專利名稱：識別新的膜蛋白多肽的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因及由該基因編碼的新的膜蛋白，更詳細地是有關編碼新的具有前B細胞生長支持能力的膜蛋白多肽的基因、含有該基因的載體及由該載體轉化的轉化子以及利用該基因制造新的膜蛋白多肽的方法。
本發明還涉及識別具有前B細胞生長支持能力的新的膜蛋白多肽的單克隆抗體。
本發明的基因可編碼增強慢性風濕性關節炎(RA)患者的滑膜細胞表面的前B細胞生長支持能力的新的膜蛋白。將本發明的基因插入適當的載體，通過轉化常用的宿主細胞，可以大量制造具有前B細胞生長支持能力的均一的新的膜蛋白多肽。因此利用本發明可以鑒別慢性風濕性關節炎，還可以制備用于臨床診斷的試劑。
慢性風濕性關節炎病人的滑膜或滑膜液中的炎癥細胞來自于末梢血液，對于這些細胞向滑膜的遷移還沒有完全闡明，但認為它與給予細胞的化學信號和細胞膜上的蛋白(粘附分子)之間的復雜相互作用有關。
關于膜蛋白在關節炎中的作用已經進行了各種研究。例如，已知在慢性風濕性關節炎病人(RA)的滑膜血管和滑膜內層上表達一細胞間的粘附分子-1(在下文稱之為LCAM-1)，此粘附分子是T細胞表面分子LFA-1的配體并與血管壁中細胞的粘附和遷移有關。〔Hale et al.；Arthritis Rheum.,32:22(1989),and Haynes et al.,Springer Sewn.Immunopathol.,11:163(1989)〕。
同樣地有人提出在慢性風濕性關節炎(RA)和變形性關節炎的類成纖維滑液細胞和滑膜上表達有血管細胞粘附分子-1(在下文稱為VCAM-1)，此粘附分子是T淋巴細胞(尤其是記憶細胞)和單核細胞上表達的integrin VLA-4的配體，〔Morales-Ducret et al.,J.Immunol.,149:1424(1992)〕，并且進一步在滑膜的內皮小靜脈上表達有一被稱為VAP-1的膜蛋白，該蛋白可能做為白細胞的專一性識別結構。〔Salmi et al.；Science,257,1407(1992)〕。
本發明者為調查骨髓微環境在引起B細胞機能異常的疾病中的作用，進行了廣泛的研究，發現與正常人相比，來自于慢性風濕性關節炎(RA)和多發性骨髓瘤病人(MM)的骨髓基質細胞的前B細胞生長支持能力得以提高，并且前B細胞和基質細胞的直接接觸對這種支持能力起一本質的作用。本發明者已建立了含有通過將病人的基質細胞，胞系來促進前B細胞生長的因子的基質細胞系(KASV5-5,MMSV3-3)，并發現這些基質細胞系的前B細胞生長支持活性可能是與不同于已知的干細胞因子(SCF),1CAM,CD44,VCAM-1,LFA-1α,LFA-1B,NCAM和ELAM-1的其它未知粘附分子有關。〔J.Immunol.,149:4088(1992)〕。
而且，有人提出來自慢性風濕性關節炎(RA)病人的滑液細胞建立的滑液細胞系Syn SV6-14，與來自慢性風濕性關節炎病人骨髓的基質細胞系RASV5-5，具有相似的前B細胞生長支持能力，本發明者已獲得了與這些細胞系反應，但與來自人骨髓的不具有前B細胞生長支持能力的基質細胞系NFSV1-1不反應的新型單克隆抗體，并同時成功地克隆了編碼抗原膜蛋白(BST-1)的基因。(Japanese Patent Application NO.5-141178/1993)。
本發明者在制備各種可識別在慢性風濕性關節炎(RA)患者的滑膜細胞中表達的而在正常細胞中未表達的膜蛋白的單克隆抗體的過程中，得到了可識別具有與Syn SV6-14反應，不與正常骨髓間質細胞株NFS V1-1反應的性質的、與上述的Bst-1不同的膜蛋白的新的鼠單克隆抗體RS38。然后，使用該RS38抗體篩選由慢性風濕性關節炎(RA)患者滑膜細胞株制備的cDNA文庫，成功地分離得到編碼和所述RS38反應的新的膜蛋白的克隆，從而完成了本發明。
即，本發明的目的是提供具有前B細胞生長支持能力的新型膜蛋白多肽、編碼該多肽的基因、含有該基因的載體、由該載體轉化的轉化子及通過利用該基因產生新的膜蛋白的方法。
進一步，本發明的目的之一是提供識別具有前B細胞生長支持能力的新的膜蛋白的單克隆抗體。
為實現上述目的，本發明包括下面(1)-(7)。
(1)含有序列表的No.1序列所示的氨基酸序列或部分氨基酸序列的在風濕性關節炎病人的滑膜上表達的新的膜蛋白多肽。
(2)編碼含序列表的No.1序列所示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的DNA。
(3)上面(2)中記載的DNA，特征為含有同序列表的No.2序列顯示的堿基序列或來自所述堿基序列雜交的堿基序列，所述堿基序列至少有一取代的，移去或部分添加的氨基酸。
(4)含上面(2)或(3)中記載的DNA的重組載體。
(5)原核或真核宿主細胞，特征為由上述(4)中記載的重組載體轉化得到。
(6)產生含序列表的No.1序列顯示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的方法，特征是培養上述(5)記載的宿主細胞。
(7)識別含序列表的No.1序列顯示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的單克隆抗體。
下面將詳細描述本發明。
本發明的單克隆抗體基本上接下面方法制備。
將來自風濕性關節炎(RA)病人且具有前B細胞生長支持能力的滑液細胞作抗原，按照普通免疫方法免疫，根據普通的細胞融合方法細胞融合被免疫的細胞并按照常規克隆方法克隆融合細胞來制備本發明的抗體。
更加明確地，作為產生本發明單克隆抗體的優選方法可由如下方法加以說明，該方法包括利用來自風濕性關節炎病人(RA)滑膜并已建立培養細胞的細胞系Syn SV6-14作為上面提及的抗原，融合由該抗原免疲的哺乳動物的漿細胞(免疫細胞)和哺乳動物如鼠的骨髓瘤細胞，克隆獲得的融合細胞(雜交瘤細胞)，從中選擇產生識別Syn SV6-14的本發明的抗體，培養細胞以回收目的抗體。
在產生上述單克隆抗體的方法中，作為抗原免疫的哺乳動物并沒有特別地限制；優選同進行細胞融合時使用的骨髓瘤細胞相容的動物，一般使用小鼠，大鼠和倉鼠。
按照一般方法進行免疫，例如，將得自上述慢性風濕性關節炎病人滑膜的細胞系Syn SV6-14的培養細胞注射引入到哺乳動物的腹膜腔。更加明確地，優選以PBS或生理鹽水將其稀釋或懸浮至一合適的量，并每隔4-21天分幾次將其注射到動物體內，如果必需的話可以和普通的佐劑一起注射。并且在上述注射中可以使用常規載體(Schlepper)。作為免疫細胞優選使用上述細胞系最終注射后獲得的脾細胞。
當哺乳動物的骨髓瘤細胞作為另一親本細胞和上述免疫細胞融合時，優選地使用已知的各種細胞系包括P3(p3x63Ag8.653)I J.Immunol.,123:1548(1978)〕,P3-U1 Icurrent Topics in Micro-biology and Immunolosy,81:1-7(1978)〕,NS-1〔Eur..J.Immunol.,6:511-519(1976)〕,Mpc-11〔cell,8:405-415(1976)〕,SP2/0〔Natune,276:269-270(1978)〕,FO〔J.Immunol.Meth.,35:1-21(1980)〕,S194〔J.Exp.Med.,148:313-323(1978)〕和R210〔Nature,277:131-133(1979)〕。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合可基本上按照已知的方法進行，如Milstein等的方法〔Methols Enzymol.,73:3-46(1981)〕。
更加明確地，例如上述的細胞融合可以在融合促進劑存在下在普通的營養培養基中進行。作為融合促進劑可以使用例如聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒(HVJ)等，并且為了提高融合效果根據需要可以適當加入輔助試劑如二甲基亞砜。考慮到使用的免疫細胞和和骨髓瘤細胞的比例，優選前者使用量為后者的1-10倍。作為上述細胞融合使用的培養基可以使用例如適于上述骨髓瘤細胞系增殖的RPMI-1640培養基和MEM培養基及其它通常用來培養這種細胞的培養基，并且可以同時使用補加血清如胎牛血清(FCS)。
把上面規定數量的免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養基中充分混合，加入預熱至約37℃的PEG，例如平均分子量為1000-6000范圍的PEG，至培養基中，通常使之濃度約為30-60(w/v)并混合進行細胞融合。隨后通過重復連續添加適當培養基的操作并離心反應混合物，移去上清液即可形成目的雜交瘤。
通過在普通選擇培養基如HAT培養基(含有次黃嘌呤，氨基蝶呤和腺嘧啶脫氧核苷的培養基)中培養選擇所述雜交瘤。在所述HAT培養基中的培養繼續足夠長的時間以使非目的雜交瘤細胞(非融合細胞)死亡，通常持續從幾天到幾個星期。隨后按照常規的無限稀釋分析進行篩選和單克隆產生目的抗體的雜交瘤。
由此制備的產生本發明單克隆抗體的雜交瘤可以在普通培養基中傳代培養并在液氮中貯存很長一段時間。
為了從所述雜交瘤中收集本發明的單克隆抗體，可以采用根據常規方法培養所述雜交瘤并從上清液中獲得抗體的方法，或把雜交瘤注射進適當哺乳動物中使其繁殖并從腹水中獲得抗體的方法。前者適于獲得高純度的抗體而后者適于抗體的大量生產。
而且根據上述方法獲得的抗體通過采用常規的純化方法如鹽析技術、凝膠過濾和親和層析可以純化至很高的純度。
由此制備的本發明單克隆抗體，按照常規免疫學方法如放射免疫分析(RIA)，酶免疫分析(EIA)和免疫熒光分析可以高靈敏度和高精確度地識別表達新的膜抗原蛋白的風濕性關節炎病人的滑液細胞。
通過從表達有人的前B細胞生長支持活性的慢性風濕性關節炎(RA)病人的滑液細胞膜蛋白中制備mRNA，然后按照已知方法把其轉化成雙鏈cNDA而可以獲得本發明的基因。可以作為用來制備mRNA的細胞，例如用細胞系Syn SV6-14作為雜交瘤RS38的免疫源，但并不限于這個細胞系，表達具有人前B細胞生長支持能力膜蛋白的任何類型細胞均可使用。另外本發明中使用了Syn SV6-8。
為獲得mRNA的總RNA的調制方法包括用硫氰酸胍處理后進行氯化銫密度梯度離心〔chirgwin et al；Biochemistry,18:5294(1979)〕得到總RNA的方法及在核糖核酸酶抑制劑釩復合物存在條件下進行表面活性劑處理和酚處理的方法〔Berger&.Birkenmeier,Biochemistry,18:5143(1979)〕、及其他已知的方法。
利用結合寡聚(dT)的載體如瓊脂糖或纖維素按照親和柱層析方法或分批方法通過從總RNA中回收Poly(A)+RNA，可以從總RNA中制備mRNA。而且根據蔗糖密度梯度離心可進一步純化poly(A)+RNA。另外，還可以使用不必制備RNA而直接獲得poly(A)+RNA的方法或利用市售的試劑盒的簡便方法。
為從由上述得到的mRNA獲得雙鏈cDNA，例如可以將mRNA作為模板，利用和位于3’末端的poly-A-鏈互補的寡聚(dT)作為引物，然后在逆轉錄酶作用下可以合成和mRNA互補的DNA(cDNA)。
將mRNA通過堿處理方法分解、除去后，使得到的單鏈cDNA作為模板，以逆轉錄酶或DNA聚合酶作用(如klenow片段)，然后以S1核酸酶等處理，或直接以RnaseH及DNA聚合酶〔Maniatis et al.,Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory(1982)和Gubler&Hoffman,Gene,25:263(1983)〕處理也可以獲得雙鏈cDNA。目前方便的試劑盒已經上市、通過使用它們也可以獲得雙鏈cDNA。
通過把由此獲得的cNDA插入到合適的載體例如Ek一類質粒載體pBR322和psC101，和噬菌體載體如λgt10中，然后以所述載體轉化大腸菌(如X1776,HB101,DH1,DH5等)等，可以得到cDNA文庫(例如參見上述的“分子克隆”)。
另一方面通過利用在合適的表達載體中插入按照上面提及的方法獲得的雙鏈cNDA，可以轉化其它一些原核和真核生物的宿主細胞。
通過添加合適的化學合成的DNA銜接子并在預先用限制酶裂解的載體DNA及ATP存在下以T4噬菌體DNA連接酶處理，使雙鏈cDNA和載體連接。
本發明的表達載體含一復制原點，一選擇標記、一位于待表達基因上游區域的啟動子，一RNA剪接位點和一多聚腺苷酸信號。
作為哺乳動物細胞中的基因表達啟動子，可以使用病毒啟動子如逆轉錄病毒，多形瘤病毒，腺病毒和猿猴病毒(SV)40，及來自于如人多肽鏈延伸因子1α(HEF-1α)細胞的啟動子。例如在使用SV40啟動子的情況下，可以根據Mulligan et al〔Nature,227:108(1979)〕的方法容易地進行。
作為復制原點可以使用來自SV40多形瘤病毒，腺病毒和牛乳頭瘤病毒的復制原點，作為選擇標記可使用磷酸轉移酶APH(3’)Ⅱ或Ⅰ(neo)基因，胸苷激酶(TK)基因，大腸桿菌黃嘌呤-鎢嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Ecogpt)基因及二氫葉酸還原酶(DHFk)基因。
為了以原核細胞作為宿主細胞表達目的基因，最好用來自于能適于宿主的種類的復制子即含一個復制原點和一調節序列的質粒載體來轉化宿主細胞。優選具有能賦予被轉化細胞類型選擇性的標記基因的載體。例如在使用大腸菌作宿主細胞的情況下，可以用起源于宿主細胞的載體進行轉化〔Boliver et al.,Gene,2:95(1975)〕。該pBR322含有一個氨芐青霉素抗性基因和一個四環素抗性基因，因此利用任何一個抗性性能都可以鑒定轉化子。
作為原核宿主細胞基因表達所必需的啟動子例如優選β-乳糖酶基因〔chang et al.,Nature,275:615(1978)〕，乳糖啟動子〔Goeddle et al.,Nature,275:615(1978)〕，色氨酸啟動子〔Goeddle et al.,Nucleic Acid Res.8:4057(1980)〕,tac啟動子等，但并不限于這些啟動子。
在本發明的表達系統中使用的原核宿主細胞優選大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，嗜熱芽孢桿菌等；但并不限于這些宿主細胞。
此外作為真核宿主細胞優選真核微生物如釀酒酵母及來自于哺乳動物的細胞如cos細胞，中國倉鼠卵巢細胞(CHO),C127細胞，373細胞，Hela細胞，BHK細胞，namalwa細胞和人胎兒腎細胞(293細胞)，但并非限于這些細胞。
另外，最好通過適當選擇適于宿主細胞的培養條件進行本發明轉化子的培養。
例如以前B細生長支持能力作指數或按照用抗體直接表達克隆的方法可以進行編碼具有本發明的前B細胞生長支持能力的膜蛋白的cDNA的分離。
利用鼠前B細胞系DW34可進行前B細胞生長支持能力的測定〔Eur.J.Imunol.,18:1767(1988)〕。即，培養表達具有前B生長支持能力的膜蛋白的細胞直至其在24孔板接近匯合(優選密度約為50％)，隨即加以適量的輻射，在每孔中加入1到2×103個的DW34，在含有10％FCS的RDMI-1640培養基中，在5％CO237℃條件下培養4至6天。根據錐蟲藍染色檢查每孔DW34活細胞的數量可以發現生長支持能力提高的程度。
本發明中通過重復步驟可以克隆目的基因，步驟包括借助利用識別慢性風濕性關節炎病人(RA)滑液細胞上新的膜蛋白的單克隆抗體RS38的RACScan，根據流式細胞計數選擇表達膜蛋白的轉化子，通過分選用來制備轉化子的質粒DNA再制備轉化子，然后根據流式細胞計數來篩選轉化子。
具體地，在孔板上培養轉導的轉化子(293T細胞)，并以含0.02％EDTA的PBS從板上移去細胞，以含2％FCS和0.02％NaN3的PBS組成的FACS緩沖溶液洗滌細胞后，使其與做為初級抗體的RS38反應。隨后以FACS緩沖溶液洗滌去除未反應的初級抗體后，進一步使其與次級抗體FITC標記抗體(FITC標記的羊抗鼠I8抗體)反應，死細胞以碘化丙烷染色，以TACScan分析活細胞，選擇用RS38強烈反應的轉化子。
進一步，編碼具有新的前B細胞生長支持能力的膜蛋白多肽的如序列表No.2所示的全長cDNA(PRS38-BOS)可通過重復以下這些步驟獲得，這些步驟包括以堿處理含有用來制備同抗體反應的轉化子的cDNA的大腸桿菌(DH5)，以挑選一組含有目的基因的質粒，把這組質粒再分成幾組質粒，重新轉導入293T細胞r然后利用上述的單克隆抗體RS38根據FACScan分析挑選轉化子。
另外，含有將該cDNA插入PUC19載體的XbaⅠ切斷部位的PRS-PUC19的大腸菌(E.Coli)DH5α菌株已委托作為布達佩斯條約國際保藏單位的工業技術院生命工學工業技術研完所(日本國茨城縣っくば市東1丁目潘3號(郵編305)〕保藏，保藏日期為1993年10月5日，保藏菌株為Escherichia Coli.DH5α(PRS-pUC19)，保藏編號為FERM BP-4434。
一般地，根據已知的人干擾素基因等可認為真核生物基因表現出多態性〔e.g.Nishi et al.,J.Biochem.,97:153(1985)〕，在某些情況下由于這種多態性，至少一個或1個以上的氨基酸被取代，在另外一些情況下雖然堿基序列有變化但氨基酸完全不改變。
進一步，某些比序列表的No.1序列顯示的氨基酸序列至少多一個或少一個氨基酸的多肽，或氨基酸至少被一個或一個以上氨基酸取代的多肽可能也具有與本發明的新的膜蛋白相同的功能(前B細胞生長支持能力)。實際上例如從人白細胞介素-2(IL-2)基因獲得的多肽，也保持TL-2活性，而在該基因中相應于半胱氨酸的DNA序列轉變成相應于絲氨酸的序列〔Wang et al.,Science,224:1431(1984)〕。
況且通過一合適的限制酶或銜接子可以連接一正知的蛋白基因和序列表的No.2序列顯示的基因以產生和已知蛋白結合的多肽。對已知的蛋白基因可提及免疫球蛋白，由此利用序列表的No.2序列顯示的基因它可以結合Fc部分而不是可變區位點〔(Zettlmeiss1 et al.,DNA AND CELL BIOLOGY,9:347-353(1990)〕。
而且如果在真核細胞中表達多肽，在許多情況中發生糖基化，并且糖基化可根據改變至少一個氨基酸加以調節。在這種情況下它也可具有和本發明的新膜蛋白多肽相同的功能。因此即使按照上述各種方法對基因中編碼本發明膜蛋白法多肽的位點進行人工修飾，只要從此基因獲得的多肽具有和本發明的膜蛋白多肽相同的功能，本發明就可以包括此多肽。
另外，從和序列表的No.2序列所示的基因雜交的基因表達的多肽具有和本發明的膜蛋白多肽相同的功能(前B細胞生長支持能力)，此基因和多肽也包含在本發明中。在這種情況中，雜交可以采用常規雜交條件(例如，參照上面提到的“MolecularCioning”)進行。
通過培養由編碼多肽基因轉化的轉化子可以獲得所需的具有前B細胞生長支持能力的，均一的純化可溶性膜蛋白多肽，以適當的增溶劑溶解產生的多肽，對得到的多肽進行分離和純化。優選的增溶劑例子包括乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，十二磺基硫酸鈉(SDS)，曲拉通X-100，吐溫20及類似增溶劑。
此外，也可以按照基因工程方法獲得可溶性膜蛋白。即如圖3所示，由于推測RS38是一個具有細胞膜穿透結構域和在N-末端的細胞內結構域的膜透過類蛋白，通過采用PCR-突變方法可以制備序列表中No.1序列49位Asn為N末端的可溶性RS38〔M.Kamman et al.,Nucl.Acids Res.,15:5404(1989)〕。在此情況下，作為信號序列可以使用已知的信號序列例如包括Bst-1(Japanese Patent Application No.5-141178/1993)的信號序列和G-CSF(Japanese Patent Paslication No.2-5395/1990)的信號序列。
作為分離和純化膜蛋白多肽的方法，可以采用普通蛋白使用的方法。例如，利用上面提及的單克隆抗體，超濾、鹽析、透析及類似技術通過選擇和組合各類層析如親和層析來適當地分離和純化本發明的膜蛋白多肽。
附圖的簡單說明

圖1顯示出根據Northern雜交分析對本發明實施例中得到的基因的分析結果(根據瓊脂糖凝膠電泳的照片)。
圖2顯示了本發明實施例得到的膜蛋白的鼠前B細胞系DW34的生長支持能力。
圖3顯示了借助DNA分析軟件Gene Works對本發明實施例中得到的基因的疏水區域和親水區域的分析結果。
本發明將根據參考實施例和以后的實施例詳細描述，但本發明并不限于這些實施例。參考例1來自于鍵康人的基質細胞系的建立以含SV40的大T抗原cDNA和雞肌動蛋白啟動子〔BBRC，186:129-134(1992)〕的pAct-SVT質粒借助Gene Pulser(Biolad制造)電穿孔來自于健康供試者的基質細胞。即將PBS中的健康人的基質細胞1×107細胞/ml的0.8ml等分試樣同10μg質粒混和，混合物于冰上放置10分鐘，在250V和250μF電容的條件下進行電穿孔，進而于冰上放置10分鐘，懸浮于含10％FCS(Bioproducts生產)的RPMI-1640培養基中(G1BCO生產)，并于一10毫米培養皿中培養。每三天更換培養基，約兩個星期后用浸滲胰蛋白酶的一小片濾紙收集生長良好的貼附細胞的克隆以獲得來自健康供體骨髓的基質細胞系(NFSV1-1)〔J.Immnol.149:4088(1992)〕。參考例2來自風濕性關節炎(RA)病人的滑液細胞系的建立以含有SV40大T抗原cDNA和雞β-肌動蛋白啟動子〔BBRC,1986:129-134(1992)〕的pAct-SVT質粒借助Gene Pulsen(Biolad制造)對來自風濕性關節炎病人的滑液細胞電穿孔。即將來自RA患者的PBS中的滑膜細胞1×107細胞/ml的0.8ml等分試樣與10μg質粒混合，混合物于冰上放置10分鐘，在250V和250μF電容的條件下進行電穿孔，進而于冰上放置10分鐘，懸浮于含10％FCSC Bioproducts生產)的RPMI-1640培養基中(G1BCO生產)，并于一10毫米培養皿中培養。每隔三天更換培養液，約兩星期后以浸滲胰蛋白酶的小片濾紙收集生長良好的貼附細胞的克隆以獲得來自風濕性關節炎病人的滑液細胞系(Cyn SV6-8和Syn SV6-14)。
本發明的實施例將在下面詳細描述。實施例1單克隆抗體的制備1)抗原和免疫上述參考例2中獲得的來自風濕性關節炎病人且具有前B細胞生長支持能力的滑液細胞系Syn SV6-14用作免疫的抗原。以含10％胎牛血清(FCS,Bioproducts生產)和50μM 2-巰基乙醇的RPMI-1640培養基(G1BCO生產)作為培養基)在含5％cos,37℃的培養箱中傳代培養細胞系。
以0.02％EDTA和PBS處理細胞。輕輕從培養箱的培養瓶中吸取細胞。以約1×107細胞/毫升的比例將細胞懸浮于RPMI培養基中，并以其免疫BALB/C鼠(4星期大，雌性，日本S.L.C制備)。在初次免疲中，約1×107/毫升細胞注射入鼠的腹膜腔中，兩至三個星期后，作為再次免疫注射1×107/毫升細胞。進一步，在2至3個星期的間隔中作為再次免疫注射兩至三次1×107/毫升細胞，最后免疫三天后，殺死鼠并摘出脾臟。2)細胞融合將自鼠摘出的脾臟切成碎片，離心分離的脾細胞，懸浮于RPM1-1640培養基中(G1BCO生產)并充分洗滌。另一方面通過在含10％胎牛血清(FCS；F1LTRON生產)的DMEM培養基(G1BCO生產)中培養鼠雜交瘤細胞系p3×63Ag8.653〔J.Immunol.,123；1548(1979)〕獲得的1×107細胞同樣在上述DMEM培養基中洗滌，并和1×108所述脾細胞一起加入一離心管中并混合，然后以聚乙二醇1500(Boehringen生產)按常規方法〔Clin.Exp.Immunol.,42:458-462(1980)〕進行細胞融合。
將得到的融合細胞分別注入到含有10％FCS的DMEM培養基的96孔板上，在含5％CO2的恒溫箱內37℃下培養。從第二天起在HAT選擇培養基(在含有1.0×104M次黃嘌呤、4.0×107M氨基喋呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶的全RPMI-1640培養基中加入10％FCS及50μM 2-巰基乙醇的培養基)中緩慢置換，繼續培養。培養開始后，每周2次用新的HAT培養基置換一半的上清液，繼續培養以維持增殖。
由此獲得的融合細胞利用有限稀釋法進行克隆。
即利用上述融合細胞的培養上清液中的抗體，檢測與抗原的結合性，只將與抗原具有強結合性的克隆利用有限稀釋法形成克隆。
為了進行克隆，上述雜交瘤和BALB/C鼠的脾細胞制成規定的量，以每孔1至10個雜交瘤的比例接種到96孔板上、并在含5％CO2恒溫箱內37℃培養。按一般的有限稀釋法，以同樣的方法重復克隆生長的雜交瘤的操作，直至它們成為理論上的單一克隆。用上述抗原篩選產生目的抗體的克隆。3)篩選根據間接熒光抗體技術，通過流式細胞儀(Flow Cytometer)進行融合細胞(雜交瘤)的篩選。
使用a)Syn SV6-16(用于免疫的抗原)和b)來自健康供體作為靶細胞的骨髓基質細胞系NFSV1-1來進行產生目的抗體的克隆篩選。即，免疫來自風濕性關節炎(RA)病人的具有對BALB/C系鼠的前B細胞生長支持能力的分泌滑液細胞系(Syn SV6-14)之后，對與Syn SV6-14反應但不與來自健康供體不具備前B細胞生長支持能力的骨髓基質細胞系(NFSV1-1)反應的單克隆抗體的篩選可如下進行。使用Syn SV6-14進行第一次篩選，該細胞作為用于免疫的抗原可進行反應。首先根據與Syn SV6-14反應的培養上清液的篩選來選擇與所述Syn SV6-16反應的融合細胞，并接著進行初篩。
即，在懸浮于反應緩沖液(含2％FCS和0.02％NaN3的PBS)細胞中加入20μl雜交瘤培養液(約5×105/20μl)，并4℃反應20分鐘。
用上述緩沖液洗兩次，在其中加入FITC標記的抗鼠Ig抗體，混合物孵育20分鐘。反應產物洗三次后，用流式細胞儀(FACScan，由Becton Dickinson制造)來分析。
接著，將來自健康供體的骨髓基質細胞系NFSV1-1用作進行反應的細胞，并如上述用流式細胞儀進行分析。根據結果，并獲得產生與Syn SV6-14反應更強的抗體的雜交瘤。
因此，產生與Syn SV6-14反應但不與來自健康供體的骨髓基質細胞系NFSV1-1反應的抗體的雜交瘤(RS38)可被分離，由雜交瘤產生的抗體為IgM,K型。
另外，產生上述單克隆抗體的雜交瘤RS38是一新的融合細胞，它是由作為親本的BALB/C鼠脾細胞和鼠骨髓瘤P3×63Ag8、653制成的，并于1993年10月5日保存于作為微生物保存布達佩斯條約的國際保藏單位的工業技術院生命工學工業技術研究所，名稱為Mouse-Mouse hybridoma RS38，保藏編號為FERM BP-4433。4)抗體的純化按常規方法培養上述2)中制備的融合細胞，并按常規方法純化產生于培養上清液中的抗體。
即從孔中收集具有對上述抗原的最高抗體滴度的雜交瘤，并挑出可識別細胞生長的孔，將得到的培養細胞擴大到一組織培養瓶中，在5％CO2,37℃的條件下生長。以Pristain劑量，將得到的細胞注射到BALB/C系鼠(6周，雌性，日本S.L.C.生產)的腹腔中。10至14天后，收集腹水，用50％硫酸銨鹽析，用PBS透析并用QAE柱純化。將抗體進一步鹽析并充分透析，以獲得約6mg/ml的純品。實施例2單克隆抗體的性質1)細胞系的分布通過FACScan分析在各種細胞系(表1所示的不同細胞系)中RS38抗原的分布。即將各種細胞系的每一種懸浮于含2％FCS和0.02％NaN3的PBS的FACS緩沖液中，其中存在10μg/ml的實施例1中得到的作為第一抗體的鼠單克隆抗體RS38，冰上孵育20分鐘，用FACS緩沖液洗兩次，以FITC標記的羊抗鼠Ig抗體(Cappel制造)作為第二抗體，將終產物進一步在冰上孵育15分鐘，其中加入碘化丙錠(propidium Iodide)，使其終濃度為1μg/ml，將混合物再在冰上孵育5分鐘，終產物用FACS緩沖液洗三次后，用光散射測定法分析細胞，并用FACScan(由BectonDickinson制造)分析單個活細胞。鼠單克隆抗體SG2和RF3(特愿平5-141178/1993)用作對照。結果如表1所示。從表2可明顯地發現RS38的分布與SG2和RF3是不同的。表1細胞系的FACS分析結果
實施例31.cNDA文庫的制備1)Poly(A)+RNA的制備使用Fast TrackTMmRNA提取試劑盒Version3.2(由Invitrogen制造)制備來自風濕性關節炎(RA)病人的分泌滑液細胞系Syn SV6-8的Poly(A)+RNA。即將20個10cm培養皿的Syn SV6-8細胞勻漿，接著按試劑盒所附的方法制備總RNA。按試劑盒所附的方法，使用試劑盒所附的寡聚d(T)纖維素進一步純化Poly(A)+RNA。2)cDNA文庫的建立將5μg上述Poly(A)+RNA用作材料，根據Time SaverTMcDNA合成試劑盒(Pharmacia制造)所附的方法合成雙鏈cDNA。使用DNA連接試劑盒(寶酒造社制造)，按試劑盒所附的方法，連上一BstⅪ銜接子(由Invitrogen制造)。使用試劑盒所附的Size Sep400 Spin Column，根據試劑盒所附的方法，去除游離的BstⅪ銜接子，得到約100μl的連有銜接子的雙鏈cDNA。
然后，將約100μl如此制備的連接銜接子的雙鏈cDNA中的2μl用于連接反應，通過使用cDNA連接試劑盒(寶酒造社制造)，將其連接到預先用限制酶BstⅪ和堿性磷酸酶處理的PEF-BOS載體上，以建立cDNA文庫。建立的cDNA文庫轉化到大腸桿菌菌株DH5(由Toyobo制造)中，文庫假定為總數約2×105個單獨克隆。制備50個文庫，每個文庫包含2000至4000個轉化大腸桿菌克隆，并接著用于下面的試驗。2．根據定向表達方法的克隆1)轉染至293T細胞通過在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中培養上述混合的大腸桿菌，進行cDNA的擴增〔Molecular Cloning:A Laborator yManual.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)〕，并根據堿裂解法〔Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Sambrook et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)從大腸桿菌中提取質粒DNA。根據氯化銫/溴化乙錠密度梯度離心，通過反復超離心提高所得質粒DNA的純度，并按磷酸鈣法將純化的質粒DNA轉染至293T細胞〔通過轉染SV40大T抗原cDNA到293細胞(轉化的原代胚腎細胞，人ATCC CRL1573)而制得的細胞系〕。
即，將2μg純化的質粒DNA溶于100μl含1mM Tris-HCl和0.1mM EDTA的緩沖液中，加入14μl 2M CaCl2后，所得混合物與由50mMHEPES(PH:7.1)、280mM NaCl和1.5mM磷酸鈉的緩沖液緩慢混合，將所得混合物室溫孵育30分鐘，并加到在24孔板中的293T細胞中。用含10％小牛血清(FCS，Bioproducts制造)的DMEM培養基(GIBCO制造)，在37℃和5％CO2的條件下，培養該293T細胞2天。2)根據FACScan分析將轉化的293T細胞從24孔板中轉入含0.02％EDTA的PBS中，用含2％FCS和0.02％NaN3的PBS的FACS緩沖液洗滌，接著懸浮于20μl含10μg/ml的作為第一抗體的上述單克隆抗體RS38的FACS緩沖液中，冰上孵育20分鐘。用FACS緩沖液洗兩次后，FITC標記的羊抗鼠Ig抗體(由Cappel制造)用作第二抗體又在冰上孵育15分鐘。加入碘化丙錠，使其終濃度為1μg/ml，混合物進一步在冰上孵育5分鐘，用FACS緩沖液洗三次，用光散射測定法分析細胞，用FACScan(由Becton Dickinson制備)分析單個活細胞。3)cDNA文庫的克隆利用堿裂解法從2000到4000個克隆作為一個庫的大腸桿菌中提取的質粒DNA，根據上述方法轉染到293T細胞中，并按上文FACS分析篩選轉染的細胞。在第25庫的293T細胞中發現一由鼠單克隆抗體RS38強染色峰。該質粒重新轉化到大腸桿菌DH5)由(GIBCO BRL制造)中，并接種在含50μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上。
以每個平皿100個克隆的比例，將2000個形成的克隆依次接種到底部劃分成網狀的瓊脂平皿上，使得每個克隆接種的位置可以識別，并且每個平皿制備兩套。以同樣的方法制備20個庫，每個庫含100個克隆，在含50μg/ml氨芐培養基上培養大腸桿菌。按堿裂解法提取質粒DNA后，用磷酸鈣法將其轉染至293T細胞中，用上述同樣的方法對轉染細胞進行FACScan分析。根據FACScan分析結果，從一鑒定為陽性的庫中，將100個大腸桿菌克隆依次分離，并按堿裂解法提取質粒DNA。根據磷酸鈣法用每一質粒DNA轉染293T細胞。用上述同樣方法進行FACScan分析，以得到單一陽性克隆，其被稱為pRS38-BOS。
使用Auto Real測序試劑盒(由Pharmacia制連)和Auto Cycle測序試劑盒，根據試劑盒所附方法，將克隆進行測序反應，并利用A.L.F.TMDNA測序儀(Pharmacia制造)進行其DNA序列的測定。根據結果發現，這是全長為966bp(序列表中序列No.2)的基因，根據最長的開放讀碼框架，推測該基困編碼180個氨基酸殘基序列。應用基因分析軟件Genetex，根據數據庫SWISSPLOT和NBRL，進行同源性比較，結果發現其為一新基因。4)根據Northern Blotting分析對表達的研究使用Fast TrackTMmRNA分離試劑盒變體3.2(由Invitrogen制造)制備來自RA病人的分泌滑液細胞系Syn SV6-14的、來自RA病人的骨髓基質細胞系RASV5-5的和來自健康供體的骨髓基質細胞系NFSV1-1的Poly(A)+RNA，以進行Northen印跡分析(Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Sambrooket al.,Cold Spring Habor Laboratory Pree,1989)。即收集并勻漿培養于10個10cm培養皿的細胞系，接著按試劑盒所附的方法制備總RNA，進一步按試劑盒所附的方法，使用試劑盒所附的寡聚d(T)纖維素純化Poly(A)+RNA。
使用多引物DNA標記系統(由Amersham制造)標記探針。即通過用限制酶HindⅢ使被認為是編碼被插入在PEF-BOS的BstⅪ位點上的RS38的插入物消化，調制315bp的片段，接著按試劑盒所附方法制法備標記探針。由Syn SV6-14,RASV5-5和NFSV1-1制得的Poly(A)+RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，每個泳道3μg,Gene Screen PlusTM(Du Pont制造)用作雜交轉移膜，按毛細法進行印跡。使用含0.5M NaPO4,1mM EDTA,7％SDS和1％BSA,pH7.0的Gilbert&Church緩沖液，65℃雜交過夜。完成雜交后，室溫下用2×SSC將膜洗四次，55℃下再用0.1×SSC和0.1％SDS洗兩次，接著與一張X光片重合，進行放射自顯影過夜。結果發現，如圖1所示在Syn SV6-14中檢測到約1.0kb的明顯條帶。3．用BALB 3T3細胞表達將新分子轉染到BALB 3T3細胞中，并檢測在哺乳動物細胞中的表達。
即將20μg的PRS38-BOS和含新霉素抗性基因的PSVzneo〔P.J.Souethem和P.Berg.J.Mol.Appl.Genet.,1:327(1982)〕加入到0.8ml的1×107細胞/ml的水溶液中，冰上孵育10分鐘，然后用Gene Pulser(BioLad制造)在250V和250μF靜電壓的條件下進行轉染，以完成共轉導。
又在冰上孵育10分鐘后，將細胞懸浮于含2mg/mlG418和10％FCS(Bioproducts制造)的DMEM培養基(GIBCO制造)中，在24孔板上培養。每三天換培養基，約兩周后，從孔中得到與上述鼠單克隆抗體RS38反應的轉化細胞系BALB3T338-1，38-3和38-9，這些細胞已形成具有新霉素抗性的生長良好的貼壁細胞的單一菌落。另外，作為對照細胞得到與RS38不反應但具有新霉毒抗性的轉化細胞系BALB3T338-4。4．新分子的生物學性質根據以下的方法，以成熟細胞的數目作指標，用依賴基質細胞生長的鼠前B細胞系DW34來分析新分子的生物學性質。
首先，轉導細胞系BALB3T338-1,38-3及38-9和對照細胞系BALB3T3及BALB3T338-4，在24孔板上培養直到基本長滿，以30Gy的放射線照射，每孔中加入2×103DW34，終產物在含有10％FCS(Bioproducts生產)的RPMI-1640(GIBCO制造)培養基中培養，其條件為37℃和5％CO2，培養4天。每孔中DW34可見細胞的數目用錐蟲藍染色計數，用以分析生長支持能力。結果發現，如圖2所示，在轉導細胞系BALB3T338-1,38-3及38-9中與對照細胞系BALB3T3及BLB3T338-4相比，DW34的生長得到了增強。
5．新分子的物化性質1)N-末端的分析以上所得的基因的疏水區及親水區的分析用DNA分析軟件Gene Works來進行。分析的結果如圖3所示。結果發現，序列表中No.1序列所示的第21位的Lys至第48位Ala的28個氨基酸殘基區具有高度疏水特性，因此，推測它屬于能夠通過細胞膜的蛋白類型，具有通過細胞膜的結構域及位于成熟蛋白N末端側的細胞內結構域。
工業應用如以上所詳細描述，本發明涉及一編碼新的具有前B細胞生長支持能力的膜蛋白多肽的基因、含有該基因的載體及由該載體轉化的轉化子及通過利用該基因產生新的具有前B細胞生長支持能力的膜蛋白的方法。因此，本發明的基因可以編碼在慢性風濕性關節炎(RA)患者的滑膜細胞上的膜蛋白。
將本發明的基因插入適當的載體中后，通過將常用的宿主細胞進行轉化，可以大量制備均一的新的膜蛋白多肽，另外可以使用得自慢性風濕性關節炎(RA)患者的滑膜細胞作為抗原，可以制得識別該膜蛋白多肽的單克隆抗體，因此利用本發明可以鑒定慢性風濕性關節炎(RA)及制備臨床上的診斷用試劑。序列表序列號No.1序列長度180序列類型氨基酸拓撲結構直鏈狀序列種類肽Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly序列5 10 15Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu20 25 30Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala35 40 45Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg50 55 60Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Clu Ala Gln Lys Gly65 70 75 80Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met85 90 95Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Glu Gly Gln Lys Lys100 105 110Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln115 120 125Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu130 135 140Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser165 170 175Ala Leu Leu Gln序列號No.2序列長度996序列類型核酸鏈數雙鏈拓撲結構直鏈狀序列種類cDNA到mRNA確定特征的方法E序列GTGGAATTG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC AGA GTG CCC ATG GAA51GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA GGA ATT CTG GTG 99CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG GCA GTG ATG GAG 195TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG ACC GAG GCC CAG 243AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC ACC TGC AAC CAC ACT 291GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG AAG GCC CAA GGA CAA 339AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAG 387CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTC AGA AGA GAA AAC CAG 435GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC TAC CCC ACC TCC CAG 483GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG ATT GTG CTG CTG GGC 531CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGAGATCCCA GGAAGCTGGC ACATCTTGGA AGGTCCGTCC 589TGCTCGGCTT TTCGCTTGAA CATTCCCTTG ATCTCATCAG TTCTGAGCGG GTCATGGGGC 649AACACGGTTA GCGGGGAGAG CACGGGGTAG CCGGAGAAGG GCCTCTGGAG CAGGTCTGGA 709GGGGCCATGG GGCAGTCCTG GGTGTGGGGA CACAGTCGGG TTGACCCAGG GCTGTCTCCC 769TCCAGAGCCT CCCTCCGGAC AATGAGTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTG AGATTGGGCA 829TGGGGTGCGG TGTGGGGGGC ATGTGCTGCC TGTTGTTATG GGTTTTTTTT GCGGGGGGGG 889TTGCTTTTTT CTGGGGTCTT TGAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGAGCAA 949AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGAATTC CACCACA 99權利要求
1.單克隆抗體，可識別具有序列表的序列號No.1中所示的氨基酸序列或其中的一部分的多肽。
全文摘要
編碼具有前B細胞生長支持能力的新的膜蛋白多肽的基因和由180個氨基酸殘基組成的具有前B細胞生長支持能力的新的膜蛋白多肽。通過用含該基因的載體轉化宿主細胞制備轉化子并培養該轉化子生產該新的膜蛋白多肽的方法、及識別該新的膜蛋白多肽的單克隆抗體。上述基因編碼具有前B細胞生長支持能力的膜蛋白。均一和純化的新的膜蛋白多肽可大量生產,而且識別該多肽的單克隆抗體也能生產,因此使風濕性關節炎的鑒定及其臨床診斷試劑的制備成為可能。
文檔編號C07K14/705GK1203921SQ9810833
公開日1999年1月6日 申請日期1994年10月14日 優先權日1993年10月15日
發明者平野俊夫, 改正恒康 申請人:平野俊夫