專利名稱：具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-1及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種基因重組方法制備具有抗纖溶酶活性的多肽textilinin-Ι。其關鍵是textilinin-1 (Q8008)基因的密碼子優化、合成、克隆、表達及產物的發酵表達和分離純化制備。重組textilinin-Ι可以作為止血藥，用于控制手術過程中纖維蛋白被纖溶酶溶解導致的失血過多。
背景技術：
臨床上，外科手術中如何減少血液的流失是需要密切關注的重要事件，尤其是對手術時間較長的心肺旁路手術，就更應該采取一定的措施，避免和減少患者的大量出血。減少外 科手術中血液的用量能有效地降低因輸血產生的大量問題和避免經血液傳播疾病的感染，如こ型肝炎病毒，人免疫缺陷型病毒(HIV)和變型的克羅伊茨費爾特-雅各布病等。止血藥aprotinin (抑酞酶)在國外被常用于心臟外科手術中，主要用于體外循環下實施冠狀動脈旁路移植術(CABG)的病人，以減少手術過程中的出血，并相應降低輸血需求。但aprotinin有明顯的副作用，可產生嚴重的不良反應，主要包括過敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心カ衰竭、腎功能異常、急性腎衰竭等，目前已經停止使用。目前在國內還沒有發現有同類產品的研究和報告。澳大利亞研究的textilinin-1仍處于實驗室研究階段。初步試驗結果證明textilinin-l與aprotinin相比,在相同用量的情況下，其止血過程更安全可靠。textilinin-1 (Txln-1),是一種Kunitz-型蛋白酶抑制劑，是從澳大利亞棕蛇Pseudonaja textilis textilis中提取的,具有59個氨基酸,分子量為6. 7 kDa的多肽。這個分子被建議作為在外科手術中aprotinin的替代藥物。雖然textilinin-Ι與aprotinin在蛋白序列上相似度只有47%。但在這兩種多肽中，六對ニ硫鍵是高度保守的。因此，預期他們的分子空間折疊是相似的，只是分子表面特性有些不同。textilinin-Ι 和 aprotinin 都具有強烈地抑制 plasmin、elastase 和 trysin 活性的作用。石開究發現 aprotinin 對 urokinase, thrombin 和 kallikrein t匕 textilinin—l強。被textilinin-Ι抑制的plasmin將很快地被逆轉，并比aprotinin易于控制,這可有助于控制血漿和損傷部位的抗纖維蛋白溶解活性。textilinin-Ι的這ー特點降低了由于強烈抑制纖溶酶(aprotinin)而導致的血栓風險，使它成為減少手術中血液損失的安全治療性藥物。并且，由于textilinin-Ι相對于plasmin有更強的專一'丨生，可以在較高的劑量使用而沒有由于酶特異性差而導致的安全風險。與主要用于心臟外科手術中aprotinin相比，Textilinin-I可能作為更可靠和更安全的止血用藥。textilinin-Ι可引起預期的血塊溶解抑制作用。在同樣的摩爾濃度下，aprotinin的抑制作用顯著低于textilinin-Ι。這也是早期用血衆凝塊溶解實驗所證明的。textilinin-Ι可抑制纖溶酶活性，并在小動物模型中能減少出血。textilinin-Ι同aprotinin ー樣,在5微摩的濃度下就能產生幾乎完全抑制tPA誘導產生的全血凝塊纖維蛋白的溶解。aprotinin能顯著增加血衆aPTT,而血衆aPTT則不受textilinin-Ι的影響。在小鼠尾靜脈出血動物模型中，靜脈給藥，textilinin-Ι和aprotinin都能起到相同的減少血液損失的作用。但textilinin-Ι可使小鼠止血時間更短。說明textilinin-Ι值得進ー步研究，有望開發成為替代aprotinin的藥物。蛇毒中提取的Textilinin-Ι為59個氨基酸的多肽，含有三對分子內ニ硫鍵，其天然核酸和氨基酸序列如下I MG GAC CGT CCG GAT TTC TGT GM CTG CCT GCT GAC ACCGGA CCA 45 I KDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGT AGA GTC AGA TTC CCA TCC TTC TAC TAC AAC CCA GAT GAA AM 9016 CRV RF PS FYY NP DEK 30 91AAG TGC CTA GAG TTT ATT TAT GGT GGA TGC GAA GGG AAT GCT AAC 135 31 K CL EFI YGGC EGN AN 45 136 AAT TTT ATCACC AM GAG GM TGC GM AGC ACC TGT GCT GCC TGA 180 46 NFI TKE ECE STCAA* 60 。

發明內容
本發明的目的在于提供ー種具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-Ι，它能夠通過以分泌表達的方式大量生產獲得，并具有較高的抑制plasmin的生物活性。該重組textilinin-Ι可以作為止血藥，用于手術過程中纖維蛋白被纖溶酶溶解導致的失血過多。本發明提供了ー種具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-Ι，其氨基酸序列為 KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA 其特征在于，所述具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-Ι，是通過將人工合成的
textilinin-1結構基因在酵母菌中，或者在CHO細胞或其它哺乳動物細胞中，以分泌表達的方式大量產生獲得，其中人工合成textilinin-Ι結構基因序列為
IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。本發明還提供了所述重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于，制備方法為將人工合成的textilinin-Ι結構基因在酵母菌中，或者在CHO細胞或其它哺乳動物細胞中，以分泌表達的方式大量產生重組textilinin-Ι,其中人工合成textilinin-Ι結構基因序列最好為
IAAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 IKDR P DF CEL PA DTGP 15 46 TGTAGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 16 CRVRF PS FYY NP D E K 30 91 AAG TGT TTG GAATTT ATT TAC GGT GGT TGT GM GGT AAC GCT AAC 135 31 KCL EFIYGGC EGN A N 45 136 AAC TTT ATT ACT AAG GM GM TGTGAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180 46 NFI TKE ECE S T C A A * 60。優選地，本發明重組textilinin-Ι可以通過甲醇酵母菌以分泌表達的方式大量
產生獲得。
本發明提供的重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時，依據textilinin-Ι的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成textilinin-Ι結構基因序列。本發明提供的重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時，將人工合成textilinin-Ι結構基因插入到甲醇酵母菌表達載體/7/YCaf或pPICZa 中。本發明提供的重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時,可以利用酵母菌的α-信號肽，PHOl信號肽將重組textilinin-Ι移出細胞，其中在信號肽序列與textilinin-Ι序列之間插入KEX2蛋白酶識別序列AAAAGA。本發明提供的重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于其發酵エ藝參數的優化為表達時pH值為3-5，表達溫度為23-25°C。 本發明提供的重組textilinin-Ι的制備方法，其特征在于其純化工藝為陽離子交換和陰離子交換，優化地選用Capto MMC和Q hp作為純化textilinin-Ι的填料。本發明提供的具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-Ι，在制造止血藥物方面的用途。本發明提供的具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-Ι,可代替aprotinin止血藥，作為副作用較低的止血藥，用于外科手術中，尤其是用于體外循環下實施的冠狀動脈旁路移植術(CABG)，以減少手術過程中的出血，并相應降低輸血需求。


圖I重組質粒示意 圖2 PCR鑒定陽性轉化子電泳結果；
圖3 HPLC色譜純度分析圖譜；
圖4 textilinin-Ι活性測定分析圖。
具體實施例方式 實施例I
根據美國Genebank中公開的textilinin-1 (AF402324. I)的核酸序列,選擇酵母菌喜好的遺傳密碼子，人工合成textilinin-Ι的結構基因序列。為使合成的目的基因重組到酵母菌分泌型表達載體PPICZ α中，在基因的5'端添加Xho I酶切位點，基因的3'端添加終
止密碼子TAATGA及酶切位點NotI
。另外，在Xho I酶切位點與textilinin-Ι多肽的N-端第一個氨基酸密碼子之間加入KEX2蛋白酶識別序列Lys-Arg對應的密碼子AAAAGA,這就確保了 textilinin-Ι在分泌到發酵液時能夠順利地切除α-信號肽。重組質粒構建見圖I。將合成的textilinin-Ι基因及pPICZa A載體經Xho I和Not I雙酶切，電泳、
回收，將目的基因重組到PPICZaA中，轉化到大腸桿菌ToplOF’中，進行篩選。轉化有pPICZ a A的大腸桿菌ToplOF’在LB+25ug/mg Zeocin的平板上的進行培養,挑取單菌落，在液體培養基中培養，提取質粒，Xho I和Not I雙酶切檢測或進行α-factor priming和
3AOXl priming PCR檢測，說明pPICZ a A中含有目的基因，可以用來轉化/7ZcAia pastor isX-33, KM71H 或 GS115 宿主菌。設計的textilinin-Ι序列及酶切位點(Xhol/Notl)
Xhol kex2 site Q8008Y
CTCGAGAAAAGAAAGGATAGACCAGATTTTTGTGAATTGCCAGCTGATACTGGTCCATGTAGAGTTAGATTTCCATCTTTTTACTACAACCCAGATGAAAAGAAGTGTTTGGAATTTATTTACGGTGGTTGTGAAGGTAACGCTAACAACTTTATTACTAAGGAAGAATGTGAATCTACTTGTGCTGCTTAAGCGGCCGCNotl實施例2
用DNA限制性內切酶SacI將pPICZ a -Txn-I線性化,按照Invitrogen公司Multi-CopyPichia Expression Kit Version B中的方法制備酵母宿主感受態并進行轉化,將轉化后的細胞涂在YPD+500ug/ml Zeocin培養基上生長，30°C下放置3_4天可出現單菌落。挑選菌落大而飽滿的克隆進行表達篩選。PCR鑒定陽性轉化子(設陽性對照)如圖2所示，其中陽性克隆為2,3,4,8,912 ， 13， 15 ， 14。實施例3
種子液在I. 5L酵母氮源基礎培養基中28°C發酵24小時后轉到30L發酵液中進行發酵培養。培養基H3PO4, 27ml/L; CaS04·2H20，O. 9g/L; K2SO4,18g/L; MgSO4*7H20, 15g/L;KOH, 4. 13g/L;甘油40g/L; 4. 4ml/L微量礦物質溶液。在發酵過程中，用NH4OH調pH值，使其維持在5. O。30°C通氧劇烈攪拌(700rpm)發酵，添加消泡劑。發酵24小時后，加入含12ml/L微量礦物質的50%甘油，溶氧濃度為20%左右，繼續培養10小時。當碳原饑餓30分鐘后，加入甲醇誘導，此時將pH值調到4. 0，表達溫度調到23°C。剛開始的5小時加入甲醇的速率低，不提供氧量，以使酵母適應甲醇，100%甲醇含12ml/L微量礦物質溶液，其溶氧量在20%以上。繼續發酵98小吋，textilinin-1表達量達到O. 4g/L。在其它發酵條件都基本相同的前提下，首先對誘導溫度進行了優化，在同樣pH
6.O的條件下,優化誘導溫度對textilinin-Ι產量的影響,確定了最佳表達溫度為23°C。其次進行了表達階段pH的優化，在同樣溫度條件下，優化pH對textilinin-Ι產量的影響。下面是誘導表達階段溫度和PH優化實驗數據
權利要求
1.ー種具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-l，其氨基酸序列為 KDRPDFCELP ADTGPCRVRF PSFYYNPDEK KCLEFIYGGC EGNANNFITK EECESTCAA,其特征在于，所述具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-l，是通過將人工合成的textilinin-l結構基因在酵母菌中，或者在CHO細胞或其它哺乳動物細胞中，以分泌表達的方式大量產生獲得，其中人工合成textilinin-l結構基因序列為 I AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。
2.—種權利要求I所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于，制備方法為將人工合成的textilinin-l結構基因在酵母菌中，或者在CHO細胞或其它哺乳動物細胞中，以分泌表達的方式大量產生重組textilinin-l,其中人工合成textilinin-l結構基因序列為 I AAG GAT AGA CCA GAT TTT TGT GAA TTG CCA GCT GAT ACT GGT CCA 45 46 TGT AGA GTT AGA TTT CCA TCT TTT TAC TAC AAC CCA GAT GAA AAG 90 91 AAG TGT TTG GAA TTT ATT TAC GGT GGT TGT GAA GGT AAC GCT AAC 135 136 AAC TTT ATT ACT AAG GAA GAA TGT GAA TCT ACT TGT GCT GCT TAA 180。
3.按照權利要求2所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于所述酵母菌為甲醇酵母菌。
4.按照權利要求3所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時，依據textilinin-l的天然氨基酸序列，選擇甲醇酵母菌比較偏好的密碼子，人工合成textilinin-l結構基因序列。
5.按照權利要求3所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時，將人工合成textilinin-l結構基因插入到甲醇酵母菌表達載體/7/Yd或pPICZa 中。
6.按照權利要求3所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于在甲醇酵母菌中實現分泌表達時，利用酵母菌的α_信號肽，PHOl信號肽將重組textilinin-l移出細胞，其中在信號肽序列與textilinin-l序列之間插入KEX2蛋白酶識別序列。
7.按照權利要求2或3所述重組textilinin-l的制備方法，其特征在于其發酵エ藝參數為表達時pH值為3-5，表達溫度為23-25°C。
8.按照權利要求2或3所述重組textilinin-l的制備方法,其特征在于其純化工藝為陽離子交換和陰離子交換。
9.按照權利要求8所述重組textilinin-l的制備方法,其特征在于選用CaptoMMC和Q hp作為純化textilinin-l的填料。
10.權利要求I所述重組textilinin-l在制造止血藥物方面的用途。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種具有抑制纖溶酶活性的重組textilinin-1及其制備方法和應用，通過分泌表達的方式大量生產獲得重組textilinin-1，其具有較高的抑制plasmin的生物活性。該重組textilinin-1可以作為止血藥，用于手術過程中纖維蛋白被纖溶酶溶解導致的失血過多。
文檔編號C07K14/81GK102850451SQ20111017860
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者薛百忠, 徐梅, 楊宇, 張宏杰, 李娜, 劉劍, 邸偉慶, 劉宏大, 王宏英, 薛雁 申請人:遼寧諾康生物制藥有限責任公司