專利名稱：多肽、基質、水凝膠以及使用它們進行組織再生和修復的方法
多肽、基質、水凝膠以及使用它們進行組織再生和修復的方
法技術領域和
背景技術：
本發明在其一些實施方案中涉及包含新型層粘連蛋白多肽的組合物，更具體涉及 但不唯獨涉及包含該組合物的基質和水凝膠以及使用該組合物的方法。水合凝膠(水凝膠)在生理溫度和pH下是粘稠、半固體物質，其可用于組織工程、 再生醫學和用作生物材料。例如，水凝膠是從多糖(Coviello等人，2007)如透明質酸(例 如使用透明質酸與磷酸鈣、殼聚糖、明膠或藻酸鹽的混雜組合)或殼聚糖(例如殼聚糖與層 粘連蛋白肽；Suzuki等人，2003 ；Itoh等人，2005 ；Matzuda等人，2005 ；Ho等人，2005)以及 從合成材料如聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)制備。透明質酸基水凝膠為細胞和組織(如為 神經再生)提供生長支持環境(Suzuki等人，2003 ;Itoh等人，2005)，同時指導營養劑和抗 氧化劑的遷移和再生。層粘連蛋白是基膜糖蛋白，其充當黏附分子介導細胞骨架結合的整聯蛋白、鈣黏 著蛋白、細胞黏附分子(CAMs)和胞外基質(ECM)組分并與它們相互作用，并支持細胞遷移、 附著、增殖、分化和存活。用層粘連蛋白修飾的透明質酸劑水凝膠被證明能促進神經突延伸 (Hou等人，2005)。某些層粘連蛋白序列重復被發現對細胞表面受體具有生物活性。這些 序列重復包括IKVAV (SEQ ID NO 1) ^P YIGSR(SEQ IDNO :2)，它們充當遷移、再生和生長的 “導軌”(Tashiro 等人，1989 ；Powell 和 Kleinmann，1997 ；Niece 等人，2003 ；HalImann 等人， 2005)。針對氧化脅迫的主要防御機制是超氧化物歧化酶(SOD)，其催化超氧化物陰離子 自由基((V)歧化成過氧化氫(H2O2)和氧(O2)。包含來自牛紅細胞、與透明質酸鈉綴合的 SOD的水凝膠被發現在小鼠中沒有免疫原性，且顯示出比單獨的透明質酸和SOD高得多的 抗炎活性(Sekurai等人，1997)。另外，還發現SOD不僅能抑制活性氧中間體(ROS)的誘導， 而且能抑制由機械脅迫引起的HA解聚作用(Yamazaki等人，2003)。另外的背景技術包括Hartman JR.，1986 (Proc. Natl. Acad. Sci. 83 :7142_7146)。發明概述本發明一些實施方案的一個方面提供包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的多 肽。本發明一些實施方案的一個方面提供包含多糖和本發明多肽的組成物。本發明一些實施方案的一個方面提供包含透明質酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑 的組成物。本發明一些實施方案的一個方面提供包含透明質酸、超氧化物歧化酶(SOD)和本 發明多肽的組成物。本發明一些實施方案的一個方面提供包含本發明組成物的基質。本發明一些實施方案的一個方面提供包含本發明組成物的水凝膠。本發明一些實施方案的一個方面提供產生水凝膠的方法，該方法包括將本發明組 成物懸浮于水中以獲得包含至少80%水的懸浮液，從而產生水凝膠。
本發明一些實施方案的一個方面提供誘導組織的離體形成的方法，該方法包括 (a)提供本發明的基質或水凝膠；(ii)用處于適合細胞的增殖、分化和/或遷移的培養基中 的細胞接種該基質或水凝膠，從而誘導組織的形成。本發明一些實施方案的一個方面提供誘導組織的體內形成的方法，該方法包括將 本發明的基質或水凝膠植入受試者體內，從而誘導組織的形成。本發明一些實施方案的一個方面提供治療具有以組織患病、損傷或損失為特征的 病狀的受試者的方法，該方法包括將本發明的基質或水凝膠植入在受試者的患病、損傷或 損失的組織處或附近，從而誘導組織的形成和治療受試者。根據本發明的一些實施方案，多糖是透明質酸。根據本發明的一些實施方案，組成物還包含抗氧化劑。根據本發明的一些實施方案，抗氧化劑是超氧化物歧化酶(SOD)。根據本發明的一些實施方案，層粘連蛋白多肽為SEQ ID N0:3所示。根據本發明的一些實施方案，層粘連蛋白多肽由SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列 組成。根據本發明的一些實施方案，超氧化物歧化酶包含SEQ ID NO 4所示的氨基酸序 列。根據本發明的一些實施方案，組成物是經交聯的。根據本發明的一些實施方案，多糖、抗氧化劑和/或多肽是經交聯的。根據本發明的一些實施方案，透明質酸、超氧化物歧化酶(SOD)和多肽是經交聯 的。根據本發明的一些實施方案，該方法還包括將組成物進行交聯。根據本發明的一些實施方案，交聯是用選自EDC-N_(3-二甲基(dimenthy)-氨基 丙基(amin0pr0phyl))-N-乙基碳二亞胺、DVS-二乙烯基砜和京尼平的交聯劑來實現。根據本發明的一些實施方案，懸浮液包含至少95%水。根據本發明的一些實施方案，透明質酸以在水凝膠中約0. 5-1. 5%的濃度范圍提{共。根據本發明的一些實施方案，多肽以在水凝膠中約20-100yg/ml的濃度范圍提{共。根據本發明的一些實施方案，超氧化物歧化酶以在水凝膠中約5_40μ g/ml的濃 度范圍提供。根據本發明的一些實施方案，基質或水凝膠還包含細胞。根據本發明的一些實施方案，組織是神經組織。根據本發明的一些實施方案，細胞是干細胞。根據本發明的一些實施方案，干細胞當接種在基質或水凝膠中時分化成神經元細 胞。根據本發明的一些實施方案，水凝膠為凍干形式。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和/或科學術語的含義與本發明所屬技 術領域普通技術人員通常理解的含義相同。下文描述的是示例性的方法和/或材料，不過 與本文所述的這些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于實施或試驗本發明的實施方案。如有沖突，將以本發明說明書(包括定義在內)為準。另外，材料、方法和實施例 僅僅旨在說明本發明，并不表示必定限制本發明。


本文僅以舉例的方式參照以下附圖描述了本發明的一些實施方案。現將具體詳細 地說明附圖，不過要強調的是附圖所示的細節僅以舉例方式給出，目的是對本發明的實施 方案進行說明性討論。這樣，將說明書與附圖相結合，能使本領域技術人員清楚明白如何可 以實施本發明的實施方案。本專利或申請文件含有至少一張彩色制作的圖畫。在提出請求并支付必要費用 后，專利局可提供帶彩色圖畫的本專利或專利申請公開說明書的拷貝。附圖中圖1是現有技術的示意圖，描繪了超氧化物歧化酶(SOD)同源物的氧化還原活性 位點，該位點包括包圍著催化活性金屬陽離子(在這里是銅Cu)的三個組氨酸殘基(His 26、74和163)和一個天冬氨酸殘基(Asp 159)。另選的金屬陽離子有鋅(Zn)、錳(Mn)和鐵 (Fe)。圖2A-F是各種培養條件下用博迪恩氏膠體銀染色法(圖2A-C)或結晶紫染色法 (圖2D-F)進行染色的原代細胞的顯微照片。衍自大鼠胚胎(妊娠16-18天)的大腦半球 的原代胎鼠腦細胞在塑料平皿上在Eagle培養基(補加2mM谷氨酰胺和5mg/ml葡萄糖的 Eagle基礎培養基)存在下培養3天，然后用水凝膠[1. 2%透明質酸水凝膠(圖2B)或透 明質酸超氧化物歧化酶_層粘連蛋白肽(SEQ ID NO 3)水凝膠(圖2C-F)]或用Eagle培 養基覆蓋細胞，再培養12天后進行染色和拍照。圖2A-在Eagle培養基存在下培養的用 博迪恩氏膠體銀染色法進行染色的原代細胞。注意細胞為單層，不存在分化細胞的聚集體 (放大倍數，xlOO)；圖2B-用1.2%透明質酸水凝膠覆蓋和用博迪恩氏膠體銀染色法進行 染色的原代細胞。注意細胞聚集體(放大倍數，xlOO)；圖2C-用透明質酸-超氧化物歧化 酶-層粘連蛋白肽(SEQ ID NO :3)水凝膠覆蓋和用博迪恩氏膠體銀染色法進行染色的原代 細胞。注意分化的神經元細胞，為典型的神經元生長，細胞結合成聚集體和聚結體，具有密 集的軸突出芽(放大倍數，x200)。圖2D-F-用透明質酸-超氧化物歧化酶-層粘連蛋白肽 (SEQ ID NO 3)水凝膠覆蓋下生長和用結晶紫染色法進行染色的原代細胞。注意具有密集 的軸突出芽的分化神經元細胞。圖2D和E的放大倍數為x200，圖2F的放大倍數為x400。圖3是描繪本發明的新型層粘連蛋白肽的序列(SEQ ID NO 3)的示意圖，該序列 由兩個分別包含SEQ ID NO :1和2所示的氨基酸序列(以紅色顯示)的五肽(加框表示的 序列)和以下3個另外的二聚體組成在N末端位置的二聚體(KS)、在兩個五肽之間的第 二二聚體(RS)和在尾部羧基末端的第三二聚體(CV)。本發明具體實施方案的描述本發明在其一些實施方案中涉及包含新型層粘連蛋白多肽的組合物，更具體涉及 但不唯獨涉及包含該組合物的基質和水凝膠以及使用該組合物進行組織形成、再生和/或 修復的方法。在詳細說明本發明的至少一個實施方案之前，應理解本發明在其應用上并不一定 局限于以下描述中提出的或實施例所例示的細節內容。本發明還能有其他的實施方案，或者能以多種方式實施或執行。本發明人在將本發明付諸實施時設計了能夠支持細胞(如神經元細胞)的增殖、 分化和/或遷移的新型層粘連蛋白多肽(SEQ ID NO :3)。該新型層粘連蛋白多肽包括兩個 層粘連蛋白五肽IKVAV(SEQ IDNO 1)和YIGSR(SEQ ID NO 2)以及以下三個被設計作為潛 在的交聯位點的二聚體在N末端位置的二聚體(KS)、在兩個五肽之間的第二二聚體(RS) 和在羧基末端的第三二聚體(CV)。因此，如下文的實施例部分所示，本發明人產生了包含新型層粘連蛋白多肽和抗 氧化劑(超氧化物歧化酶)的多糖(透明質酸)_基水凝膠。該水凝膠當與干細胞混合時 能夠誘導神經元細胞分化(實施例2和圖2C-F)。相反，沒有新型層粘連蛋白多肽的透明質 酸基水凝膠不能支持神經元細胞分化(實施例2，圖2B)。另外，用京尼平對水凝膠組分進 行交聯并沒有降低水凝膠支持細胞增殖和分化的能力(實施例2)。因此，本發明的一個方面提供包含SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的分離多肽。術語“多肽”或“肽”在本文中可互換使用，涵括天然肽(降解產物、合成法合成的 肽或重組肽)和模擬肽(通常為合成法合成的肽)以及作為肽類似物的擬肽和半擬肽，所 述肽類似物可具有例如能使肽在體內時更穩定或更能夠滲透到細胞中的修飾。這種修飾包 括但不限于N末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 =C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH或CF = CH)、主鏈修飾和殘基修飾。制備模擬 肽化合物的方法是本領域公知的，在例如Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd., Chapter 17. 2，F. Choplin Pergamon Press (1992)中有詳細說明，該文獻通過引用并入本 文，猶如在本文中全文給出。這個方面的更多細節在下文提供。肽當中的肽鍵(-C0-NH-)可例如被以下的鍵取代N-甲基化鍵(_N(CH3)_C0_)、酯 鍵(-C (R) H-C-O-O-C (R) -N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、α -氮雜鍵(-ΝΗ-Ν (R) -C0-)，其中 R為任何烷基，例如甲基、carba鍵(-CH2-NH-)、羥亞乙基鍵(-CH(OH) -CH2-)、硫代酰胺鍵 (-CS-NH-)、烯烴雙鍵(-CH = CH-)、反酰胺鍵(-NH-C0-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-)，其中 R為天然呈現在碳原子上的“正常”側鏈。這些修飾可出現在肽鏈上的任何鍵，甚至同時出現在幾個(2-3個)鍵。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可用合成的非天然酸如TIC、萘基丙氨酸(Nol)、 Phe的環甲基化衍生物、Phe的鹵化衍生物或ο-甲基-Tyr取代。除以上之外，本發明的肽還可包括一個或多個修飾氨基酸或一個或多個非氨基酸 單體(例如脂肪酸、復合碳水化合物等)。術語“氨基酸”理解為包括20個天然氨基酸；常在體內進行翻譯后修飾的氨基酸， 例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他非常見氨基酸，包括但不限于2-氨基 己二酸、羥賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。此外，術語“氨基酸”包括D-和 L-氨基酸。下表1和2列出了可用于本發明的天然氨基酸(表1)或修飾氨基酸(例如合成 氨基酸，表2)。表 權利要求
一種多肽，其包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列。
2.一種組成物，其包含多糖和權利要求1的多肽。
3.權利要求2的組成物，其中所述多糖是透明質酸。
4.權利要求2的組成物，其還包含抗氧化劑。
5.一種組成物，其包含透明質酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑。
6.權利要求4或5的組成物，其中所述抗氧化劑是超氧化物歧化酶(SOD)。
7.權利要求5的組成物，其中所述層粘連蛋白多肽為SEQIDNO :3所示。
8.一種組成物，其包含透明質酸、超氧化物歧化酶(SOD)和權利要求1的多肽。
9.權利要求6或8的組成物，其中所述超氧化物歧化酶包含SEQIDNO :4所示的氨基 酸序列。
10.權利要求2-7和9中任一項的組成物，其中所述多糖、所述抗氧化劑和/或所述多 肽是交聯的。
11.權利要求8的組成物，其中所述透明質酸、所述超氧化物歧化酶(SOD)和所述多肽 是交聯的。
12.—種基質，其包含權利要求2-11中任一項的組成物。
13.—種水凝膠，其包含權利要求2-11中任一項的組成物。
14.一種產生水凝膠的方法，所述方法包括將權利要求2-9中任一項的組成物懸浮于 水中以獲得包含至少80%水的懸浮液，從而產生水凝膠。
15.權利要求14的方法，其還包括使所述組成物交聯。
16.權利要求15的方法，其中所述交聯是用選自EDC-N-(3- 二甲氨基丙基)-N-乙基碳 二亞胺、DVS- 二乙烯基砜和京尼平的交聯劑來實現。
17.權利要求14的方法，其中所述懸浮液包含至少95%水。
18.權利要求13的水凝膠或權利要求14的方法，其中所述透明質酸以在所述水凝膠中 約0. 5-1. 5%的濃度范圍提供。
19.權利要求13的水凝膠或權利要求14的方法，其中所述多肽以在所述水凝膠中約 20-100 μ g/ml的濃度范圍提供。
20.權利要求13的水凝膠或權利要求14的方法，其中所述超氧化物歧化酶以在所述水 凝膠中約5-40 μ g/ml的濃度范圍提供。
21.權利要求12的基質或權利要求13的水凝膠，其還包含細胞。
22.—種誘導組織的離體形成的方法，其包括(a)提供權利要求12的基質或者權利要求13、18、19和20中任一項的水凝膠，和；( )用在適于所述細胞的增殖、分化和/或遷移的培養基中的細胞接種所述基質或所 述水凝膠，從而誘導組織的形成。
23.一種誘導組織的體內形成的方法，所述方法包括將權利要求12的基質或者權利要 求13、18、19和20中任一項的水凝膠植入受試者體內，從而誘導組織的形成。
24.一種治療具有以組織患病、損傷或損失為特征的病狀的受試者的方法，所述方法包 括將權利要求12的基質或者權利要求13、18、19和20中任一項的水凝膠植入在受試者的 患病、損傷或損失的組織處或附近，從而誘導組織的形成和治療受試者。
25.權利要求22、23或24的方法，其中所述組織是神經組織。
26.權利要求21的基質或水凝膠，或者權利要求22的方法，其中所述細胞是干細胞。
27.權利要求26的基質、水凝膠或方法，其中所述干細胞當接種在所述基質或所述水 凝膠中時分化成神經元細胞。
28.權利要求13、18、19和20中任一項的水凝膠，其為凍干形式。
全文摘要
本發明公開了包含SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的新型層粘連蛋白多肽。還公開了包含多糖(例如透明質酸)和該新型層粘連蛋白多肽或者包含透明質酸、層粘連蛋白多肽和抗氧化劑(如超氧化物歧化酶)的組成物，以及包含所述組成物的、可用于離體或體內組織形成和用于治療以組織患病、損傷或損失為特征的病狀的基質和水凝膠。
文檔編號C07K14/78GK101965357SQ200880112384
公開日2011年2月2日 申請日期2008年8月13日 優先權日2007年8月15日
發明者S·羅克金德, Z·尼沃 申請人:特拉維夫大學拉莫特有限公司;特拉維夫醫療中心醫學研究基礎設施和保健服務基金會