤有抑制作用，但它在水中的溶解度也不高。而非水溶性的葡聚糖進入人體后很難被直 接吸收，使其應用范圍收到極大的限制。為解決這一難題，很多學者研究了 β “葡聚糖的衍生化來提高它的水溶性和生 物活性，如在對從虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)中提取的β-葡聚糖進行硫酸化 前后抗腫瘤活性的變化研究中，發現硫酸化后多糖溶解度增大，同時抗腫瘤能力也相應 的增力口(Lina Zhang，Mei Zhang，Jing Dong，Ji Guo, Yinyin Song，Peter Chi keung Cheung. 2001. Chemical structure and chain conformation of the water-insoluble glucan isolated fromPleurotus tuber-regium. Biopolymers 59 :457_464·張俐娜，張 玫，張志強，黃榮春。虎奶菇葡聚糖硫酸酯在水溶液中的鏈構象及構效關系。2003年全國高 分子學術論文報告會)。另外，在中國專利(CN:1583802A)中對非水溶性酵母β -(1，3)-葡 聚糖通過甲酸降解，得到不同分子量的可溶于水的β_(1，3)_葡聚糖。但所有這些解決方 法都增加了獲得所需葡聚糖的難度，使制備成本大大提高，限制了在生產領域中的大 規模使用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種生產水溶性β -葡聚糖的土壤桿菌(Agrobacterium sp. ZX09)。本發明的另一目的是提供一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性高粘度β -葡聚糖 及其制備方法。本發明的目的還在于提供一種用土壤桿菌ΖΧ09生產的水溶性高粘度β -葡聚糖 在降低血糖上的應用。實現本發明目的的技術解決方案為一種土壤桿菌ΖΧ09，在山東東營的鹽土中分 離得到菌株，此菌株為土壤桿菌屬菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日 在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NO :M2010020o一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β -葡聚糖，結構通式如下所示— {3) -beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-a Ipha-D-G Iup- (1 — 3)_alpha_D_Glup_(l}n —上述結構中的η為100 200。一種用土壤桿菌ΖΧ09生產的水溶性β -葡聚糖的制備方法，步驟如下(1)配置培養液將 NaH2PO4 0. 5%。-2. 5%。，KNO3 2%。-4%。，CaCl2 0. 07%。-0. 15%, MgCl2 0. 2 %0 -0. 5 %o, FeSO4 · 7Η20 0. 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4 0. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%,NaCl 0_7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，ρΗ 為 5-11，以上鹽濃度為 質量比；(2)將培養液加熱110-121 滅菌15-30分鐘，然后冷卻；(3)向步驟(2)中冷卻至30-37°C的滅菌后的培養液內加入平皿菌落液，在28°C 30°C發酵24-48h形成種子培養液；(4)向步驟(2)中冷卻至30-37°C的滅菌后的培養液內加入步驟(3)中獲得的種 子培養液，在28°C 30°C發酵48 72h ；(5)向第(4)步得到的發酵液內注入超過發酵液兩倍體積的乙醇、丙酮或異戊醇， 沉淀得到粗多糖；(6)對粗多糖去蛋白后得到純品。一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β -葡聚糖的應用，將利用土壤桿菌ΖΧ09生 產的葡聚糖應用于降低血糖。本發明與現有技術相比，其顯著優點(1)菌株新穎，性質獨特，可耐鹽生長，生長 過程中不分泌色素；(2)菌種的培養操作簡便，工藝簡單，培養基為全合成培養基，成份明 確，成本低，適宜于工業化生產；(3)所得的葡聚糖為新結構多糖化合物；(4) β-葡聚 糖提取方法簡便，所得的葡聚糖可直接溶于冷水；(5)對小鼠喂食混有淀粉的多糖，能 有效控制餐后血糖的升高。下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。


圖1是菌株的平板菌落、顯微照片和耐鹽生長情況。圖2是葡聚糖組分測定的氣相色譜圖。
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圖3是葡聚糖的高碘酸氧化結果。圖4是葡聚糖的紅外光譜。圖5是葡聚糖的核磁共振譜。圖6是小鼠喂養多糖后的血糖變化圖。土壤桿菌的菌株已于2010年1月21日在中國典型培養物保藏中心保存(CCTCC)， 保藏單位的地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M2010020，其生物材料的分類命名為(Agrobacterium sp. ZX09)。
具體實施例方式本發明土壤桿菌(Agrobacterium sp. ZX09)是在山東東營的鹽土中分離得到。該 菌株具有以下特點a.形態特征在無機鹽瓊脂平板培養基上28 °C培養本菌株3_5天后觀察，菌落呈 白色、圓形，表面光滑，邊緣整齊，菌株分泌大量的胞外多糖。b.生理生化特征能有效還原硝酸鹽，不能降解纖維素，不分泌色素。能夠在7% 的NaCl發酵液中生長，在含2% NaCl的發酵液中生長速度最快。以蔗糖或乳糖為碳源能很 好地生長，可疑利用碳源為D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、或D-木糖，不能利用碳源為麥芽 糖。發酵48小時后的發酵液最高粘度可達到20000mPa 's(NDJ-l RotationalViscometer, Rotor為3，RPM為6，上海天平儀器廠)。圖1中，A為平板培養基上的菌落，B為細菌的顯 微鏡照片，C為菌株在不同鹽濃度的培養液中震蕩培養后的相對生長率。c. 土壤桿菌的16S DNA序列見序列表。d.此菌株為土壤桿菌屬菌株。本發明從土壤桿菌ZX09的菌株中提取出大分子的胞外水溶性β-葡聚糖，結構通 式如下所示— {3) -beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-a Ipha-D-G Iup- (1 — 3)_alpha_D_Glup_(l}n —上述結構中的η為100 200。上述β-葡聚糖的特性如下a.多糖組分為單一葡萄糖。圖2為氣相色譜圖。同一組分在同一位置出峰。A圖 為水解后的ZX09產多糖的出峰情況，單一的峰說明多糖由單一組分組成。B圖中水解多糖 與甘露糖混合后出現了兩個的峰，而C圖中水解多糖與葡萄糖混合后只有一個峰，這就說 明了組成多糖的單一組分就是葡萄糖。該多糖為葡聚糖。b.高碘酸不能氧化多糖，見圖3。葡聚糖有不同的連接方式。在與高碘酸鹽反應 時，以1 — 2或1 — 4位鍵合的糖基，平均每個糖基消耗一分子高碘酸；以1 — 6位鍵合的 糖基或非還原末端基，消耗兩分子高碘酸，而1 — 3位鍵合的糖基，不消耗高碘酸。可溶性 淀粉是以1 — 4位鍵合的葡聚糖，以可溶性淀粉作參照，對ZX09生產的葡聚糖進行高碘酸 氧化，發現可溶性淀粉消耗了高碘酸鹽，而ZX09生產的葡聚糖不消耗高碘酸鹽，這說明該 葡聚糖的糖基均以1 — 3位鍵合。c.多糖的紅外光譜見圖4，該高聚物并無衍生基團存在。d.多糖的核磁共振譜見圖5。1H NMR中，有兩個信號，表明葡聚糖中存在alpha構象(δ 5. 1-5. 3ppm)和 beta 構象(δ 4. 92-4. 96ppm) ； 13C NMR 譜中，低場 δ 106. 4，105. 75， 105. 69，105. 51，105. 37，105. 31，105. 14，99. 59，99. Olppm處的峰，表征了 C-I 的beta構象， 而高場δ 98，96ppm處的峰，表征了 C-I的alpha構象本發明利用土壤桿菌ZX09生產水溶性β -葡聚糖，其步驟包括如下a.配置培養液將 NaH2PO4 0. 5% -2. 5%。，KNO3 2% -4%。，CaCl2 0. 07% -0. 15%, MgCl2O. 2 % -0. 5 %o, FeSO4 · 7H20 0. 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4 0. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%,NaCl 0_7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，pH 5-11,以上鹽濃度為質量比。b.將培養液加熱110_121°C滅菌15-30分鐘，然后冷卻；c.向步驟b中冷卻至30_37°C的培養液內加入平皿菌落液；d.在28°C 30°C發酵步驟c中已接種的培養液24_48h形成種子培養液；e.向步驟b中冷卻至30-37°C的培養液內加入種子培養液；f.將步驟e中已接種的培養液在28°C 30°C發酵48 72h ；h.向步驟f中獲得的發酵液內注入超過發酵液兩倍體積的乙醇、丙酮或異戊醇， 得到粗多糖；i.得到的粗多糖去蛋白后得到純品。通過上述方法制備的葡聚糖的水溶液有很高的粘度，使其具有廣泛的應用價 值。利用土壤桿菌ΖΧ09生產的葡聚糖為活性成分的制劑在食品、飲料以及降低餐后血 糖水平上的應用。如該葡聚糖或葡聚糖與淀粉混合后，對禁食后的小鼠進行灌喂，檢測 不同時間的餐后血糖值。圖6中只喂食淀粉的小鼠餐后血糖值明顯高于喂食含有本發明 β-葡聚糖的食物的小鼠。實施例1配置培養液，NaH2PO40. 5g, KNO3 2g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 005g,MnSO4 0. OOlgjZnCl2 0. 005g，蔗糖 20g，H2OlOOOmL,pH 5.0。將培養液加熱 121°C滅 菌15分鐘，冷卻至30°C接入平皿菌落液200μ ，28 培養24h，為種子液。向滅過菌(121°C 滅菌15分鐘)并冷卻至30°C的培養液中加入2%的種子培養液，28°C發酵48h。在該發酵 液中加入兩倍體積的乙醇，得到β-葡聚糖粗品。禁食15小時的小鼠，直接喂食多糖ZOOmg/kg—1或喂食混有淀粉的多糖200mg/ kg_\能有效控制餐后血糖的上升。實施例2配置培養液，NaH2PO40. 5g, KNO3 2g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g, NaCl 20g，蔗糖 20g，H2OlOOOmL, pH 7.2。將培養液 加熱121°C滅菌15分鐘，冷卻至30°C接入平皿菌落液100μ L，28°C培養24h，為種子液。向 滅過菌(121°C滅菌15分鐘)并冷卻至30°C的培養液中加入10%的種子培養液，28°C發酵 72h。向發酵液內加入兩倍體積的95%乙醇，得沉淀即為粗多糖，將沉淀取出，重新溶解于水 中，利用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍體積乙醇，沉淀多糖，并將該沉 淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液經過DEAE-32纖維素和瓊脂糖凝膠S印harose CL-4B 分離后，乙醇沉淀，干燥，即得純化的多糖。實施例3
配置培養液，NaH2PO41. 0g, KNO3 2. 5g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g,NaCl 20g，蔗糖 30g，H2OlOOOmL, pH 7. 2，將培養液加 熱121 °C滅菌15分鐘，冷卻至30°C接入平皿菌落液200 μ L，30 V培養24h，為種子液。向滅 過菌(121°C滅菌15分鐘)并冷卻至30°C的培養液中加入4%的種子培養液，28°C發酵48h。 向發酵液內加入兩倍體積的95%乙醇，得沉淀即為粗品，將沉淀取出，重新溶解于水中，利 用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍體積乙醇，沉淀多糖，并將該沉淀再 次溶解于水。得到的多糖水溶液經過DEAE-32纖維素和瓊脂糖凝膠S印harose CL-4B分離 后，乙醇沉淀，干燥，即得純化的多糖。實施例4配置培養液，NaH2PO41. 5g, KNO3 3g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 4g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g,NaCl 20g，蔗糖 40g，H2OlOOOmL, pHll，將培養液加熱 121°C滅菌15分鐘，冷卻至30°C接入平皿菌落液100 μ L，28°C培養24h，為種子液。向滅過 菌(121°C滅菌15分鐘)并冷卻至30°C的培養液中加入10%的種子培養液，30°C發酵48h。 向發酵液內加入兩倍體積的95%乙醇，得沉淀即為粗品，將沉淀取出，重新溶解于水中，利 用利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法去蛋白。去蛋白的上清液中再加入2倍體積乙醇， 沉淀多糖，并將該沉淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液經過DEAE-32纖維素和瓊脂糖凝 膠S印harose CL-4B分離后，乙醇沉淀，干燥，即得純化的多糖。實施例5配置培養液，NaH2PO42. 5g, KNO3 4g，CaCl2 0. 15g, MgCl2 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 0125g, MnSO4 0. 003g, ZnCl2 0. 0075g, NaCl 70g，蔗糖 40g，H2OlOOOmL, pH 7. 2，將培養液 加熱110°C滅菌30分鐘，冷卻至30°C接入平皿菌落液100 μ L，28°C培養24h，為種子液。向 滅過菌(121°C滅菌15分鐘)并冷卻至30°C的的培養液中加入5%的種子培養液，30°C發酵 72h，向該發酵液內加入兩倍體積的95%乙醇，得沉淀即為粗品。小鼠喂食同實施例1。
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權利要求
一種土壤桿菌ZX09，其特征在于在山東東營的鹽土中分離得到菌株，此菌株為土壤桿菌屬菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NOM2010020，該菌株具有以下特點a.形態特征在無機鹽瓊脂平板培養基上28℃培養本菌株3 5天后觀察，菌落呈圓形，菌株分泌大量的胞外多糖；b.生理生化特征能有效還原硝酸鹽，不能降解纖維素，不分泌色素，能夠在7％的NaCl發酵液中生長，在含2％NaCl的發酵液中生長速度最快；以蔗糖或乳糖為碳源能很好地生長，可疑利用碳源為D 葡萄糖、D 果糖、D 甘露糖或D 木糖，不能利用碳源為麥芽糖。
2.根據權利要求1所述的土壤桿菌ZX09，其特征在于土壤桿菌(Agrobacteriumsp. ZX09) 16S rDNA 序列為atgcagtcgaCCgCCCCgggaggggagtggcagacgggtgagtaacgggtggcaacctac60cctttcctgcggaatacctccggaaaactggaattaacaccgcatcccccctagggggga120aatatttatcggggaaggattgccccgcgttgtattagctagttgggggggaaacggcct180accaaggcgaccatccatagctgggctgagaggatgatccgcctcgttgggactgacccc240ccccccaccctcctacgggaggcagcgggggaaaatattgaacgatgggcgcacgcctga300tcccgccctgccgggtgagtgaagaaggccttagggttgtaatcttttttcaccgatgaa360aataatgacggtagtcaaaaaagaccccccggctaacttcctgccagccgccgcgataat420acgaagggggctagtgttgttcagaattactgggcgtaaagcgcacgtaggcgtttattt480aagtgggggaagaaatcccgcagctcaactgcggaactgtctttgatgctgggtatgttg540aggatggaagaggtaagtggaattccgagtgtagaggagaaattcgtatatattcggagg600accaccagtggcgaaggcttcttactggtccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtgg660ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtc720gggcagtatactgttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacgg780tcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggt840ttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagctcttgacattcggggtatgggcattgg900agacgatgtccttcagttaggctggccccagaacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc960gtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccag1020catttagttgggcactctaaggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatga1080cgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacag1140tgggcagcgagacagcgatgtcgagctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcac1200tctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcagatcagcatgctgcggt1260gaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccg1320aaggtagtgcgctaaccgcaaggaggcagctaaccac1357
3. 一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性葡聚糖，其特征在于結構通式如下所示 —⑶-beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-alpha-D_Glup-(1 — 3)-alpha-D-Glup-(l}n — 上述結構中的η為100 200。
4.一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β -葡聚糖的制備方法，步驟如下(1)配置培養液將NaH2PO4O. 5 %0 -2. 5 %0’ ΚΝ032 %0 ~4 %0’ CaCl2O. 07 %0 -0. 15 %0’ MgCl2O. 2 % -0. 5 %o, FeSO4 · 7Η200· 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4O. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%, NaClO-7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，pH 為 5-11，以上鹽濃度為 質量比；(2)將培養液加熱110-121°C滅菌15-30分鐘，然后冷卻；(3)向步驟(2)中冷卻至30-37°C的滅菌后的培養液內加入平皿菌落液，在28°C 30°C發酵24-48h形成種子培養液；(4)向步驟(2)中冷卻至30-37°C的滅菌后的培養液內加入步驟(3)中獲得的種子培 養液，在28°C 30°C發酵48 72h ；(5)向第(4)步得到的發酵液內注入超過發酵液兩倍體積的乙醇、丙酮或異戊醇，沉淀 得到粗多糖；(6)對粗多糖去蛋白后得到純品。
5.一種用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β-葡聚糖的應用，其特征在于將利用土壤桿菌 ΖΧ09生產的β -葡聚糖應用于降低血糖。
全文摘要
本發明公開了一種土壤桿菌ZX09，用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β-葡聚糖及其制備方法及在降低血糖上的應用。其中土壤桿菌ZX09在山東東營的鹽土中分離得到菌株，此菌株為土壤桿菌屬菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為CCTCC NOM2010020。用土壤桿菌ZX09生產的水溶性β-葡聚糖，結構通式如下所示→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}n→，上述結構中的n為100～200。本發明菌株新穎，性質獨特，可耐鹽生長，生長過程中不分泌色素；菌種的培養操作簡便，工藝簡單，培養基為全合成培養基，成份明確，成本低，適宜于工業化生產。
文檔編號C08B37/02GK101935623SQ20101014637
公開日2011年1月5日 申請日期2010年4月14日 優先權日2010年4月14日
發明者修愛慧, 張建法, 朱斌 申請人:南京理工大學