專利名稱：：植物乳桿菌及其所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物領域中一株植物乳桿菌及其所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素。
背景技術：
：食品安全問題是世界范圍內的重要課題，在我國這樣的發展中國家問題尤為突出，近年來我國食源性疾病患者的數目一直居高不下，由微生物引起的食物中毒情況非常嚴重。食源性疾病的持續增加使公眾和政府開始重新審視現行食品防腐方法的有效性。添加化學防腐劑是人類使用的重要食品保藏方法，但經長期的研究發現過量食用合成的防腐劑對血壓、心臟、腎臟等有不良影響，甚至有些化學防腐劑有誘癌性、致畸性和易引起食物中毒等問題。熱殺菌也是食品加工過程中殺滅微生物的重要方法，但對某些低溫制品，如低溫肉制品，加熱溫度過高，其色澤、風味會發生明顯變化，營養價值也大幅降低。其他物理方法如紫外消毒、過濾除菌、鈷60照射法等，對人體無毒害作用，但當包裝打開以后，又有再次染菌而腐敗的可能。因此，開發出廣譜、高效、穩定、安全的天然食品防腐劑是食品工業發展的必然趨勢。細菌素是由某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的蛋白質、多肽或前體多肽；這些物質在達到一定數量時可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物；一般產生細菌素的細菌都存在特異性免疫基因，所產細菌素不會對產生菌本身造成傷害。據報道3099%的細菌和弧菌產生至少一種細菌素。雖然有多種革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌可產生細菌素，但由乳酸菌產生的細菌素作為食品防腐劑更受人們的青睞，因為乳酸菌被認為是安全的(GRAS)，而且大多數產生細菌素的乳酸菌都分離自天然食品，因此它們更適合在食品中應用。乳酸菌細菌素作為一類天然食品防腐劑有廣闊的開發前景。但目前所研究的乳酸菌細菌素主要對革蘭氏陽性細菌有抑制或殺滅作用，對革蘭氏陰性細菌、酵母菌、霉菌及病毒一般沒有抑制作用。因而只能用于抑制革蘭氏陽性細菌引起的食品腐敗，不能抑制由大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性細菌引起的食品腐敗變質。另外許多細菌素，如Msin，在食品中應用抑菌活性不太穩定，在pH中性時活性喪失，限制了其在食品工業中的發展，所以有必要大力發展其他細菌素，開發出廣譜、高效、對熱和PH等穩定的新型乳酸菌細菌素，加速細菌素在食品工業中的應用，提高食品的質量和安全。細菌素與臨床抗生素在生物合成、作用機制、抑菌譜等方面明顯不同，到目前為止沒有發現人體對細菌素具有明顯抗性，而且細菌素可以安全、有效地使用以達到控制目標病原微生物生長的目的。所以乳酸菌細菌素在醫學領域也將具有良好的應用前景。
發明內容本發明的目的是提供一株植物乳桿菌及其所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素，這種植物乳桿菌細菌素抑菌譜廣，對熱和PH穩定。上述目的通過以下技術方案實現一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，已于2009年06月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCCNo.3151，地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所。所述的植物乳桿菌KLDS1.0391從內蒙古傳統乳制品“焦克”中分離得到。在MRS培養基上，菌落為乳白色圓形，中間隆起，邊緣整齊，菌體兩端鈍圓、短小直桿，菌體大小0.40.7μπιΧ23μπι，為無芽孢革蘭氏陽性桿菌，API50CHL糖醇發酵試驗、16SrRNA序列同源性分析試驗和recA基因多重PCR方法鑒定該菌為植物乳桿菌。一種上述植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391為生產菌株，采用改良MRS培養基，進行發酵、純化后用M0DIA-T0F質譜測定得到植物乳桿菌細菌素的分子量為2180Da。所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，所述的改良MRS培養基的組成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸錳、乙酸鈉、檸檬酸氫二氨、硫酸鎂、K2HPO4·3Η20、蒸餾水，其質量百分含量為胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸錳0.025%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸氫二氨0.2%、硫酸鎂0.058%,K2HPO4·3H200.2%、蒸餾水95.417%。所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，所述的發酵條件為發酵溫度30°C，恒pH5.0，發酵時間241!。所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，所述的純化按以下步驟進行將上述發酵得到的發酵液離心，取上清液，向所述的上清液中加入飽和硫酸銨，至硫酸銨飽和度為70%，4°C攪拌過夜，離心取沉淀得到含有細菌素的沉淀物；將該沉淀物復溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝膠層析柱層析，所述層析條件為緩沖液為PH5.0的0.05ml/L乙酸鈉和0.lmol/L的氯化鈉混合液，流速3ml/min，90min96min出現的蛋白峰為細菌素活性峰；將該細菌素活性峰收集液凍干濃縮后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色譜柱進一步純化，所述反向層析條件為緩沖液A為5%的乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，洗脫緩沖液B為90%乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，線性梯度洗脫，34.5min35min出現的蛋白峰為細菌素活性峰；將該細菌素活性峰用截流分子量為IOOODa的透析袋透析即得到植物乳桿菌細菌素。本發明的有益效果1.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391產生的細菌素對熱和pH穩定，在121°C熱處理30min后活性不變，在pH210范圍內活性穩定。可被胃蛋白酶和胰蛋白酶降解，可被木瓜蛋白酶、蛋白酶K和α-糜蛋白酶部分失活，不能被α-淀粉酶失活。作用方式是殺菌，兩小時內能殺滅90%以上的指示菌。KLDS1.0391產生細菌素的抑菌譜廣，可抑制乳酸菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌；沙門氏菌、假單胞菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌。該植物乳桿菌細菌素在體內抑制沙門氏菌試驗證明該細菌素可在小鼠體內有效抑制鼠傷寒沙門氏菌的生長，對鼠傷寒沙門氏菌造成的疾病具有緩解作用。植物乳桿菌細菌素具有很好的熱和PH穩定性及較高的安全性，作為食品防腐劑具有良好的應用前景，另外在醫藥和飼料工業也會有很好的應用前景。具體實施例方式實施例1:一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，已于2009年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為=CGMCCNo.3151。所述的植物乳桿菌KLDS1.0391從內蒙古傳統乳制品“焦克”中分離得到。在MRS培養基上，菌落為乳白色圓形，中間隆起，邊緣整齊，菌體兩端鈍圓、短小直桿，菌體大小0.40.7μπιΧ23μπι，為無芽孢革蘭氏陽性桿菌，API50CHL糖醇發酵試驗、16SrRNA序列同源性分析試驗和recA基因多重PCR方法鑒定該菌為植物乳桿菌。實施例2一種上述植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391為生產菌株，采用改良MRS培養基，進行發酵、純化后用M0DIA-T0F質譜測定得到植物乳桿菌細菌素的分子量為2180Da。具體步驟為1.對植物植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDSl.0391的抑菌活性分析抑菌活性分析方法抑菌活性測定采用瓊脂擴散法。1.2%的素瓊脂，按每平皿IOmL傾倒在無菌平皿中晾干；制備含0.7%瓊脂的營養瓊脂培養基，冷至50°C左右，每IOOmL接入0.6mL過夜培養的鼠傷寒沙門氏菌菌液，在底層有瓊脂的平皿上傾倒6mL含有指示菌的軟瓊脂培養基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培養基上打孔，孔直徑6mm；在孔中加入50μL無細胞發酵上清液，超凈工作臺上放置3小時；置于適宜培養條件下進行培養；用游標卡尺測量抑菌圈直徑。2.細菌素的生產將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391使用改良的MRS培養基發酵，所述的改良MRS培養基的組成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸錳、乙酸鈉、檸檬酸氫二氨、硫酸鎂、K2HPO4·3H20、蒸餾水，其質量百分含量為胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸錳0.025%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸氫二氨0.2%、硫酸鎂0.058%、K2HPO4·3H200.2%、蒸餾水95.417%。發酵條件為發酵溫度30°C，恒pH5.0，發酵時間24h。發酵液12000Xg，4°C離心15min,上清液加入3mol/L氫氧化鈉中和至中性，pH6.57.0，經0.22μm的濾膜過濾排除剩余菌體細胞制成無細胞發酵上清液以鼠傷寒沙門氏菌為指示菌進行(1)和(2)的實驗。(1)排除過氧化氫的干擾過氧化氫酶溶解在0.02mol/L的無菌水中配成母液，力口入無細胞發酵上清液中使過氧化氫酶的終濃度為5.0mg/ml，37°C水浴2h后取出，檢測過氧化氫酶處理后無細胞發酵上清液的抑菌活性，用加入等量水的無細胞發酵上清液做對照，比較處理樣品與對照樣品的抑菌圈差異。(2)蛋白類抑菌物質的確定蛋白酶K用無菌水配成母液，加入無細胞發酵上清液中，使蛋白酶K終濃度達到1.Omg/ml，混勻后37°C水浴2h后取出，檢測處理后發酵液的抑菌活性，用加入等量無菌水的無細胞發酵上清液做對照，比較處理樣品與對照樣品的抑菌圈差異。(3)蛋白和多肽的初步分離將飽和度為100%的硫酸銨加入無細胞發酵上清液中，使硫酸銨終濃度達到70%。樣品在4°C條件下用磁力攪拌器最小轉速攪拌過夜，10000Xg，4°C離心30min，沉淀溶于1/40體積0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)，然后檢測抑菌活性。上述不同處理對抑菌活性的影響結果如下無細胞發酵上清液經過氧化氫酶處理后，抑菌圈直徑無明顯變化處理前10.45mm,處理后10.43mm；蛋白酶K作用后，不能產生清晰抑菌圈，用硫酸銨鹽析沉淀后的樣品抑菌圈達到16.14mm。表明發酵上清液經排除菌體細胞、酸和過氧化氫等干擾因素，并進行了初步的蛋白質分離后，仍有抑菌活性，說明該抑菌活性是由蛋白類物質引起的，從而判定植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391產生的抑菌物質為細菌素。3.細菌素的分離純化將上述發酵液經12000Xg，4°C離心15min，收集上清液，上清液用0.22μm濾膜過濾，除去菌體及其它雜質。無細胞發酵上清液用瓊脂擴散法測定細菌素抑菌活性。1.2%的素瓊脂，按每平皿IOmL傾倒在無菌平皿中晾干；制備含0.7%瓊脂營養瓊脂培養基，冷至50°C左右，每IOOmL接入0.6mL過夜培養的鼠傷寒沙門氏菌菌液，在底層有瓊脂的平皿上傾倒6mL含有指示菌的軟瓊脂培養基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培養基上打孔，孔直徑6mm；在孔中加入50μL無細胞發酵上清液，超凈工作臺上放置3小時；置于適宜培養條件下進行培養。用游標卡尺測量抑菌圈直徑，或將細菌素樣品用0.025mol/L的乙酸鈉溶液二倍稀釋(PH6.5)，取樣50μL進行實驗，觀察不到抑菌圈出現的最高稀釋度定義為一個活力單位(IAU)，其倒數即為細菌素效價值AU/ml。無細胞發酵上清液80°C處理IOmin防止細菌素降解，用飽和度為70%的硫酸銨鹽析，在4°C條件下用磁力攪拌器最小轉速攪拌過夜，10000Xg，4°C離心30min，沉淀溶于1/40體積0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)。將該含有細菌素的沉淀物復溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝膠層析柱層析純化；所述層析條件為緩沖液為pH5.0的0.05ml/L乙酸鈉和0.lmol/L的氯化鈉混合液，流速3ml/min,90min96min出現的蛋白峰為細菌素活性峰。將該細菌素活性峰收集液凍干濃縮后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色譜柱進一步純化；所述反相層析條件為緩沖液A為5%的乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，洗脫緩沖液B為90%乙腈水溶液(加入0.的三氟乙酸)，線性梯度洗脫，34.5min35min出現的蛋白峰為細菌素活性峰。將該細菌素活性峰用截流分子量為IOOODa的透析袋透析；透析后用M0DIA-T0F質譜測定得到該細菌素的分子量。各步純化后得到的細菌素的結果如表1所示，細菌素的分子量為2180Da。表1植物乳桿菌細菌素的分離純化結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4.細菌素的活性測試菌株選擇有代表性的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株39株，見表2，測定了植物乳桿菌細菌素粗提物對這些菌株的抑菌活性。表2測試菌株及來源<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用步驟2的抑菌活性分析方法，即分別將測試菌加入到適宜其生長的軟瓊脂培養基中，在底層有瓊脂的平皿上傾倒6mL含有指示菌的軟瓊脂培養基晾干；用打孔器在涂有指示菌的培養基上打孔，孔直徑6mm；在孔中加入50μL細菌素粗提液，超凈工作臺上放置3小時；置于適宜培養條件下進行培養。用游標卡尺測量抑菌圈直徑。細菌素粗提液為用飽和度為70%的硫酸銨鹽析無細胞發酵上清液，在4°C條件下用磁力攪拌器最小轉速攪拌過夜，10000Xg，4°C離心30min，沉淀溶于1/40體積0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)得到的細菌素樣品。試驗結果如表3所示，表明植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391的抑菌譜很廣，不僅可抑制乳酸菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌等革蘭氏陽性細菌，而且能抑制沙門氏菌、大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性細菌。表3植物乳桿菌細菌素的抑菌譜<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>5.細菌素的特性采用步驟3的純化方法，無細胞發酵上清液80°C處理IOmin后用飽和度為70%的硫酸銨鹽析，在4°C條件下用磁力攪拌器最小轉速攪拌過夜，10000Xg，4°C離心30min，沉淀溶于1/40體積0.02mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH6.5)。將該含有細菌素的沉淀物復溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝膠層析柱層析純化；所述層析條件為緩沖液為pH5.0的0.05ml/L乙酸鈉和0.lmol/L的氯化鈉混合液，流速3ml/min，90min96min出現的蛋白峰為細菌素活性峰，取該活性峰收集液調蛋白濃度為lmg/ml作為細菌素純化液。(1)對溫度的穩定性將細菌素純化液分別取Iml加入到小離心管中，分別在60°c、80°c、10(rc和121°c保持30min，用冰冷卻后做抑菌實驗，用未加熱的細菌素粗提液作對照，測其抑菌活性。結果表明，60800C、100°C和121°C處理30min抑菌圈直徑均未發生明顯變化，見表4，說明細菌素對熱穩定。(2)對pH的穩定性將細菌素純化液分別取Iml加入到小離心管中，分用3mol/L的NaOH和HCl將細菌素的pH調為2、3、4、5、6、7、8、9、10，37°C溫浴72h后將pH調回6.5，然后測定抑菌活性，結果表明，細菌素對酸和堿有一定耐受作用，見表4。(3)對蛋白酶的敏感性將細菌素純化液分別取Iml加入到小離心管中，調pH到各蛋白酶的最適作用PH，其中胃蛋白酶和木瓜蛋白酶調到2.0，胰蛋白酶和中性蛋白酶調到7.0，α-糜蛋白酶調到7.5，堿性蛋白酶調到8.0。按終濃度lmg/ml加入各蛋白酶后，37°C下溫育2h。將pH調回到6.5，做抑菌實驗，用未加蛋白酶處理的細菌素純化液做對照。結果表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶可使細菌素完全失活，木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶中性蛋白酶和堿性蛋白酶使細菌素部分失活，見表4。表4植物乳桿菌素對溫度、PH和蛋白酶的穩定性抑菌活力(抑菌圈直徑單位mm)溫度+時間KLDS1.0391pHKLDS1.0391酶(lmg/mL)KLDS1.0391未加熱處理13。88士0,24PH2.012.59±0.27未加酶13.87±0.2260°C30min13,89土0.32pH3.012.81士0.39胃蛋白酶一80°C30min13.89士0.20PH4.013.41士0.40胰蛋白酶—IOOOSOmin13.87土0,33pH5.013.64士0.11木瓜蛋白酶10.15士0.2712rC30min13.88±0.28PH6.013.73±0.39蛋白酶K10.21士0.20pH7.013.69士0.24α-糜蛋白酶10.51士0.51ΡΗ8.013.61士0.24中性蛋白酶10.78±0.42ΡΗ9.013.16士0.33堿性蛋白酶10.42士0.35pH10.013.05士0.34由此可見，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391產生的細菌素對熱和pH穩定，在121°C處理30min后活性基本不變，在pH210范圍內活性穩定，可被胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶失活。實施例3應用植物乳桿菌細菌素抑制由沙門氏菌引起的疾病1.試驗動物清潔級昆明種小鼠112只，雌雄各半，體重1822g，飼喂小鼠全價顆粒料，室溫控制在1822°C，相對濕度60%70%，人工晝夜(12h白晝，12h黑夜)。2.試驗方法(1)沙門氏菌感染小鼠小鼠買回后適應性飼養3天進行試驗，每只小鼠注射0.3ml2X108cfu/ml的鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028，此劑量可使小鼠感染但并不足以使小鼠在4h內死亡。(2)分組和劑量注射沙門氏菌后的小鼠分成3個細菌素劑量組、一個陽性對照組和一個空白對照組，每組雌雄各8只。小鼠染毒4小時后開始治療，細菌素低劑量組80mg/kg體重，細菌素中劑量組400mg/kg體重，細菌素高劑量組2000mg/kg體重，以上各組通過灌胃注入到小鼠體內。陽性對照組注射80mg/kg頭孢唑林鈉，空白對照組不投藥，各組小鼠以相同投藥濃度治療7天。試驗期間各組小鼠均自由飲水，自由采食，觀察小鼠的每日采食量、外觀體征(包括被毛光澤、精神狀態、呼吸動作、分泌物、排泄物、飲食、活動、行為等)、異常表現和中毒癥狀等。分別于給藥后的第8天進行各項指標的測定，測定指標如下各組試驗小鼠存活情況。細菌素治療感染沙門氏菌小鼠各臟器中沙門氏菌的變化情況取各組小鼠的血液、肝臟、脾臟、回腸和結腸按重量比19加入到無菌水中，勻漿后稀釋涂布HE瓊脂平板，檢測各組小鼠臟器中沙門氏菌的變化情況。血常規檢驗檢驗紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)數、白細胞分類計數、血紅蛋白(HGB)含量、紅細胞比積(HCT)、紅細胞體積(MCV)血紅蛋白含量(MCH)等。血液生化指標檢查測定血清谷丙轉氨酶(GPT)、谷草轉氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、血糖(Glu)、血清白蛋白(TP)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH)和甘油三酯(TG)等指標。3.試驗結果(1)各組小鼠存活情況感染鼠傷寒沙門氏菌后，各組小鼠均有發燒畏寒等癥狀，感染8小時后小鼠出現死亡，試驗一周后各組小鼠的存活情況見表5。表5細菌素對感染沙門氏菌小鼠的存活情況<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表5可以看出，各劑量組細菌素治療感染沙門氏菌小鼠一周后，小鼠的存活率與空白對照組相比都有明顯提高，隨著細菌素劑量升高，其存活率也有所上升。但細菌素各劑量組都有小鼠死亡，說明細菌素不能完全治療由沙門氏菌引起的感染。(2)細菌素治療感染沙門氏菌小鼠各臟器中沙門氏菌的變化情況細菌素治療感染沙門氏菌的小鼠一周后，小鼠血液、肝臟、脾臟、十二指腸、回腸、結腸、糞便中的沙門氏菌數量明顯少于未治療組，高劑量組與頭孢唑林鈉治療組小鼠體內的活菌數相當，見表6。表6細菌素治療感染沙門氏菌小鼠各臟器中沙門氏菌菌數變化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注同行腳標不同表示差異顯著。(3)細菌素治療感染沙門氏菌小鼠的血常規指標變化除低劑量組小鼠紅細胞分布寬度變異系數外，存活小鼠的各項血常規指標均未發生明顯變化，見表7。表7細菌素治療感染沙門氏菌小鼠的血常規指標變化<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注同行腳標不同表示差異顯著。(4)細菌素治療后小鼠的血液生化指標變化感染沙門氏菌的小鼠用細菌素治療后，從中劑量組開始包括陽性對照組小鼠的谷丙轉氨酶升高，可能是細菌素和藥物治療加重了肝臟的負擔。用細菌素治療后小鼠的總蛋白、白蛋白和甘油三酯含量開始恢復，見表8。表8細菌素治療感染沙門氏菌小鼠的血液生化指標變化<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由以上可以看出，用細菌素治療感染鼠傷寒沙門氏菌的小鼠后，小鼠治愈率提高，存活小鼠血液、肝臟、脾臟、十二指腸、回腸、結腸、糞便中鼠傷寒沙門氏菌菌數明顯減少。小鼠的各項血常規指標和生化指標無明顯變化，說明植物乳桿菌細菌素可以緩解由沙門氏菌引起的病變。權利要求一株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391，其特征是已于2009年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.3151。2.根據權利要求1所述的植物乳桿菌KLDS1.0391，其特征是從內蒙古傳統乳制品“焦克”中分離得到，在MRS培養基上，菌落為乳白色圓形，中間隆起，邊緣整齊，菌體兩端鈍圓、短小直桿，菌體大小0.40.7μmX23μm，為無芽孢革蘭氏陽性桿菌，API50CHL糖醇發酵試驗、16SrRNA序列同源性分析試驗和recA基因多重PCR方法鑒定該菌為植物乳桿菌。3.一種根據權利要求1或2所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，其特征是以所述的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391為生產菌株，采用改良MRS培養基，進行發酵、純化后用M0DIA-T0F質譜測定得到植物乳桿菌細菌素的分子量為2180Da。4.根據權利要求3所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，其特征是所述的改良MRS培養基的組成包括胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、Tween-80、硫酸錳、乙酸鈉、檸檬酸氫二氨、硫酸鎂、K2HPO4·3H20、蒸餾水，其質量百分含量為胰蛋白胨0.5%、蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、Tween-800.1%、硫酸錳0.025%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸氫二氨0.2%、硫酸鎂0.058%,K2HPO4·3H200.2%、其余為蒸餾水。5.根據權利要求3或4所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，其特征是所述的發酵條件為發酵溫度30°C，恒pH5.0，發酵時間24h。6.根據權利要求3或4所述的植物乳桿菌所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素的制備方法，其特征是所述的純化按以下步驟進行將上述發酵得到的發酵液離心，取上清液，向所述的上清液中加入飽和硫酸銨，至硫酸銨飽和度為70%，4°C攪拌過夜，離心取沉淀得到含有細菌素的沉淀物；將該沉淀物復溶后首先用Hiload26/60superdex75prepgrade凝膠層析柱層析，所述層析條件為緩沖液為PH5.0的0.05ml/L乙酸鈉和0.lmol/L的氯化鈉混合液，流速3ml/min，90min-96min出現的蛋白峰為細菌素活性峰；將該細菌素活性峰收集液凍干濃縮后用SOURCE5RPCST4.6/150反相色譜柱進一步純化，所述反向層析條件為緩沖液A為5%的乙腈水溶液加入0.1%的三氟乙酸，洗脫緩沖液B為90%乙腈水溶液加入0.的三氟乙酸，線性梯度洗脫，34.5min35min出現的蛋白峰為細菌素活性峰；將該細菌素活性峰用截流分子量為IOOODa的透析袋透析即得到植物乳桿菌細菌素。全文摘要一株植物乳桿菌及其所產的可抑制革蘭氏陰性菌的細菌素，該細菌素抑菌譜廣，對熱、pH穩定，可被蛋白酶降解，不會在人體內殘留，安全性高。本發明的菌株于2009年6月29日保藏，保藏號為CGMCCNo.3151，生產菌株從內蒙古傳統乳制品“焦克”中分離得到，在MRS培養基上，菌落為乳白色圓形，中間隆起，邊緣整齊，菌體兩端鈍圓、短小直桿，菌體大小0.4～0.7μm×2～3μm，為無芽孢革蘭氏陽性桿菌，API50CHL糖醇發酵試驗、16SrRNA序列同源性分析試驗和recA基因多重PCR方法鑒定該菌為植物乳桿菌。以所述的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)KLDS1.0391為生產菌株，采用改良MRS培養基，進行發酵、純化后得到植物乳桿菌細菌素。本發明用于食品防腐劑。文檔編號C07K14/335GK101812414SQ20091007265公開日2010年8月25日申請日期2009年8月6日優先權日2009年8月6日發明者孟祥晨,王輝,貢漢生申請人:東北農業大學