專利名稱：日本血吸蟲病天然分子疫苗候選抗原的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及日本血吸蟲天然分子抗原的分離與純化及免疫保護性研究。
背景技術：
血吸蟲病是一種分布廣，危害嚴重的人畜共患寄生蟲病。血吸蟲病的流行嚴重影響了人們群眾的身體健康并阻礙了疫區經濟的發展。血吸蟲病疫苗研究是當今血吸蟲病防治研究的熱點之一有關血吸蟲病疫苗的研究興起于20世紀80年代，通過基因工程重組抗原與天然分子的篩選，發現至少有數十種抗原分子可誘導實驗動物產生一定的保護作用。世界衛生組織推薦的曼氏血吸蟲疫苗分子有六種谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、磷酸丙糖異構酶(TPI)、副肌球蛋白(PMY)、照射尾蚴疫苗5號(IrV5)、Sml4(脂肪酸結合蛋白，FABP)及23kDa膜蛋白(S23)。但是，由于蟲種之間抗原存在差異，日本血吸蟲病的病理性損害遠遠嚴重于曼氏血吸蟲病；因此，曼氏血吸蟲源性的候選疫苗難以誘導產生抗日本血吸蟲病的保護效果。
因此，自行開發研制我國抗日本血吸蟲病疫苗勢在必行，篩選、鑒定有效的大然分子疫苗候選抗原成分是目前研究的重要方向之一。為了尋找有較好免疫保護力的天然分子抗原，我們分離純化了日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原66-68kDa(SIEA66-68kDa)，并對其免疫保護性效果進行了初步的研究。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有較好免疫保護效果的日本血吸蟲病天然分子疫苗候選抗原，該抗原由SIEA66-68kDa分子組成。
本發明的目的是通過以下方式實現的
采用常規方法制備日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)，從SIEA中分離純化66-68kDa分子抗原并進行鑒定，然后進行SIEA66-68kDa天然分子的小鼠免疫保護性研究。
本發明的技術效果在于SIEA66-68kDa免疫組小鼠獲得了41.70％的減蟲率、51.23％每克肝臟減卵率、59.26％每克大腸減卵率、45.17％每克糞便減卵率，說明經SIEA66-68kDa分子免疫后，一方面可顯著減少動物肝臟病理損害；另一方面能引起宿主蟲荷、肝、腸組織蟲卵數下降，其中糞卵的減低尤為明顯，對于降低血吸蟲卵的傳播具有有重要的意義。
圖1 SIEA66-68kDa分離純化的電泳圖M蛋白質標準分子量；1SIEA66-68kDa；2SIEA具體實施方案實施例一SIEA66-68kDa抗原分離純化及免疫保護性研究。
1、日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)的制備。
每只新西蘭兔經腹部皮膚人工感染1000～2000條日本血吸蟲尾蚴，感染32天后剖殺家兔，收集肝臟，用搗碎機搗碎肝臟并加用胰蛋白酶在4℃過夜消化處理后，通過不同孔徑大小的尼龍篩網后，320目尼龍篩網上收集蟲卵后，于4℃，5000rpm反復離心棄去上層雜質，即可得高純度的未成熟蟲卵。在冰浴條件下，將蟲卵置于冰浴的研缽中充分研磨碎后，置-70℃冰箱反復凍融，經冰浴超聲后，于4℃，10000rpm離心30分鐘，收集上清液，制得未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)。用紫外分光光度計測量蛋白濃度后，-20℃貯存備用。
2、SIEA66-68kDa的分離純化及考馬斯亮藍染色鑒定。
SIEA通過電泳分離，切取66-68kDa蛋白質條帶，切碎凝膠，經電洗脫儀洗脫，收集陽極洗脫液進行超濾離心，分光光度計測量蛋白質濃度，蛋白濃度為0.6mg/ml。收集的濃縮液進行SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色鑒定抗原純度及分離純化所得蛋白質的分子量，證明從日本血吸蟲未成熟蟲卵分離純化出SIEA66-68kDa蛋白質并達到電泳級純度。(參見圖1)3、SIEA66-68kDa天然蛋白質分子的動物免疫、抗體效價檢測及昆明小鼠免疫保護性研究。
將昆明小鼠隨機分為兩組，每組10只，其中A組為PBS對照組，B組為SIEA66-68kDa免疫組，多途徑免疫小鼠，免疫方法同上，每次50ug/只，免疫三次后進行小鼠編號并斷尾取血，分離血清用ELISA測量抗體效價。
ELISA檢測顯示免疫小鼠的抗體效價均超過1∶3200，通過小鼠腹部皮膚進行尾蚴攻擊感染，40±1條尾蚴/只，感染45天后處死小鼠，心臟灌注法分別收集日本血吸蟲雌蟲與雄蟲，分裝并計數，計算減蟲率；磨碎肝臟進行蟲卵計數，計算肝臟減卵率；處死小鼠時分離大腸，去掉大腸內的大便并盡量干凈，天平稱重，單個用絞碎機絞碎，氫氧化鈉消化過夜，定量并在顯微鏡下計數蟲卵個數，大腸減卵率；收集處死前每只小鼠24小時內的全部糞便，天平稱重，并用少量生理鹽水溶成湖狀，經用加藤氏法進行糞便蟲卵計數，計算糞便減卵率。以上數據均采用SPSS11.0統計軟件進行結果分析處理。
數據顯示SIEA66-68kDa免疫組小鼠獲得了41.70％的減蟲率、51.23％每克肝臟減卵率，59.26％每克大腸減卵率，45.17％每克糞便減卵率，與PBS對照組相比較，均有顯著性意義。(P＜0.05，分別參見表1、表2、表3、表4)表1SIEA66-68kDa免疫小鼠減蟲率結果
P＝0.004＜0.05
表2SIEA66-68kDa免疫小鼠肝臟減卵率結果
P＝0.005＜0.05表3SIEA66-68kDa免疫小鼠大腸減卵率結果
P＝0.0014＜0.01表4SIEA66-68kDa免疫小鼠糞便減卵率結果
P＝0.031＜0.0權利要求
1.一種日本血吸蟲病天然分子疫苗候選抗原，其特征在于該抗原為日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原66-68kDa分子。
全文摘要
本發明公開了一種日本血吸蟲病天然分子疫苗候選抗原，該抗原由日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原66－68kDa分子組成。采用該抗原免疫小鼠獲得了41.70％的減蟲率、51.23％每克肝臟減卵率、59.26％每克大腸減卵率以及45.17％每克糞便減卵率，在顯著減少動物肝臟病理損害的同時有效降低了血吸蟲卵的傳播。
文檔編號C07K14/435GK101050235SQ200710034620
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月26日 優先權日2007年3月26日
發明者汪世平, 姜孝新, 周松華, 彭先楚 申請人:汪世平