專利名稱：表達鈷胺素結合蛋白的轉基因植物的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及通過轉基因植物來生產能與鈷胺素(cobalamin)結合的重組蛋白，所述重組蛋白可用于1)預防和/或治療鈷胺素缺乏癥，2)以及對其進行分析。
鑒定出兩組蛋白具有可與維生素B12(鈷胺素)特異性結合的特征，此后稱之為鈷胺素結合蛋白(CBP)。其中的一組由與鈷胺素的同化作用相關的蛋白組成，另一組涉及與鈷胺素代謝和利用相關的蛋白以及包括把鈷胺素作為輔因子的酶類。人體從飲食中吸收鈷胺素(Cbl)是一個復雜的過程，需要結合鈷啉蛋白(HC)、內因子(IF)和鈷胺傳遞蛋白(TC)三個連續Cbl轉運因子共同參與(1-4)。這些蛋白與細菌合成的Cbl具有很強的結合能力。上述三種CBPs將自食物中吸收的Cbl提供給身體。IF是腸道中Cbl的主要結合因子，與腸道受體結合的IF-Cbl復合體導致了Cbl在血液中的內在化(3，4)。在血液中，在與Cbl相結合的組織中，TC-Cbl復合體把吸收的Cbl分配給存在于細胞膜上的一個或更多個特異性受體(2，4)。血液中與HC相結合的大量的Cbl處于循環狀態(1，4)。HC的確切功能還未確定。與IF-和TC-缺乏癥相比，遺傳上HC缺乏并不能引起任何明顯的病理學效果(6，7)。
哺乳動物中已經鑒別出兩個Cbl依賴型的酶反應。將甲基丙二酰-CoA轉換成琥珀酰-CoA時涉及腺苷-Cbl(Ado-Cbl)作為輔因子。甲基-Cbl是從高半胱氨酸合成甲硫氨酸時的輔因子。在本發明之前，僅僅分離出少量的CBP。由于Cbl結合因子以低濃度的形似存在于天然資源中，因此上述蛋白的純化非常復雜(1-4)，例如分離1mg TC需要150-300升的人血漿(8，9)。可以從胃液中分離人體IF，含量為每升胃液含1mg IF。由于天然資源中存在有相對大量的HC，因此從上述資源中分離純TC和IF也是非常復雜的。已經構建了從昆蟲細胞中生產IF和TC的表達系統(10，11)，獲得的重組蛋白在10-100μg的水平。我們已經在酵母中表達了人和牛的TC，在總量為1升的發酵培養基中獲得了5-7mg的重組蛋白(12)。人IF已經在酵母中表達了，產量為每升發酵培養基可以獲得1-4mg的IF。上述這些表達系統使用起來是非常昂貴的，并且它們提供的是CBP完整形式與脫輔基形式的混合物。上述這種混合物也恰恰是CBP在天然資源中的存在形式。完整形式是指CBP與Cbl相絡合，而脫輔基形式則是指CBP不與Cbl相絡合。為達到在診斷試劑盒和其它分析中使用的目的，獲得純化的CBP脫輔基形式或CBP完整形式是非常重要的。
在Schilling測試中，可以用從人胃液中分離的IF進行診斷，在上述過程中需要患者攝入分離的IF，因此存在有從IF供體向患者傳播人類疾病的危險。與之相似，使用從豬中分離的IF或使用從酵母表達培養基中分離的重組人IF，由于上述培養基中含有肉類的酶水解產物，因此都存在有向患者傳播動物疾病的危險。使用從植物表達系統中分離的重組人IF則可以避免了上述問題的發生。
植物體不含有Cbl或CBPs，因此含有插入基因即人IF的重組植物體僅僅表達脫輔基形式的IF，這使得植物體非常適合作為生產脫輔基形式CBPs的“工廠”，而且所生產的脫輔基形式CBPs中沒有完整形式CBPs的污染。在其它真核表達系統中，重組CBP或多或少地會與Cbl進行飽和，從而產生CBP完整形式與脫輔基形式的混合物。在酶反應中，除植物以外的所有其它真核生物體都使用Cbl，因此上述真核生物體中都含有Cbl。與此相似，由于植物體天然不表達CBP，因此使用轉基因植物產生的重組CBP中不會含有其它CBPs。由于兩種CBPs存在于胃液中，因此從其它來源即胃液分離IF，往往在制品中含有一定的HC污染。
在植物體而非其它生物體中表達的CBPs僅僅以脫輔基的形式存在，因此植物表達系統提供了一種通過鈷胺素柱進行親和柱層析純化CBP的機會。由于完整形式的CBP不與鈷胺素柱結合，因此與其它生物體中表達的CBPs相比，植物體中表達的CBPs更加易于純化。
植物體中表達的CBPs可以設計成含有或選擇性地不含有與它們對應的天然蛋白質相同的氨基酸序列。重組蛋白中存在有轉錄后修飾作用，例如在半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵等。對于含有與天然CBPs相同氨基酸序列的CBPs而言，由于來源于植物體的CBPs能與Cbl相結合，因此預測其二硫鍵的定位也與之相同，重組CBPs的三級結構也與天然的CBPs相同。來源于植物體的絡合有Cbl的重組人IF(rhIF)與腸受體cubilin的特異性結合支持了天然hIF與來源于植物體的rhIF具有相同的三級結構。由于糖基化作用具有細胞類型特異性，因此來源于植物體的重組CBPs的糖基化作用與其對應的天然CBPs的糖基化作用不同，來源于植物體的rhIF在糖鏈的糖類組成上也與天然的IF不同。
由于重組植物體的生長是低技術，而且可以通過簡單地種植更多的土地來簡單地大規模生產重組蛋白，因此植物表達系統對大規模生產CBP是非常有用的。植物表達系統提供了在治療計劃中大量使用重組CBP的機會，例如對吸收維生素B-12能力降低的老年人。此外，由于可用于轉基因表達蛋白的許多植物種類也是人類的消費品，例如玉米、馬鈴薯、大麥、水稻、胡蘿卜等，因此通過它們生產的CBP可以不經過或極少經過純化即可使用。
需要尋找一條更好的途徑來生產這些CBPs。
本發明提供一種轉基因植物，其表達至少一種可與鈷胺素和/或其類似物相結合的蛋白。“鈷胺素”(Cbl)是指一種由咕啉環組成的分子，上述咕啉環含有四個吡咯單元，它們圍繞并結合于必需的和中心的鈷原子上。咕啉平面的下方是含有二甲基苯并咪唑堿的核苷酸衍生物，其也與鈷原子相連。最后鈷原子與定位于上述咕啉平面的第六個分子(例如-CH3，OH-，H2O，5’-脫氧腺苷，CN)結合。氰鈷胺素是指維生素B12，但是其它鈷胺素也具有相同的營養特性。不能通過動物和植物來合成鈷胺素，僅僅能通過一些微生物尤其是厭氧細菌來進行鈷胺素生產。“鈷胺素類似物”是指其中例如核酸單元發生了改變或部分去除的鈷胺素分子，例如鈷啉醇酰胺(cobinamid)。鈷胺素類似物也可以是與其它功能性分子例如細胞毒素相連接的鈷胺素。“鈷胺素結合蛋白”是能夠與鈷胺素結合的蛋白質，例如人類蛋白內因子、鈷胺傳遞蛋白、結合鈷啉、甲基丙二酰-CoA變位酶和甲硫氨酸合成酶。“轉基因植物”是指其中一些或所有細胞中都含有表達載體或表達載體片段的植物體。
在第一個優選實施方案中，能夠與鈷胺素或其類似物結合的蛋白可以是鈷胺傳遞蛋白、內因子、結合鈷啉蛋白、甲基丙二酰-CoA變位酶、甲硫氨酸合成酶中的任何一個，或者是與上述蛋白之一或其片段具有至少60％同一性的蛋白質。為了最適的比較目的可以通過序列對比(例如為最好地進行序列對比，可以在兩個序列間引入間隙(gap))和在相應的位置進行氨基酸殘基或核苷酸的比較以確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列同一性的百分率。“最好的序列對比”是指兩個序列進行對比后可以獲得最高的同一性百分率。同一性百分率也決定于進行對比的序列中相同氨基酸殘基或核苷酸的數量(即同一性％＝相同位置的數目/位置總數×100)。
可以通過使用本領域技術人員公知的數學算法確定兩個序列之間的同一性百分率。比較兩序列的數學算法的實例是Karlin和Altschul算法(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，Karlin和Altschul又進行了修改(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877。Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(1990)，J.Mol.Biol．215403-410，合并了上述算法。可以采用NBLAST程序進行BLAST核酸搜索，得分＝100，字寬＝12，獲得與本發明核酸分子同源的核苷酸序列。可以采用XBLAST程序進行BLAST蛋白搜索，得分＝50，字寬＝3，獲得與本發明蛋白分子同源的氨基酸序列。為達到比較效果而獲得間隙對比，可以采用Altschul等(1997)，Nucleic Acids Res.253389-3402描述的間隙BLAST。也可以選擇使用PSI-Blast進行重復搜索，從而確定兩個分子之間親緣的遠近關系(同前)。當使用BLAST、間隙BLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數值，參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于序列對比的另一個數學算法的實例是Myers和Miller算法，CABIOS(1989)。作為CGC序列對比軟件包一部分的序列對比程序(2.0版本)合并了上述算法。本領域已知的其它用于序列分析的算法包括了ADVANCE和ADAM，詳細描述于Torellis和Robotti(1994)，Comput.Appl.Biosci.，103-5；以及FASTA，詳細描述于Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.852444-8。在FASTA中，ktup為一個對照選項，用于設定搜索的靈敏度和速度。
然而，非常重要的因素在于與天然CBP具有類似序列同一性的蛋白在功能上也應該與CBP結合蛋白相同。換句話說，根據本發明所生產的蛋白能夠與Cbl形成復合物，并且能夠與相應的CBP受體相結合。
優選的植物體為“公認為是安全的”(GRAS)植物體。為防止與環境中具有遺傳修飾物質的其它植物體發生交叉污染，可以采用僅在生命周期的第二年才產生花粉的植物體，例如胡蘿卜等。
可以采用本領域已知的方法將轉化的單植物細胞再生成完整植株。本發明還提供了包括細胞在內的繁殖材料或種子。本發明還涉及來源于本發明任一方面的任一植物體或其部分，其中包括了繁殖材料或種子。
本發明的第二方面提供了鈷胺素結合蛋白，其是由轉基因植株或轉基因植株培養細胞表達。優選從植物材料中分離或純化上述蛋白。上述蛋白可以是脫輔基形式(即不與鈷胺素結合)，也可以是完整形式(即與鈷胺素結合)。與通過人體或酵母等微生物體產生的相似蛋白相比，通過轉基因植株產生的該蛋白具有不同的與分子附著的糖類部分。轉基因植株產生的蛋白具有與人體或酵母產生的蛋白不同的表觀分子量證實了上述兩種蛋白在糖類含量上的差異。一旦去除蛋白的糖類基團，所有上述蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳下都具有相同的分子量。
本發明的第三方面提供了分離和/或純化如上所述鈷胺素結合蛋白或其功能片段的方法，包括下述步驟(a)將轉基因植物材料制成勻漿；(b)過濾將勻漿離心所形成的上清；(c)采用鈷胺素進行親和柱層析；(d)洗脫附著鈷胺素的鈷胺素結合蛋白；(e)進行凝膠過濾；任選地，還包括了下述步驟以生產脫輔基形式的鈷胺素結合蛋白(f)用5M的鹽酸胍(guanidine HCl)進行透析；(g)用0.2M磷酸鈉進行透析。
本發明的第四方面提供了包含本發明的鈷胺素結合蛋白的組合物。鈷胺素結合蛋白可以是充分純化形式，或者通過轉基因植物材料的形式提供上述鈷胺素結合蛋白，其中攝入的轉基因植物材料可以是原始的、未進行任何加工的，或也可以是或多或少進行過加工的，例如切片形式(chopped)、研磨形式、轉基因植物材料的勻漿、液態轉基因植物提取物以及部分或全部純化的重組CBP等。
上述組合物優選藥物組合物。本發明的組合物適合于任何適當的給藥途徑，例如口服給藥途徑(包括口腔或舌下給藥)。可以采用藥劑學上任何已知的方法制備上述配劑，例如將活性組分與載體或賦形劑相聯合。
適于口服給藥的藥物制劑可以制成分離的單元，例如膠囊或藥片；粉末或顆粒；水或非水液體的溶液或懸浮液；可食用的泡騰制劑或whips；水包油乳液或油包水乳液。
優選的單位劑量配方可以是日常劑量或亞劑量的如上面所描述的活性組分或其適當級分。
應當理解為除了上面提到的具體組分外，制劑中還應可包含，所述配劑類型相關的本領域其它常規試劑，例如適合口服給藥的配劑中應當包含調味劑。重組植物CBP還可以采用與鈷胺素或鈷胺素類似物或含有示蹤原子(或分子)的鈷胺素等第二組分聯合給予的形式。含有或不含有第二組分的重組植物CBP藥片也可以設計成在腸道內釋放CBP，從而避免了胃部的低pH值和胃蛋白酶的影響。
本發明的組合物優選口服使用的形式。
推薦的日常維生素B12劑量為2.5微克，相當于125微克的IF-Cbl或122.5微克的IF。
本發明的第五方面提供了含有本發明的轉基因植物或來源于上述植物的植物材料的食品。
本發明的第六方面提供了治療鈷胺素缺乏癥的方法，其包括了給與含有至少一種本發明的鈷胺素結合蛋白的組合物。缺乏癥可以通過給予額外數量的與維生素B12的吸收和運輸相關的蛋白加以克服。這些蛋白優選鈷胺傳遞蛋白、結合鈷啉蛋白和內因子中的任意一個或多個。上述蛋白可以單獨給藥，也就是以脫輔基的形式，也可以與鈷胺素或鈷胺素類似物聯合給藥，也就是以完整的形式。鈷胺素結合蛋白的“完整形式”是指鈷胺素結合蛋白與例如鈷胺素或其類似物的配體的復合體。鈷胺素結合蛋白的“脫輔基形式”是指鈷胺素結合蛋白即將與鈷胺素或鈷胺素類似物相結合的形式。
本發明的第七方面提供了本發明的CBP在診斷測試中的應用。在這種測試中，如Nexφ和Gimsing，1981，Scand.J.Clin.Lab.Invest.41465-468，“Insolubilized pure human intrinsic factor used for quantitation of cobalamins inserum”所描述，通過提取的生物樣品與示蹤的Cbl相競爭結合CBP的能力而檢測例如血液中鈷胺素的含量。在其它測試中，測試的目的是檢測CBP，或其總量或完整形式和脫輔基形式的CBP含量。這種測試可以直接通過例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)來進行(Nexφ等，2000，Clinical Chemistry 46(10)1643-1649)，也可以與去除脫輔基形式的樣品預處理相結合來進行，其描述于Nexφ，1975，Biochim.Biophys.Acta，379189-192。
本發明的另一方面提供了一種通過采用IF或其功能性片段的Schilling測驗定量從腸道中吸收鈷胺素的方法，其中所利用的IF或其功能性片段是從表達鈷胺素結合蛋白或其功能性片段的轉基因植物中分離的。例如可以采用如下方式進行“Schilling測驗”通過口服方式攝入一定劑量的具有放射性鈷標記的Cbl，24小時后收集尿液，檢測尿液中放射性標記Cbl級分的含量。如果在測驗的第一個階段，尿液中沒有檢測到放射性標記的Cbl，一周后進行第二次測驗。在現在的測驗中，通過口服方式一起攝入一定劑量的具有放射性鈷標記的Cbl和IF，24小時后收集尿液，檢測尿液中放射性標記Cbl級分的含量(Fairbanks，V.F.Test for pernicious anaemiathe“Schillingtest”Mayo Clin Proc.1983，58541-544)。
本發明的另一方面提供了一種通過采用本發明的蛋白定量鈷胺素或其類似物的方法。例如在使用標記的鈷胺素或其類似物的競爭結合試驗中，可以采用轉基因植物產生的分離的CBP。
本發明的再一方面提供了一種采用本發明的蛋白定量CBP的方法。可以通過分離本發明的CBP，然后采用放射性標記標記與鈷胺素或其類似物在競爭結合試驗使用。
本發明的再一方面提供了一種采用本發明的蛋白定量鈷胺素結合蛋白受體的方法。例如，rhIF可以與標記的鈷胺素分子例如放射性鈷胺素(cobalmin)相復合來確定腸道內IF-B12受體的數量或其結合能力。
本發明的另一方面提供了一種含有編碼一個或更多個鈷胺素結合蛋白的核酸的核酸構建體，其可操作地連接于一個或更多個可指導在植物體中表達的調控序列，上述調控序列例如可以是諸如35S CaMV等啟動子。除諸如擬南芥(Arabidopsis thaliana)的伸展蛋白信號肽的信號肽序列外，還可以采用Phalseolus vulgaris幾丁質酶信號肽或者Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶。在優選的實施方案中核酸是指DNA序列。
本發明的再一方面提供了一種包含本發明核酸構建體的載體，其可以是質粒、粘粒或噬菌體。上述載體中通常都含有可用于選擇已轉染或已轉化細胞的一個或更多個表達標記，優選的是用于選擇包含整合有異源DNA載體的細胞。如果使用上述載體的目的是用于表達，則應包含用于驅動表達的足夠的調控序列。本發明優選可以在植物細胞中表達的核酸和啟動子序列。
本發明的另一方面還提供了一種含有本發明核酸序列和/或本發明載體的植物細胞。可以將上述細胞定義為“宿主”，它可用于對核酸序列進行操作，包括克隆。或者上述細胞是指其中可以表達核酸序列的細胞，最優選植物細胞。可以通過本領域已知的標準技術將核酸整合到細胞中。優選通過攜帶有雙臂T質粒載體的農桿菌將核酸轉化到植物細胞中，其是通過本領域已知的技術，例如在EP-A-0116718和EP-A-0270822中描述。或者通過放電裝置或其它任何一種可以將核酸序列穩定整合到細胞中的方法將外源核酸序列直接導入到植物細胞中。本發明的核酸優選含有可用于對核酸序列進行鑒定的第二“標記”基因。這最常用于區別含有外源核酸的轉化植物細胞與其它不含有外源核酸的植物細胞。上述標記基因的實例有抗生素抗性基因、除草劑抗性基因和葡萄糖醛酸苷酶(GUS)表達基因。可以通過第二啟動子對標記基因的表達進行調控，其允許標記基因在所有細胞中進行表達。
優選僅僅將外源核酸引入到宿主細胞的線粒體和/或葉綠體中。核酸可以引入到細胞核或其它細胞器的基因組中，上述細胞器包括了線粒體或質體，例如原生質體、色質體和白色體。由于花粉中不含有質體或線粒體，因此僅僅將外源核酸序列引入到這些細胞器中可以阻止通過雜交授粉作用將轉基因材料轉移到周圍環境的野生植物體中。
本發明的目的是在植物體中生產重組鈷胺素結合蛋白(CBP)。由于植物體不含有或不使用鈷胺素，因此植物體中表達的重組CBP全部是脫輔基形式的(不與鈷胺素相絡合)，而天然來源的CBP則是CBP完整形式和脫輔基形式的混合物。與利用轉基因植物不同，從天然來源生產特定的CBP還需要從其它種類的CBPs中進一步純化。此外與所有其它已知的蛋白來源相比，轉基因植物還提供了一種廉價的大規模生產CBP的方法。
僅僅通過種植較大土地面積的可生產CBP的植物體，本發明即可非常簡單地大規模生產大量的重組CBP。由于通過酵母或昆蟲來生產CBP需要發酵罐和孵化器等高技術，因此這是一種相對廉價的方法。
使用天然來源分離CBP受到一些限制。由于血液和牛奶中TC的濃度相對較低，因此大規模分離這種蛋白是非常昂貴的。人們通常是大規模地從豬的胃液中分離IF，而較少程度地從鼠和人的胃液中進行IF分離。由于胃中還存在HC，因此當IF用于診斷試劑盒時，需要對這些CBP進行高度的純化分離。例如在血漿的Cbl試驗中，需要不與Cbl相結合的IF(FDA需求)用作結合蛋白。除上述這些問題外，采用天然資源還面臨著將疾病傳播給接受CBP的患者的嚴重危險。使用轉基因植物體表達的重組CBP所生產的提取物中僅含有重組CBP，而沒有其它種類的CBP。此外使用轉基因植物生產的CBP也消除了將天然CBP資源中動物或人類疾病傳播給患者的危險。植物表達系統還提供了將GRAS(公認為是安全的)生物體用作生產CBP的宿主的機會。
作為將轉基因植物體當作表達系統生產CBPs的實例，我們已經在擬南芥中表達了人的IF和TC。我們按照(14)的描述對轉基因植物體的鈷胺素結合能力(CBC)進行了測試。
為了列舉實例的需要本發明后面的描述將提及擬南芥。但是，應注意的是本發明所涉及的遺傳轉化植物并不僅限于諸如擬南芥。通過采用本領域已知的方法/技術，本發明的方法也同樣能夠應用于其它植物種類。
本發明的描述將參照以下實施例，但不應解釋為以任何方式對本發明構成限制。
實施例具體參照以下附圖附

圖1顯示了編碼伸展蛋白信號肽序列與成熟人內因子編碼區和部分3’-非翻譯區相融合的核苷酸序列。該核苷酸序列是將取自于GenBank登陸號no.AF104327的編碼類似于擬南芥伸展蛋白信號肽的序列與氨基酸序列MASSSIALFLALNLLFFTTISA相融合的核苷酸序列(第7-119位)。以下劃線的方式標注出該信號肽序列的甲硫氨酸起始密碼子(ATG)。以粗體字母的形式顯示出編碼成熟人內因子的核苷酸序列(第120-1316位)，上述核酸序列取自于GenBank登陸號no.X76562。該序列之后是翻譯終止密碼子(TAA)和內因子mRNA的3’-非翻譯區核酸序列，以下劃線的方式對翻譯終止密碼子進行了標注。以下劃線標注的限制性XbaI(第1-6位)和XmaI位點(第1425-1430位)的引入是為了便于對植物轉化載體的克隆。
附圖2顯示了由附圖1中粗體字母顯示的第120-1316位核苷酸序列編碼的成熟人內因子之氨基酸序列。
附圖3顯示了編碼GenBank登陸號no.S43926的Phaseolus vulgarisCH5B-幾丁質酶的第7-129位核苷酸序列，它編碼具有MKKNRMMIMICSVGVVWMLLVGGSYG氨基酸序列的信號肽。上述核酸序列與附圖1中粗體字母顯示的編碼成熟人內因子的核苷酸序列相融合。用于克隆的限制性XbaI位點以下劃線的方式在位置1-6處標出，翻譯起始密碼子ATG以下劃線的方式在位置52-54處標出。
附圖4顯示了編碼GenBank登陸號no.M60402的Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶的第7-144位核苷酸序列，它編碼具有MSTSHKHNTPQMAAITLLGLLLVASSIDIAGA氨基酸序列的信號肽序列。
上述核苷酸序列與附圖1中粗體字母顯示的編碼成熟人內因子的核酸序列相融合。以下劃線的方式標注出限制性XbaI位點(第1-6位)，和翻譯起始密碼子ATG以下劃線的方式在位置49-51處標出。
附圖5顯示了編碼伸展蛋白信號肽的序列與成熟人鈷胺傳遞蛋白編碼區相融合的核苷酸序列。該核苷酸序列是將取自于GenBank登陸號no.AF104327的編碼類似于擬南芥伸展蛋白信號肽的序列與氨基酸序列MASSSIALFLALNLLFFTTISA相融合(第7-119位)。以下劃線的方式標注出該信號肽序列的甲硫氨酸起始密碼子(ATG)。以粗體字母的形式顯示出編碼成熟人鈷胺傳遞蛋白的核苷酸序列(第120-1346位)，上述核苷酸序列采用GenBank登陸號no.NM 000355。該序列之后是第1347-1349位的翻譯終止密碼子(TAA)，將其以下劃線的方式進行標注。以下劃線標注的限制性XbaI(第1-6位)和XmaI位點(第1350-1355位)的引入是為了便于對植物轉化載體的克隆。
附圖6顯示了由附圖5中粗體字母顯示的第120-1346位核苷酸序列編碼的成熟人鈷胺傳遞蛋白氨基酸序列。
附圖7顯示了人胃液中天然源內因子(o)與從轉基因擬南芥植株中提取的重組人內因子(·)在結合鈷胺素或鈷啉醇酰胺能力上的對比。等量的上述兩種蛋白分別加入到含有固定量鈷(57Co)標記的鈷胺素混合物中，增加非放射性標記標記的鈷胺素或鈷啉醇酰胺的含量，并且進行混合(X軸)。分離游離的和結合的配體，并采用gamma計數器測定附著蛋白的57Co量。計算57Co級分界限(fraction bound)相對于缺少未標記的鈷胺素或鈷啉醇酰胺的57Co數量界限(Y軸)。該圖顯示出重組IF具有與天然IF相一致的結合鈷胺素的特異性，但與鈷啉醇酰胺的結合并非如此。
附圖8顯示了如何通過在含有由SDS-PAGE分離的蛋白的Western印跡上使用抗人胃內因子的多克隆抗體和堿性磷酸酶絡合的免疫球蛋白來顯示內因子。收獲表達重組人內因子的轉基因擬南芥植株，并且在離心和對上清進行透析前采用在0.2M磷酸緩沖液中進行勻漿。為了比較，采用含有插入人內因子的轉基因酵母(Pichia pastoris)來表達重組人內因子。在用20mM Tris pH8.0進行透析和分析之前，采用硫酸銨(80％w/v)對發酵培養基中形成的分泌蛋白進行沉淀。純化的人胃內因子也用來比較。采用PNGaseF酶對每一樣品的等分試樣進行處理以從蛋白去除的碳水化合物。泳道“植物IF”含有從植物體提取的蛋白；“植物IF+PNGaseF”含有用PNGaseF處理的從植物體提取的蛋白；“酵母IF”含有酵母蛋白；“酵母IF+PNGaseF”含有用PNGaseF處理的酵母蛋白；“人胃IF”含有純化的人IF；“人胃IF+PNGaseF”含有用PNGaseF處理的純化的人IF。箭頭標示出用PNGaseF處理的三個樣品去糖基化IF的45kDa條帶。
印跡結果顯示上述三個樣品的IF糖基化形式在分子量上具有顯著的區別，而去糖基化樣品卻含有相同分子量的成熟IF。
附圖9對比了從各種來源制備的內因子在糖基化作用和分子量上的比較。PAS染色用于對糖蛋白進行顯示。對自轉基因植物(擬南芥)和轉基因酵母(Pichia pastoris)的重組人內因子(rhIF)進行分離，并在鈷胺素柱上進行親和層析。純化的人胃IF用來比較。將牛PAS-3進行高度糖基化并用作對PAS染色的對照。牛血清白蛋白(BSA)未進行糖基化作用，用作PAS染色的“陰性”對照。將樣品進行SDS-PAGE雙向(induplicate)凝膠電泳。第二塊膠進行考馬斯亮藍染色。
凝膠結果顯示由于轉基因植物有大約50kDa的rhIF條帶被PAS染色，因此重組植物體IF是經過糖基化的。
附圖10顯示了分離rhIF的純化方法和用于N末端測序的蛋白片段印跡方法。將純化的重組人內因子(rhIF)進行SDS-PAGE電泳，印跡到PVDF膜上，并且用考馬斯亮藍進行染色。通過氨基酸測序分析成熟的rhIF和被部分切割的rhIF片段(擬南芥中存在的蛋白酶酶切rhIF)。箭頭標示的三個片段的N末端測序結果顯示大約50kDa的片段與成熟的人胃內因子具有相同的N末端。較小的兩個片段(30和20kDa)是成熟hIF在第285位氨基酸殘基之前進行蛋白水解裂開的結果。
附圖11顯示了轉基因植株對鈷胺傳遞蛋白的表達。在含有由SDS-PAGE分離的蛋白的Western印跡上使用抗人鈷胺傳遞蛋白(TC)的多克隆抗體和堿性磷酸酶結合的免疫球蛋白來顯示TC。收獲表達重組人TC的轉基因擬南芥植株(9-11號)，并且在離心和對上清進行透析前采用0.2M磷酸緩沖液進行勻漿。
雜交結果顯示上述三個植株中的每一個都含有預期分子量為45kDa的單一蛋白。
附圖12顯示了植物重組人鈷胺傳遞蛋白(o)和植物重組人內因子(·)結合鈷胺素或鈷啉醇酰胺的能力。從轉基因擬南芥植株中提取上述兩種重組蛋白。等量的蛋白分別加入到含有固定量鈷(57Co)標記的鈷胺素混合物中，其混有增加非放射性標記標記的鈷胺素或鈷啉醇酰胺的含量(X軸)。分離游離的和結合的配體，并采用gamma計數器測定附著蛋白的57Co的含量。計算57Co級分界限相對于缺少未標記的鈷胺素或鈷啉醇酰胺的57Co數量界限(Y軸)。該圖顯示出重組人內因子和重組人鈷胺傳遞蛋白都能夠與鈷胺素相結合，但不與鈷啉醇酰胺相結合。
附圖13顯示了內因子與人腸受體蛋白cubilin的結合情況。采用儀器BIAcore 2000(Biacore AB，Uppsala，瑞典)對內因子與其受體的結合情況進行分析。Resp.Diff.的增加(Y軸)表明了內因子與cubilin之間的結合。在時間大約為100處，將含有內因子的溶液添加到固定化的cubilin中。分別從轉基因植物、人胃液和豬胃中分離內因子。采用維生素B12飽和的內因子和維生素B12未飽和的內因子制品。在時間大約為600處，從溶液中去除內因子，隨后進行cubilin和內因子之間的解離。結果表明與天然內因子相似，重組內因子僅在與維生素B12飽和時才與cubilin相結合，并且重組內因子的結合特性與天然內因子相似。
實施例1如附圖1所示，將編碼擬南芥伸展蛋白信號肽的核苷酸序列與編碼成熟人內因子的核苷酸序列(附圖2)相融合。上述構建體插入到植物轉化載體CRC-179中。
載體CRC-179的構建采用EcoRI和KpnI對載體pPZP 211(Hajdukiewicz，P；Svab，Z； & Maliga，P.1994 Plant Mol.Biol.25，989-994)進行消化，采用同一套酶將pAnos序列從pGPTV KAN(Becker，D；Kemper，E；Schell，J & Masterson，R.1992 PlantMol.Biol.20，1195-1197)中釋放出來并克隆到pPZP 211載體中。采用PstI和KpnI對所獲得的載體進行消化并形成平端載體。將含有35S CaMV啟動子的平端EcoRI和HindIII片段克隆到上述平端載體中，含有35S CaMV啟動子的平端EcoRI和HindIII片段詳細描述于Jefferson，RA；Kavanagh，TA &Bevan，MW.1987 EMBO J.6，3901-3907中。最終所獲得的載體命名為CRC-179。
采用上述重組載體對細菌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進行轉化。
農桿菌的培養采用的農桿菌株系為GV3101(pMP90)(Koncz and Schell，1986)，它攜帶有在XbaI-XmaI位點間克隆有編碼CBP插入子的雙元質粒CRC-179。插入序列顯示于附圖1、3、4和5中。在200ml添加有利福平(100mg/ml)、鏈霉素(100mg/ml)和慶大霉素(50mg/ml)的滅菌LB培養基中(每升水中含有10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g氯化鈉)，在28-30℃、250rpm下，將菌株培養到穩定期。按1∶200的比例對少量的過夜培養物進行稀釋后繼續培養16-18小時。在室溫下以5500g的離心力離心10分鐘來收獲細菌細胞，用400ml接種培養基(10Mm MgCl2，5％w/v蔗糖和0.05％v/v Silwet L-77(LehleSeeds，Round Rock，TX，USA))懸浮沉淀細胞。
重組農桿菌用于轉化擬南芥植株。
轉化擬南芥植株采用蘸花法(floral dip)(Clough and Bent，1998)轉化擬南芥植株。
植株生長在生長箱中，在白天20℃/夜晚18℃、每天保持LiCl光照18小時、濕度70％的條件下，將擬南芥植株(Col-0生態型)培養到開花階段。在每64cm2的盆中種植20到25株植株，采用的土壤為濕土混合物，其中含有40kg soilorange和40kg soil green(Stenrφgel Mosebrug A/S Kjellerup，DK)、25升4-8mmFibroklinker(Optiroc，Randers，DK)、12升Vermiculite(Skamol，DK)和300g添加有NPK15-5-11，3-4個月的Osmocote(Scott’s，UK)。
每一植株為了獲得更多的花芽，在多數植株形成第一花序原基(primarybolts)后，對花序進行修剪以減輕頂端優勢從而促使多個第二花序原基同時出現。當多數第二花序原基生長到約7-13cm高時(修剪后7-9天)對植株進行蘸花(dip)處理。
將轉基因農桿菌懸浮液加入到400ml燒杯中，將植株倒插到懸浮液中，以達到除蓮座(rossete)外的所有地上組織都浸入為宜。輕柔攪動10-15秒后取出植株，在室溫下，在密封的塑料袋中水平放置24小時。
24小時后將植株轉移到生長箱中并去除塑料袋。植株生長到3-4周后，長角果變褐變干。收獲種子并且使其在室溫下干燥7天。
轉化株的篩選采用含有0.05％v/v Tween 20的0.5％的次氯酸鈉對種子進行表面消毒處理7分鐘，然后用70％酒精處理2分鐘，隨后用無菌水清洗3次。
為了篩選轉化植株，將消毒的種子以大約每144cm22000粒的密度放置在含卡那霉素的選擇平皿上，在21℃生長8-10天，每天給光16小時。選擇平皿中含有1×MS培養基(Duchefa，Haarlem，NL#M 0222)、1％v/v蔗糖、0.9％w/v agar noble(Difco，Detroit，USA)和50mg/ml卡那霉素，pH值為5.7。經過篩選后，轉化植株轉移到生長箱中(參見植株生長)。
種植已轉染植株的種子，通過western印跡分析鑒別重組植株。通過重組植株的種子所生產的新的重組植株稱為IF-植株。
采用2升磷酸緩沖液對1kg 3周齡的IF-植株進行勻漿化，并且采用離心方法進行澄清。該提取物中含有100mg具有CBC的重組人IF。采用(15)描述的檢測方法表明該IF具有與鈷胺素結合的特異性，而其類似物鈷啉醇酰胺不能通過IF相結合的特異性。附圖7顯示對于結合Cbl而言，來源于植物體的rhIF與天然人胃IF具有相同的特異性，但對于鈷啉醇酰胺卻并非如此。
采用(16)描述的方法對轉基因植株進行分析，結果表明轉基因植株中不含有鈷胺素。上述結果表明了植物rhIF以脫輔基形式存在。對轉基因植株的蛋白分析表明它們在Western印跡上被抗人IF抗體識別表達了大約50kDa的蛋白，(參見附圖8、10)。對該50kDa蛋白N末端區域進行氨基酸測序表明相同序列也存在于成熟天然IF序列中(附圖2)。因此從融合蛋白中進行翻譯后切除伸展蛋白信號肽序列導致分泌具有正確N末端的重組IF。大約50kDa的分子量表明了上述蛋白為全長蛋白。成熟全長IF由399個氨基酸組成，預測分子量為43412 Da。對SDS-PAGE分離的印跡重組蛋白進行PAS染色表明了重組IF中含有一些糖類(參見附圖9)。植物體rhIF的去糖基化作用導致了該蛋白具有大約相似的測定和預測分子量(附圖8)。從Western印跡的結果可以估測出天然人IF的分子量大約比重組植株的IF大5kDa。由于糖類(carbohydrate)組合物具有組織特異性并且每一個體具有一定程度的獨特性，因此天然人IF和重組植株IF之間在糖類組成上預計具有一些差異。天然和重組IF在分子量上的差別可能就是在不同糖類組成上具有差異的結果。從人胃IF、酵母表達的人IF和植物體表達的人IF中去除糖類證實了上述結果。上述3種IF蛋白的去糖基化形式具有相同的分子量(參見附圖8)。
在含有純化的來源于轉基因擬南芥rhIF的Western印跡結果上，除具有成熟rhIF的50kDa條帶外，還可以觀察到兩條較小的大約30和20kDa條帶(附圖10)。對上述兩條帶進行N末端測序的結果顯示30kDa條帶含有成熟人IF的N末端序列。20kDa條帶含有成熟IF位于甘氨酸-285處的N末端序列。含有氨基酸殘基1-284的片段的預測分子量為30612 Da，含有氨基酸殘基285-399的片段的預測分子量為12817 Da。測定分子量20kDa與預測分子量12817 Da之間的不一致性很可能是由于含有285-399位氨基酸殘基的片段在4個潛在N-聯合糖基化作用位點一個或多個位點發生了糖基化作用的結果。PAS染色也識別出20kDa條帶，表明在該片段中也存在一些糖基化作用。雖然在30kDa片段中也存在有一個潛在的N-聯合糖基化作用位點，但在PAS染色中并未觀察到該30kDa片段。這與含有氨基酸殘基1-284的片段在測定和預測分子量之間無差異是相一致的。
附圖13顯示了與維生素B12相復合的植物rHIF與人腸受體蛋白cubulin相結合的情況。脫輔基形式的rHIF不與cubulin受體相結合。作為比較，結合形式的人胃IF和豬IF也都僅在完整形式時才能夠與cubulin受體相結合。這些結果表明來源于植物體的重組人內因子在與受體結合方面具有與天然胃內因子相同的特性。
實施例2構建含有編碼自Phaseolus vulgaris幾丁質酶CH5B信號肽苷核酸序列與編碼成熟人內因子核苷酸序列相融合的載體構建體，并用上述載體構建體轉化擬南芥(附圖3)。該構建體用于生產轉基因擬南芥植株。由于這些植株顯示包含與多數伸展蛋白-IF植株相同水平的CBC，因此對于內因子表達的信號肽的選擇并不僅僅局限于單一的序列。
實施例3構建含有編碼Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶信號肽核苷酸序列與編碼成熟人內因子核苷酸序列相融合的載體構建體，并用上述載體構建體轉化擬南芥(附圖4)。該構建體用于生產轉基因擬南芥植株。由于這些植株顯示包含與多數伸展蛋白-IF植株相同水平的CBC，因此對于內因子表達過程的信號肽的選擇并不僅僅局限于單一的序列。
從實施例1-3中IF-植株獲得的結論對我們已檢測的來源于植物的重組人IF而言，含有成熟N端序列的天然人胃IF相同的性質，可為抗-IF抗體識別，可與鈷胺素結合，不與鈷啉醇酰胺結合，可與腸受體相結合，并且存在糖類成分。胃液中的IF與其它CBP、結合鈷啉蛋白和從食物中獲得的一些鈷胺素一起存在，與此相比，轉基因IF-植株中只含有IF而不含有鈷胺素或其它CBP蛋白。來源于轉基因植株的IF具有與人胃IF不同的糖基化作用。來源于人胃黏膜的IF與來源于植物體的IF相比，另一個差別在于來源于植物的IF以脫輔基的形式存在，而來源于人類的IF則是脫輔基形式和完整形式的混合物。
實施例4-TC-植物1kg采用伸展蛋白-鈷胺傳遞蛋白構建體轉化的轉基因擬南芥(TC-植物)提取物(附圖5)中含有20mg具有CBC的重組人TC。Western印跡結果表明單一的大約45kDa的條帶與抗人TC抗體發生反應(附圖11)。具有409個氨基酸殘基的成熟TC(附圖6)的預測分子量為45536 Da，表明測定分子量和預測分子量相似。上述結果表明植物表達系統能夠產生預期大小的重組人TC和具有CBC。
按照(16)描述的方法對轉基因植株進行了分析，結果表明轉基因植株中不含鈷胺素。這也表明了重組人TC是以脫輔基(apo-form)的形式存在。與rhIF相似，從植物體獲得的rhTC也能夠與Cbl結合，而不與鈷啉醇酰胺相結合(附圖12)。N末端氨基酸測序結果表明自在天然人鈷胺傳遞蛋白中發現的產生正常成熟N末端的分泌的rhTC去除伸展蛋白信號肽。
實施例5從植物體中純化重組內因子將1kg原始植物材料切碎并用2升、pH7.5的0.2M磷酸鈉緩沖液制成勻漿。上述勻漿在4000rpm下離心10分鐘，并在布氏漏斗上用Watman濾紙進行過濾。濾液可以在此階段以冷凍的形式進行保存。按照前述的方法(Nexo，E.，1975 Biochim.Biophys.Acta 379，189-192)采用親和基質從溶液中吸收內因子。從柱上進行洗脫后，將內因子(用鈷胺素飽和＝完整形式)進行凝膠過濾，用水進行透析并冷凍干燥。制備未被鈷胺素飽和的內因子(＝脫輔基形式)需要額外的步驟用5M鹽酸胍透析2天，隨后用pH7.5，0.2M的磷酸鈉緩沖液進行透析。
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權利要求
1.一種轉基因植物，其表達至少一個能與鈷胺素和/或其類似物結合的蛋白。
2.根據權利要求1的轉基因植物，其中所述蛋白是鈷胺傳遞蛋白，內因子，結合鈷啉，甲基丙二酰-CoA變位酶，甲硫氨酸合成酶或與上述蛋白之一具有至少60％序列同一性的蛋白，或其功能性片段。
3.根據權利要求1或2的轉基因植物，其中所述植物“公認為是安全的”(GRAS.)。
4.來源于權利要求1至3中任意之一定義的轉基因植物的繁殖材料。
5.根據權利要求4的繁殖材料，其包括種子。
6.由權利要求1至3中任意之一定義的轉基因植物表達的鈷胺素結合蛋白或其功能性片段。
7.根據權利要求6的鈷胺素結合蛋白或其功能性片段，其是從轉基因植物中分離和/或純化的。
8.一種分離和/或純化權利要求6定義的鈷胺素結合蛋白或其功能性片段的方法，包括下面的步驟將轉基因植物材料制成勻漿。
9.根據權利要求8的方法，其包括下述步驟過濾由離心勻漿所形成的上清；使用鈷胺素的親和柱層析；洗脫附著于鈷胺素的鈷胺素結合蛋白；凝膠過濾；用水進行透析；任選地，還包括下述步驟以生產脫輔基形式的鈷胺素結合蛋白用5M的鹽酸胍進行透析；用0.2M磷酸鈉進行透析。
10.一種組合物，其含有權利要求6或7定義的鈷胺素結合蛋白或其功能性片段。
11.根據權利要求10的組合物，其是藥物組合物，并且任選地還包含一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑和/或載體。
12.根據權利要求10或11的組合物，其用于口服。
13.一種食品，其包括權利要求1-3定義的轉基因植物或來源于所述植物的植物材料。
14.權利要求6或7定義的蛋白在診斷檢測中的應用。
15.一種利用權利要求6或7定義的蛋白，通過Schilling檢測來定量自腸道中吸收鈷胺素的方法，其中的蛋白是內因子或其功能性片段。
16.一種利用權利要求6或7定義的蛋白定量鈷胺素和其類似物的方法。
17.一種利用權利要求6或7定義的蛋白或其抗體定量鈷胺素結合蛋白的方法。
18.一種利用權利要求6或7定義的蛋白定量鈷胺素結合蛋白受體的方法。
19.根據權利要求18的方法，進一步使用標記的鈷胺素。
20.根據權利要求19的方法，其中對鈷胺素進行放射性標記。
21.一種核酸構建體，其包含編碼一個或多個鈷胺素結合蛋白的核酸，可操作地連接于一個或多個能夠指導在植物體中表達的調控序列。
22.根據權利要求21的核酸構建體，其中所述核酸是DNA。
23.根據權利要求21或22的核酸，其中調控序列源自擬南芥伸展蛋白信號肽，Phalseolus vulgaris幾丁質酶信號肽，Nicotiana tabacum葡聚糖β-1，3-葡聚糖酶和/或35SCaMv啟動子中的任意之一。
24.一種載體，其含有權利要求21至23中任意之一定義的核酸構建體。
25.一種植物細胞，其含有權利要求18或24定義的載體或權利要求21至23任意之一定義的核酸構建體。
26.一種完整的植物體或其部分，其含有權利要求25定義的植物細胞。
27.根據權利要求25定義的植物細胞或根據權利要求26定義的植物體或其部分，其中載體或核酸構建體在核、質體和/或線粒體中。
28.一種治療鈷胺素缺乏癥的方法，包括給予所需者權利要求6或7定義的蛋白或其功能性片段或給予權利要求11或12定義的藥物組合物。
29.根據權利要求28定義的方法，其中鈷胺素缺乏癥是由內因子、鈷胺傳遞蛋白和結合鈷啉中至少一種水平低而引起的。
全文摘要
本發明涉及利用轉基因植物來表達維生素B12(鈷胺素)結合蛋白。利用適于表達和分泌維生素B12結合蛋白的核酸序列對植物細胞進行轉化。本發明還涉及使用自植物體的重組維生素B12結合蛋白進行分析檢測和治療維生素B12缺乏癥。本發明還公開了一種純化維生素B12結合蛋白的方法。
文檔編號C07K14/435GK1549862SQ02816898
公開日2004年11月24日 申請日期2002年7月12日 優先權日2001年7月13日
發明者拉斯·E·伯格倫德, 托本·E·彼得森, 瑟吉·N·費多索夫, 埃巴·尼克索, 尼爾斯·B·勞爾森, 埃里克·O·詹森, B 勞爾森, O 詹森, E 彼得森, N 費多索夫, 尼克索, 拉斯 E 伯格倫德 申請人:科本托生物技術公司