專利名稱：新型多肽及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及與已知調節軟骨細胞的增殖·分化和具有血管新生抑制作用的軟骨調節因子-I(Chondromodulin，ChM-I)氨基酸序列具有同源性的新型的人、小鼠和大鼠多肽，以及編碼該多肽的人、小鼠和大鼠基因(以下，略作“ChM1L基因”)。
背景技術：
哺乳類的大部分骨經過軟骨細胞的增殖、分化，發生鈣質化，最后置換為骨，即經過所謂的“內軟骨骨化”過程轉化為骨。這一系列過程中有多種激素和生長因子參與，例如已知有類胰島素生長因子(IGF1、IGF2)、成纖維細胞增殖因子(FGF)、癌細胞增殖因子(TGF)、生長激素等。開等分離純化了上述激素和生長因子以外的具有促進軟骨細胞增殖、分化功能的因子ChM-I基因(Biochem.Biophys.Res.Commun.，175，971-977，1991；歐洲專利公開第473080號公報)。人ChM-I是由334個氨基酸殘基構成的II型膜蛋白質，糖鏈修飾后，經加工并將由120個氨基酸殘基構成的C末端部分分泌到細胞外(Hiraki et al，Eur.J.Biochem.260，869-878，1999)。ChM-I不僅能促進培養軟骨細胞的增殖，還能有效地促進蛋白質多糖的合成以及瓊脂糖中的軟骨細胞集落的形成(Inoue et al，Biochem.BioPhys.Res.Commun.，241，395-400，1997)。另外，ChM-I不僅能夠促進軟骨細胞的增殖，還可以促進成骨細胞的增殖(Mori et al，FEBS Letters，406310-314，1997)。
另一方面，很早之前就已指出軟骨不僅是無血管組織，而且還對血管侵入具有抵抗性。開等嘗試了從軟骨組織提取物中純化血管內皮細胞增殖抑制因子，并在完全純化方面獲得了成功。結果表明，該因子為ChM-I(Hiraki et al，FEBS Letter，415，321-324，1997；Hiraki et al，J.Biol.Chem.，272，32419-32426，1997)。軟骨組織通常以保持無血管狀態為特征，不過置換為骨組織時，血管侵入軟骨組織是必要的。形成初級骨化中心時，在血管侵入之前，預定的侵入區域產生軟骨細胞的肥大化和軟骨基質的鈣質化。在肥大化軟骨和隨后的鈣質化軟骨出現區域，ChM-I的表達急劇消失。即，ChM-I基因表達具有軟骨特異性，但局限于表現血管侵入抵抗性的無血管軟骨組織中。如上所述，可推測ChM-I不僅能夠促進軟骨的增殖和分化成熟，同時還通過抑制血管內皮細胞的增殖而抑制血管侵入。因此，ChM-I在無血管軟骨中的表達和血管侵入之前在鈣質化層中的表達消失，與ChM-I的雙重功能的作用是基本一致的。
此外，已明確在軟骨組織中，強有力的血管新生促進因子bFGF大量蓄積在細胞外周質中，而ChM-I圍繞著bFGF，存在于bFGF的領域空間中(Hiraki er al，J.Biol.Chem.，272，32419-32426，1997)。即，在無血管軟骨中，ChM-I以包裹血管新生促進因子的形式存在，進而由ChM-I的血管新生抑制作用可以解釋軟骨中無血管存在的現象(蛋白質·核酸·酶Vol.40 No.5.1995)。此外，已明確ChM-I在體內可抑制向人腫瘤細胞的血管侵入，并可抑制癌細胞的增殖(Hayami et al，FEBS Letters，458，436-440，1999)。從小鼠各個組織中的ChM-ImRNA的表達分析結果來看，ChM-I在軟骨以外的眼和胸腺也有表達，不過目前對ChM-I在這些組織中的功能還不了解(Shukunami etal，Int.J.Dev.Biol.43，39-49，1999)。
軟骨細胞的增殖、分化機能的發揮在骨折治愈和各類軟骨疾病的治愈過程中非常重要。因此，作為促進軟骨細胞的增殖和分化的因子，ChM-I有望作為軟骨細胞增殖劑而得到應用(特開平7-138295號公報)。癌細胞在增殖、轉移時為獲得能量，向組織內的血管侵入是必須的。因此，具有血管新生抑制作用的ChM-I有望作為抗腫瘤劑而得到應用(特開平7-138295號公報)。如上所述，ChM-I是控制軟骨細胞的增殖、分化的同時，還具有血管新生抑制作用的分子。從其功能來看，ChM-I有望作為醫藥品而得到應用。
近年來，生物技術持續的迅速進步，并隨著人類基因組計劃的進展，大量的新型基因被克隆出來。人的基因據說大約有10萬個，其中，氨基酸序列經確認具有同源性的分子組可形成蛋白質家族。氨基酸序列經確認具有同源性的分子組，已知有TNF家族、TNF受體家族、趨化因子以及G蛋白質偶聯受體等多種基因家族。例如，屬于TNF家族的分子已知存在有腫瘤壞死因子α(TNFα，Pennica et al，nature 312，724，1984)、Fas配體(FasL，Suda et al，Cell 75，1167，1993)、TNF-相關細胞凋亡誘導配體(TRAIL，Steven et al.Immunity 3，673，1995)以及B淋巴細胞刺激因子(BLYS，Moore et al，Science 285，260-263，1999)等大約20種。
屬于TNF家族的分子是II型膜蛋白質，其細胞外區域經確認具有氨基酸序列同源性，這些分子雖然氨基酸序列已確認具有同源性，但也明確了各個分子具有其固有的功能，并且正在嘗試著作為針對各種不同疾病的醫藥品進行使用。此外，已明確TNF家族的分子存在各自固有的受體，也嘗試了將這些受體作為醫藥品進行使用，而實際上也存在作為醫藥品得到了認可的受體(例如可溶性TFN受體，Immunex公司)。此外，將針對這些分子的抗體作為醫藥品的研究開發也已展開，而實際上也存在作為醫藥品得到了認可的抗體(例如抗TNFα抗體，Centocore公司)。作為將氨基酸序列確認具有同源性的分子應用于醫藥品開發的例子，如可舉出TNF家族及TNF受體家族。作為可將這些分子應用于醫藥品的前提條件，例如分析各個分子的功能，進而明確其類似性和差異性等。
此外，TNF家族的分子是具II型膜蛋白質結構的分子，因為主要在血液系統、淋巴系統的細胞中進行表達的分子居多，所以在實驗手法和材料方面有很多可共享的部分。進而，屬于TNF家族的新型基因被發現時，其功能分析的速度與早期發現的分子相比更為迅速。這樣，發現氨基酸序列具有同源性的新型基因，并對其功能進行分析，不僅有助于今后發現的新型基因的功能分析，還可以將其分析結果與已知的分子進行比較，進而對已知分子的功能也可以得到更為詳盡的認識。
通常，克隆了編碼與已知分子確認具有氨基酸序列同源性的蛋白質的新型基因時，功能分析使用的技術和材料可以參考已知分子的例子。可是，即使是氨基酸序列確認具有同源性的分子，如上述TNF家族，因為每個分子都有其固有的功能，在考慮作為醫藥品應用時，有必要明確重組蛋白質的表達和純化，抗體的制備，各種組織中的mRNA及蛋白質的表達情況等，以及還需要明確與已知分子在結構和功能方面的差異。

發明內容
本發明的目的在于，提供類似于ChM-I的新型多肽及其編碼基因。此外，本發明的目的還在于，制備針對該多肽的抗體，分析該基因及多肽在各種組織中的表達水平，表達重組蛋白質及結構分析等，并在明確與ChM-I的類似性及差異的同時，闡明功能，使與之相關疾病的癥狀分析和診斷、治療等成為可能。
ChM-I是調節軟骨細胞的增殖、分化，并具有血管新生抑制作用的II型膜蛋白質，并且是有望應用在醫藥品的分子。因此，如果能夠提供編碼與ChM-I類似的新型多肽的基因，則可分析它在各種細胞中的表達水平以及它的結構和功能，并且通過分析其表達產物等，可使與之相關疾病的癥狀分析和診斷、治療等成為可能。不過，目前對與ChM-I的氨基酸序列顯示同源性的分子還沒有報道，并對ChM-I是否構成基因家族也尚未明確。因此，如果確定有與ChM-I類似的多肽及其編碼基因存在，通過其結構及功能等的分析，則有可能探討與ChM-I的類似性和差異性，并且才有望闡明相互分子的生理功能，以及加速與這些分子相關疾病的癥狀分析、診斷及治療藥的開發等。
基于上述目的，本發明人等反復進行了悉心研究，結果由人、小鼠及大鼠cDNA文庫成功地分離出符合上述目的的基因(ChM1L基因)，并進行了其在各組織中的表達水平的分析，針對該多肽的抗體的制備，該基因編碼的多肽在哺乳動物細胞中的表達、檢測及純化等，以及明確了該多肽具有血管新生抑制作用，從而完成了本發明。
即，本發明是編碼實質上含有序列號2、4和6所示的氨基酸序列的多肽的基因。作為上述基因，例如序列號1、3和5所示的堿基序列。
本發明是實質上含有序列號2、4和6所示的氨基酸序列的，人、小鼠和大鼠的基因編碼的多肽。
本發明是與上述基因的至少一部分雜交的寡核苷酸探針。
本發明是含有上述基因的重組DNA。
本發明是被上述重組DNA轉化的轉化體。
本發明是一種制備上述多肽的方法，其特征在于，培養上述轉化體，從得到的培養物中提取本發明基因編碼的多肽。
本發明是與上述多肽特異反應的單克隆抗體或多克隆抗體。
本發明是生成上述單克隆抗體的雜交瘤，該雜交瘤通過將用上述多肽免疫的抗體生成細胞和骨髓瘤細胞進行融合獲得。
本發明是含有上述寡核苷酸探針的基因檢測試劑。
本發明是含有上述多肽、以及上述單克隆抗體或多克隆抗體的診斷試劑盒。
本發明是一種醫藥組合物，該組合物包括實質上含有序列號2、4或6所示的氨基酸序列的基因編碼的多肽。
本發明是一種醫藥組合物，該組合物包括與上述多肽特異反應的單克隆抗體或多克隆抗體。
本發明是一種醫藥組合物，該組合物包括與上述基因的一部分特異反應的反義寡核苷酸。
本發明是一種醫藥組合物，該組合物包括含有上述基因的至少一部分的、可用于基因治療的核酸。
本發明是一種多肽，其特征在于，上述多肽是細胞膜結合型。
本發明是編碼上述細胞膜結合型多肽的基因。
本發明是一種基因，其特征在于，上述人基因存在于X染色體。
本發明是一種多肽，其特征在于，上述多肽具有血管新生抑制作用。
本發明是編碼具有上述血管新生抑制作用的多肽的基因。
附圖的簡單說明

圖1A表示人ChM1L和人ChM-I的氨基酸序列同源性的比較結果。
圖1B表示人、小鼠和大鼠ChM1L的氨基酸序列同源性的比較結果。
圖2表示人ChM-I、人ChM1L和小鼠ChM1L的氨基酸序列的疏水性示意圖。
圖3表示小鼠成熟個體和胎兒的各組織中ChM1L mRNA的表達分析結果，以及在小鼠胎兒形成階段中ChM1L和ChM-I mRNA的表達分析結果。
圖4表示在COS7細胞表達人和小鼠ChM1L蛋白質，并由蛋白質印跡(Western blot)進行檢測的結果。(a)表示分子量標準(Mock，泳道1)，轉染人ChM1L(泳道2)和小鼠ChM1L(泳道3)并將細胞成分進行電泳后，經考馬士亮藍染色的結果，(c)表示將同一樣品用抗ChM1L肽抗體并由蛋白質印跡進行檢測的結果。(b)表示分子量標準(泳道1)，轉染人ChM1L(帶有His標記)(泳道2)和小鼠ChM1L(帶有His標記)(泳道3)并將細胞成分電泳后，經考馬士亮藍染色的結果，(d)表示將同一樣品用抗His標記抗體并由蛋白質印跡進行檢測的結果。
圖5表示在COS7細胞表達的可溶性ChM1L(泳道2)和Mock(泳道1)用FLAG M2抗體并由蛋白質印跡進行檢測的結果。
圖6表示在COS7細胞表達小鼠ChM1L(帶有His標記)蛋白質，回收細胞成分并進行糖鏈消化反應后，用抗His標記抗體并由蛋白質印跡檢測ChM1L蛋白質，對糖鏈結構進行分析的結果。泳道1為未處理，泳道2為經NANaseII+O-糖苷酶DS+PNGase處理，泳道3為經NANaseII處理，泳道4為經O-糖苷酶DS處理，泳道5為經PNGase處理的樣品的蛋白質印跡結果。
圖7表示對小鼠肋軟骨組織中的ChM1L蛋白質的表達，用抗ChM1L多肽抗體并由免疫染色進行檢測的結果。
圖8表示對在COS7細胞培養液中表達的可溶性人ChM1L蛋白質，用抗FLAG M2親合膠并由親合層析純化，電泳后用考馬士亮藍染色的結果。泳道1為COS7細胞的培養上清，泳道2為純化后的ChM1L蛋白質的電泳結果。
圖9表示人臍帶靜脈內皮細胞的微管結構形成體系用(a)緩沖液，(b)20μg牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，(c)10μg可溶性人ChM1L，(d)20μg可溶性人ChM1L，(e)1μg血小板因子4(platelet factor 4，PF-4)，(f)10μg血小板因子4處理后的結果。
實施發明的方案本發明中，“實質上含有”是指本發明的基因或多肽在保持其功能的范圍內，序列號1、3或5所示的堿基序列，或序列號2、4或6所示的氨基酸序列可以發生置換、插入或缺失等變異。
本發明的ChM1L基因序列可由RACE(Rapid amplification ofcDNA ends，cDNA末端快速擴增；Frohman，M.A.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，8998-9002，1998)法得到，RACE法的概要如下所述。
通常，RACE法是已知cDNA的部分序列時，以此為基礎，高效獲得全長cDNA的方法。設計可使擴增反應從已知序列區域分別向3’末端或5’末端方向延伸的引物，通過PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應；Science，230，1350-1354，1985)法擴增cDNA。實施PCR法時，在已知區域應用特異配對的引物，在3’末端和5’末端應用與通過連接反應等附加的序列配對的引物。因此，通過PCR法擴增的區域含有序列未知的區域。如在后述的實施例中敘述的那樣，DNA擴增片斷的分離純化可采常規方法，例如可以采用凝膠電泳等。由此獲得的DNA片斷等的堿基序列的測定也可以采用常規方法，例如可采用雙脫氧法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467，1977)或Maxam-Gilbert法(Methods in Enzymology，65，499，1980)等進行測定。有關堿基序列的測定也可以利用市售的測序試劑盒等很容易地進行。
在本發明后述的實施例2中雖有更為具體的詳細敘述，但其大致概要如下所述。由人ChM-I的氨基酸序列，在日本DNA數據庫(DDBJDNA data bank of Japan)中，用EST數據庫(dbEST，ESTExpressedsequence tag)進行TBLASTN檢索，檢索出EST檔案中基因庫登記編號為AI123839的序列。AI123839是登記在dbEST的堿基序列片斷，由上述TBLASTN檢索，首次明確它是編碼類似ChM-I的氨基酸序列的新型基因片斷。于是，以該dbEST得到的cDNA部分序列為基礎合成引物，用RACE法完成了對人ChM1L基因的序列測定。之后，同樣測定了小鼠及大鼠ChM1L基因的序列。人、小鼠及大鼠ChM1L基因的序列分別示于序列號1、3及5，其編碼的多肽的氨基酸序列分別示于序列號2、4及6。
本發明的ChM1L基因編碼的多肽由317個氨基酸構成(序列號2、4及6)。ChM1L的氨基酸序列與ChM-I具有同源性，特別是與ChM-I經加工后分泌于細胞外的C末端部分具有高度同源性(圖1(a))。另外，ChM1L的氨基酸序列在人、小鼠和大鼠之間具有高度的同源性(圖1(b))。從氨基酸序列的疏水程度的分析結果來看，ChM1L與ChM-I相同，是具有II型膜蛋白質結構的分子(圖2)。如圖2所示，該多肽和ChM-I均在N末端的數十個氨基酸附近存在膜結合分子特征性的由約20個氨基酸組成的疏水性區域。該多肽為具有II型膜蛋白質結構的分子，也可以由將該多肽在COS7細胞中進行表達的實施例8的結果加以確認(圖4)。
如后述的實施例12所述，可以確認本發明的人ChM1L基因存在于人X染色體上(基因庫登記編號AL035608)。
本發明的ChM1L基因包括cDNA、化學合成的DNA、通過PCR分離的DNA、基因組DNA及它們的組合。該基因組DNA可以使用標準方法，通過形成針對本說明書中公開的ChM1L基因的雜交子進行分離。本發明還包括由該ChM1L基因轉錄的RNA。序列號1、3及5所示本發明的基因序列是與該基因編碼產物各氨基酸殘基對應的密碼子的組合例之一，本發明的ChM1L基因不局限于此，也可以具有將與各氨基酸殘基對應的任一密碼子進行選擇并組合的DNA序列。該密碼子的選擇可以按照常規方法，例如可以考慮所用宿主的密碼子使用頻率(Nucleic Acids Research，9，43-74，1981)。
本發明的ChM1L基因還包括序列號2、4和6所示的氨基酸序列中一部分產生置換、缺失、添加的變異體的編碼DNA序列。這些多肽的制備以及修飾(變異)等即可以通過天然產生的，也可以通過翻譯后修飾或者基因工程方法，例如定點誘變(Methods in Enzymology，154，350，367-382，1987；同100，468，1983；Nucleic Acids Research，12，9441，1984；續生物化學試驗講座1“基因研究方法II”，日本生物化學會編，105，1986)等方法獲得。
本發明的ChM1L基因的制備，以本發明ChM1L基因的序列信息為基礎，可通過常規的基因工程方法很容易地進行(參照《分子克隆》第二版，冷泉港實驗室編著，1989；續生物化學實驗講座“基因研究方法I、II、III”，日本生物化學會編，1986等)。
例如由cDNA文庫(由表達ChM1L基因的適當的起源細胞，通過常規方法制備)，使用本發明基因特有的適當的探針和抗體，通過篩選所希望的克隆制備ChM1L基因(Proc.Natl.Acid.Sci.USA，78，6613，1981；Science，222，778，1983等)。
在上述方法中，作為起源細胞，例如表達ChM1L基因的各種細胞，組織或組織來源的培養細胞。這些細胞的總RNA分離，mRNA的分離和純化，cDNA的轉換(合成)及其克隆均可以按照常規方法進行。此外，cDNA文庫已有市售的商品。本發明中，這些cDNA文庫例如也可以使用CloneTech公司制的各種cDNA文庫等。
由cDNA文庫篩選本發明的ChM1L基因，例如可以按照上述常規方法進行。作為這種篩選方法，例如針對cDNA產生的多肽，用本發明ChM1L基因編碼的多肽的特異性抗體，免疫篩選相對應的cDNA克隆的方法；用選擇性結合目的堿基序列的探針進行噬菌斑雜交的或菌落雜交的方法等；以及這些方法的組合。作為在此使用的探針，例如以本發明ChM1L基因的DNA序列的相關信息為基礎，化學合成的DNA序列；已經獲得的本發明ChM1L基因或其片斷。
此外，制備本發明的ChM1L基因時，優選利用PCR法的DNA/RNA擴增法。采用上述PCR法時，使用的引物可以將已由本發明確定的ChM1L基因序列信息作為基礎，適宜進行設計，并用常規方法進行合成。
實施例2中雖有更為具體的詳細敘述，但其大致概要如下所述。合成含有ChM1L基因編碼序列的引物，利用該引物并通過PCR法擴增ChM1L基因。然后，進行瓊脂糖凝膠電泳，切出目的條帶后，純化DNA。將純化的DNA和質粒載體進行連接，并轉化大腸桿菌。然后，由大腸桿菌的培養液純化質粒，通過DNA測序確認是否插入了目的序列。由此克隆的ChM1L基因，通過使用適當的限制性內切酶，可以轉移到其它質粒載體中或和病毒載體中。
利用由此得到的ChM1L基因(cDNA和基因組DNA)，按照常規方法，可以制作ChM1L基因的表達增加、減弱以及消失的轉基因動物。
以本發明的ChM1L基因的序列信息為基礎，通過利用該基因的一部分或全部堿基序列，可以檢測本發明的ChM1L基因在各種組織中的表達。這可以按照常規方法進行，例如RT-PCR(反轉錄-聚合酶鏈反應)(Kawasaki，E.S.，et al.，Amplification of RNA.In PCR Protocol，AGuide to methods and applications，Academic Press，Inc.，Sandiego，21-27，1989)法，Northern印跡分析(《分子克隆》，冷泉港實驗室，1989)等均可以得到良好的效果。RT-PCR法的引物和的Northern印跡分析的探針，只要是可特異性檢測出ChM1L基因的序列即可，對此沒有特殊的限定，有關序列可以本發明ChM1L基因的堿基序列為基礎，適宜地進行設計。進而，本發明還提供用于檢測ChM1L基因的引物和/或探針。此外，該探針還可以應用在通過Southern印跡分析檢測基因組DNA的過程。
作為檢測ChM1L mRNA的表達的手段，例如實施例6中所述的RT-PCR法。詳細情況雖在實施例6中有所敘述，但大致概要如下所述。
摘除各組織并提取RNA后，通過反轉錄反應合成cDNA。將此cDNA作為模板，進行PCR反應，得到的反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照射下觀察條帶，進而檢測各組織中ChM1L基因的表達量。結果表明，成熟小鼠個體的各組織中，在腦、眼球、骨骼肌、肋骨和甲狀腺中有ChM1L mRNA的表達(圖3(a))。另一方面，可以確認ChM-I mRNA表達于小鼠的眼球、胸腺、軟骨及肋骨中(Shukunami etal，Int.J.Dev.Biol 43，39-49，1999)。由此，可以明確ChM1L和ChM-I在生物體內的不同組織中進行表達，進而可以認為其生理功能有所不同。此外，可以確認ChM1L在未發現有ChM-I表達的組織，如腦、骨骼肌及甲狀腺中有所表達。
此外，由于ChM1L可在表達ChM-I且對血管侵入具有抵抗性的組織，如眼球和包括軟骨在內的肋骨中表達，因此可以認為ChM1L參與了血管新生的過程。由這些結果進而可以認為，ChM1L與阿耳茨海默病等腦相關疾病、肌肉萎縮癥等骨骼肌相關疾病、甲狀腺機能亢進病等甲狀腺相關疾病、糖尿病性視網膜病等眼球相關疾病、變形性關節炎和風濕性疾病等軟骨組織相關疾病、以及包括癌癥在內的血管新生相關疾病有關。由此，可以認為本發明的ChM1L基因、ChM1L多肽、包括與ChM1L結合的抗體在內的ChM1L對抗物和刺激物、促進或減弱ChM1L表達的物質等可用作這些疾病的治療藥。此外，這里所說的對抗物和刺激物等物質可以是肽、蛋白質及低分子化合物等，只要具有上述功能，就對物質的性狀沒有限定。
已經確認ChM1L mRNA在胎兒的各組織，如眼球、腎臟、胃、肋骨及氣管中表達(圖3(b))。成熟小鼠個體中未發現ChM1L mRNA在腎臟和胃中表達，而在胎兒的這些組織中則有ChM1L mRNA的表達，因此認為ChM1L與這些臟器的發育以及形態形成有關。進而認為，在成熟個體中ChM1L也可能參與這些臟器的修復和再生。另外，已經明確在氣管中也有ChM1L mRNA的表達。因此，本發明的ChM1L基因、ChM1L多肽、包括與ChM1L結合的抗體在內的ChM1L對抗物及刺激物、促進和減弱ChM1L基因表達的物質等，有可能用作慢性腎功能衰竭等腎臟相關疾病、胃癌或胃潰瘍等胃相關疾病、以及慢性支氣管炎和哮喘等氣管相關呼吸系統疾病的治療藥。
在胎兒發育階段，ChM1L mRNA的表達在妊娠第10天非常弱，第11天到第13天表達量上升(圖3(c))。另一方面，ChM-I也與ChM1L相同，隨著胎兒的發育，表達量上升，但在妊娠第10天以及第11天，明顯表現出比ChM1L有更強的表達。在胎兒的發育階段，ChM1L比ChM-I更晚出現表達上升，說明兩種分子在胎兒發育時具有不同的功能。此外，在胎兒的發育階段，ChM1L的表達上升，說明ChM1L與臟器和骨骼的形成密切相關。進而，本發明的ChM1L基因、ChM1L多肽、包括與ChM1L結合的抗體在內的ChM1L對抗物及刺激物、促進和減弱ChM1L基因表達的物質等有可能作為臟器發育不全導致的先天疾病的治療藥，以及在后天性臟器損傷時作為再生及修復臟器的藥物使用。此外，ChM1L和ChM-I在成熟個體及胎兒各組織中的表達，以及在胎兒發育階段的表達有所差異，因此將這些分子以及這些分子的前藥作為各種疾病的治療藥使用時，其用途有可能會有差異。
利用本發明的ChM1L基因的序列，能夠通過基因工程方法制備該基因編碼的多肽。
該多肽的制備，可以通過制備可在宿主細胞中表達本發明ChM1L基因的重組DNA，將該重組DNA導入宿主細胞進行轉化，培養該轉化體來進行。
此時，作為宿主細胞，真核宿主細胞和原核宿主細胞均可以使用。
該真核宿主細胞包括脊椎動物、酵母及昆蟲細胞等。作為脊椎動物細胞，例如CHO細胞及COS細胞等。
作為脊椎動物的表達載體，通常可以使用具有位于表達基因的上游的啟動子、多聚腺苷化位點及轉錄終止序列等的載體。作為該表達載體，例如具有SV40早期啟動子的pSV2dhfr(Mol.Cell.Biol.，854，1981)，pcDNA3.1(+)(Invitrogen公司)及pCAGGS(Gene，108，193-200，1991)等。
在真核細胞中表達目的基因的方法，在該領域中眾所周知有多種體系。
例如，作為在酵母中的表達體系，例如特開昭57-159489號公報中記載的“酵母中多肽的表達”；作為在昆蟲細胞中的表達體系，例如特開昭60-37988號公報中記載的“重組桿狀病毒表達載體的制備方法”；作為在哺乳動物細胞中的表達體系，例如特開平2-171198號公報中記載的“真核表達的改良”；當然除此以外還存在很多種體系。
本發明的ChM1L基因，例如也可以在大腸桿菌、枯草桿菌及鏈霉菌等原核宿主細胞中表達。例如，作為上述宿主的大腸桿菌，通常使用大腸桿菌K12株等；作為載體，通常使用pBR322及其改良載體，但不局限于此，也可以利用眾所周知的各種菌株及載體。作為啟動子，例如大腸桿菌乳糖啟動子(lac)、大腸桿菌trp等啟動子，但不限于此。上述啟動子均已特性化，并為業內人士所熟知，這些啟動子可以通過合成獲得，也可以由已知的載體構建。
本發明的例示DNA序列、質粒及病毒可以進行多種修飾和改變。例如，可根據遺傳密碼的簡并性，在多肽的密碼區域范圍內進行核苷酸的置換。這種序列可由本發明ChM1L基因的堿基序列或由其編碼的多肽的氨基酸序列推測出來，并通過下述以往的合成方法進行構建。這種合成方法基本上可按照Itakura等人的方法(Itakura et al，Science198，1059，1997)以及Crea等人的方法(Crea et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75，5765，1978)進行。因此，本發明并不局限在特意例示的堿基序列、質粒及病毒。
將由此得到的本發明的目的重組DNA導入宿主細胞的方法以及轉化方法，可采用常規的各種方法。得到的轉化體可按照常規方法進行培養，并通過該培養生產本發明ChM1L基因編碼的多肽。作為用于該培養的培養基，可根據采用的宿主細胞，適宜選擇慣用的各種培養基，其培養也可以在適于宿主細胞繁殖的條件下進行。
經過上述過程，在轉化體的細胞內、細胞外或細胞膜上生成該多肽。該多肽可根據需要，通過利用其物理性質、化學性質等的各種分離操作[參照“生物化學數據手冊II”，1175-1259頁，第1版第1次印刷，1980年6月23日株式會社東京化學同人發行；Biochemistry，25(25)，8274-8277(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313-321(1987)等]進行分離純化。作為該方法，具體而言，例如通常的重構建處理、多肽沉淀劑處理(鹽析法)、離心分離、滲透壓破碎法、超聲波破碎、超濾、凝膠過濾，以及吸附色譜、離子交換色譜、親合色譜、高速液相色譜(HPLC)等各種液相色譜，透析法及這些方法的組合等。此外，通過表達該多肽與親合標記融合的蛋白質，利用該標記可以進行親合純化。此處所述的親合標記，例如多聚組氨酸標記(His標記，Sisk et al，J.Virol.68，766，1994)及FLAG標記(Hopp et al，Biotechnology6，1204-1210，1988)。與這些親合標記融合的ChM1L多肽的表達及檢測，可按照實施例8和9所述的方法進行，利用這些標記也可以進行ChM1L多肽的純化。
對于本發明ChM1L基因編碼的多肽的制備方法，實施例8中雖有更為具體的詳細敘述，但大致概要如下所述。
將本發明的人和小鼠ChM1L基因以及C末端融合有His標記的ChM1L蛋白質的編碼基因克隆到pcDNA3.1(+)載體中(實施例4)，并用得到的載體轉染COS7細胞。約48小時后，回收培養上清及細胞成分，通過蛋白質印跡法進行ChM1L重組蛋白質的檢測。但由培養上清及細胞成分均未檢測出ChM1L蛋白質的表達。
因此，對于檢測ChM1L融合蛋白質表達的條件進行了研究，結果通過使用pCAGGS作為表達載體，使COS7細胞中該多肽表達的檢測成為可能。將本發明的人和小鼠ChM1L基因以及C末端融合有His標記的ChM1L蛋白質的編碼基因克隆到pCAGGS載體(實施例4)，并用得到的載體轉染COS7細胞。約48小時后，回收培養上清以及細胞成分，并通過蛋白質印跡法進行ChM1L重組蛋白質的檢測。在培養上清中未檢測到有ChM1L蛋白質的表達，但在細胞成分中檢測到在40kDa附近有兩個條帶。
由此，可以明確ChM1L蛋白質是膜結合性蛋白質。另一方面，在COS7細胞中表達ChM-I時，可以確認ChM-I作為可溶性蛋白質分泌表達在培養上清中(Hiraki et al，J.Biol.Chem.，272，32419-32426，1997)。通過對在COS7細胞中表達情況進行分析，可以確認ChM1L和ChM-I是具有不同結構的蛋白質。即，可明確ChM1L是細胞膜結合型的蛋白質，ChM-I是分泌型的蛋白質，并且兩個分子具有不同的加工機制。此外，在ChM1L蛋白質的兩個條帶中，高分子量的條帶是被N結合型的糖鏈修飾的形式，這可由后述實施例10加以明確(圖6)。
由上述方法表達的ChM1L蛋白質，可以利用ChM1L特異的抗體或針對融合6個組氨酸殘基的標記(His標記)等的抗體以及鎳柱等進行親合純化。
本發明的ChM1L基因編碼的多肽可以是膜結合性多肽，也可以是不具備膜結合性的可溶性多肽。例如，作為膜結合性多肽表達在細胞膜上后，經切斷有可能轉換為可溶性的多肽等。在COS7細胞中表達時，ChM1L蛋白質經檢測為膜結合型的蛋白質(實施例8)，但宿主細胞和培養條件等變化時，經加工有可能轉變為為可溶性蛋白質。而缺少跨膜區域的可溶性的該多肽，可以在N末端融合異源信號肽后進行表達。
實施例9中有更為具體的詳細敘述，但可溶性ChM1L蛋白質表達方法的大致概要如下所述。
構建在pCAGGS載體的N末端整合了融合前胰島素原信號序列、FLAG標記、ChM1L細胞外區域的C末端的蛋白質編碼堿基序列的載體(實施例5)。使用該載體表達的ChM1L蛋白質，前胰島素原的信號肽被切斷后，成為可溶性蛋白質分泌到培養液中(實施例9，圖5)。
分泌到培養液中的可溶性ChM1L多肽，用抗ChM1L抗體，或者因為融合有FLAG標記，可以使用抗FLAG抗體(Sigma公司)進行純化。此外，通過用腸激酶切斷FLAG融合蛋白質，可以除去FLAG標記。
實施例13中雖有更為具體的詳細敘述，但可溶性ChM1L蛋白質純化方法的大致概要如下所述。
使用脂轉染胺試劑(GIBCO BRL公司)并按照產品說明書，將pSF-shChM1L轉染到COS7細胞中，約48小時后，回收培養上清。從此培養上清，用抗FLAG M2親合膠(Sigma公司)進行親合層析，純化可溶性的人ChM1L蛋白質(圖8)。
本發明的ChM1L多肽可以用作多肽純化試劑。結合于固體支持材料的該多肽，可通過親合層析純化可以結合該多肽的多肽。作為能夠結合ChM1L多肽的多肽，例如可溶性多肽、膜結合性多肽及抗體等。可溶性的ChM1L多肽適于體外添加到細胞培養液中，以及體內的靜脈給藥等。
為了檢測本發明ChM1L多肽的活性，利用人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial CellsHUVECs)分析了有無血管新生抑制作用。后述的實施例14中有詳細的描述，而大致概要如下所述。將HUVECs在涂布母膠(BECTON DICKINSON)的平板上進行培養時，血管內皮細胞形成微管結構(圖9)。在該培養液中添加用上述的親合層析純化的ChM1L多肽時，HUVECs的微管結構的形成受到抑制(圖9)。由此，可以明確ChM1L具有血管新生抑制作用，并且也可明確可溶性的ChM1L多肽適于作為糖尿病性視網膜病、癌、類風濕性關節炎等與血管新生有關的疾病的治療藥使用。
可以用本發明的ChM1L基因編碼的多肽制備特異性抗體。此時所使用的抗原是根據上述基因工程手段大量生產的多肽或化學合成的多肽，得到的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，這些抗體可以有效地用于該多肽的純化、測定、標識等。因此，針對該多肽的多克隆抗體及單克隆抗體可用于該多肽(直接或者間接)介導的疾病的治療以及治療方法的開發，也可以作為上述疾病的診斷試劑應用。
與本發明ChM1L基因編碼的多肽特異結合的抗體，可按實施例7所示進行制備。制備的抗ChM1L多肽抗體與該多肽的特異性結合，可以由實施例8的蛋白質印跡結果進行確認(圖4)。
抗ChM1L多肽抗體也可以如實施例11所示，用于組織切片的免疫染色。用抗ChM1L多肽抗體對肋軟骨組織進行染色時，包圍在軟骨組織周圍并呈現成纖維細胞樣的扁平形態的細胞被特異性的染色(圖7)。另一方面，ChM-I特異表達在軟骨細胞，通過免疫染色可以明確蓄積在軟骨細胞以及軟骨細胞外的基質中(Hiraki et al，J.Biol.Chem.，272，32419-32426，1997)。由此，可以明確在包括軟骨在內的組織中，ChM1L和ChM-I表達于不同細胞中。進而，可以明確ChM1L和ChM-I是具有不同功能的分子。
含有通過免疫染色明確表達ChM1L蛋白質并呈現成纖維細胞樣形態的細胞群的組織，以往稱為軟骨膜(perichondrium)(Suda et al，骨形成和骨吸收以及它們的調節因子1、2，1995)。對于所謂軟骨膜的組織，目前尚沒有明確的定義，在本說明書中指的是含有包圍在軟骨細胞周圍并顯示成纖維細胞樣形態的細胞的組織。
存在于軟骨膜的細胞在內軟骨性骨化過程中，是軟骨組織成長時的軟骨細胞的供給源。因此，軟骨膜是在發育過程中的骨骼形成和成體中骨、軟骨損傷時供給軟骨細胞的重要組織。軟骨組織的特征在于不存在血管、神經、淋巴管，而由于軟骨膜存在于軟骨組織和其他組織的交界處，因此認為軟骨膜能夠控制血管、神經、淋巴管向軟骨組織的侵入。類似于此，可以認為軟骨膜是重要的組織，但不是如上所述的一些有明確定義的組織，對此目前也尚未進行詳細的研究。作為其原因，例如尚未完全明確軟骨膜特異表達的分子。
進而，如果可以明確包圍在軟骨組織周圍的、所謂軟骨膜的組織有特異表達的分子，則該分子可以作為重要的工具用于軟骨膜以及軟骨組織的研究。
本發明的ChM1L是已明確的軟骨膜特異表達的唯一分子，并認為該ChM1L可以控制血管、神經、淋巴管向軟骨組織的侵入。
因此，ChM1L基因的表達和本發明所包含的ChM1L功能的分析結果，為今后包括軟骨膜以及軟骨組織在內的、與表達ChM1L的其它組織相關的病因研究和治療方法的開發提供了一種新的視點。
因此，本發明的ChM1L基因、ChM1L多肽、包括結合ChM1L的抗體在內的ChM1L對抗物及刺激物、促進或者減弱ChM1L基因表達的物質等，可以適用于與表達上述ChM1L的細胞相關的疾病的治療藥。
由上述mRNA的表達分析以及免疫染色的結果，明確了本發明的ChM1L基因及其編碼的多肽表達于腦、眼球、骨骼肌、甲狀腺、包括軟骨在內的肋骨、腎臟、胃、氣管以及包圍在軟骨組織周圍并顯示成纖維細胞樣扁平形態的細胞。因此，可以認為本發明的ChM1L基因及其編碼的多肽與表達它們的上述組織相關疾病，例如糖尿病性視網膜病、肌肉萎縮癥、甲狀腺機能亢進、慢性腎功能衰竭、胃癌、慢性支氣管炎、變形性關節炎以及類風濕性疾病等相關。
進而，認為本發明的ChM1L基因、ChM1L多肽、包括結合ChM1L的抗體在內的ChM1L對抗物及刺激物、促進或者減弱ChM1L基因表達的物質等，可以適用于上述疾病的治療藥。
實施例以下，結合實施例更為具體地說明本發明，但本發明的范圍不限于這些實施例。實施例1.ChM1L氨基酸序列的分析對ChM1L和ChM-I的氨基酸序列的同源性進行了比較(圖1(a))。氨基酸序列用字母表1文字表示。雖然ChM1L整個分子與ChM-I具有同源性，但已明確與ChM-I經加工后分泌在細胞外的C末端具有高度的同源性。
對人、小鼠以及大鼠的ChM1L的氨基酸序列的同源性進行了比較(圖1(b))。ChM1L多肽在人、小鼠以及大鼠中均由317個氨基酸構成。三者之間有300個氨基酸是相同的(約95％)。
圖2示出了ChM-I和ChM1L的疏水度。ChM-I以及ChM1L的N末端均出現了疏水性的大峰。這種疏水性區域是細胞膜結合型的蛋白質的特征，這說明ChM-I和ChM1L同樣，是II型膜結合性蛋白質。實施例2.ChM1L基因的克隆由日本DNA數據庫(DDBJDNA data bank of Japan)，利用人ChM-I的氨基酸序列(基因庫登記編號M16441)，在表達序列標記數據庫(dbEST)中進行TBLASTN檢索。其結果，檢索出EST文檔中基因文庫登記編號為AI123839的、和ChM-I具有同源性的新型基因片斷。
使用CloneTech公司制的Human fetus Marathon-ReadyTMcDNAb，并按照產品說明書，用RACE法進行cDNA的擴增。根據由上述dbEST得到的堿基序列合成引物，按照產品說明書使用ExTaq聚合酶(寶酒造)，采用GeneAmpPCR系統9700(PE Applied Biosystems公司)，反應循環為96℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘，共進行30個循環，最后于72℃保溫6分鐘，得到PCR反應液，在此反應液中按1/10量添加模板，于相同條件進行2次PCR。
得到的PCR產物用加入溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠進行電泳，通過在紫外線下觀察該凝膠研究DNA條帶。從凝膠中切出擴增的片段，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)并按照產品說明書進行純化。
純化片段的堿基序列使用PE Applied Biosystems公司制的DNA測序儀(ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer)以及ABI PRISMTMBigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit，并按照產品說明書進行測定。
人ChM1L cDNA的核酸堿基序列示于序列號1，氨基酸序列示于序列號2。
由于序列號1所示的人ChM1L基因編碼的氨基酸序列與ChM-I具有同源性，因此將此基因稱為ChM1L基因(ChM-I like gene)。
通過PCR擴增人ChM1L cDNA的編碼序列(CDS)，瓊脂糖凝膠電泳后進行純化，使用pCR-ScriptTMAmp克隆試劑盒(Stratagene公司)并按照產品說明書進行克隆。PCR所用的引物序列示于序列號7(正向引物)和序列號8(反向引物)。整合到載體中ChM1L基因序列，用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems公司)和ABI PRISMTMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionkit并按照產品說明書進行測序。
用人ChM1L氨基酸序列(序列號2)，與上述人的情況同樣，進行TBLASTN檢索。其結果，檢索出EST文檔中基因庫登記編號為AV009191的編碼小鼠ChM1L的基因片斷，EST文檔中基因庫登記編號為AI112003的編碼大鼠ChM1L的基因片斷。用CloneTech公司制的Mouse 11-day Embryo Marathon-ReadyTMcDNA以及Rat Skeletalmuscle Matathon-ReadyTMcDNA，與分離人ChM1L基因時同樣，通過RACE法測定小鼠和大鼠ChM1L基因序列。
小鼠ChM1L cDNA的核酸堿基序列如序列號3所示，氨基酸序列如序列號4所示。大鼠ChM1L cDNA的核酸堿基序列示于序列號5，氨基酸序列示于序列號6。
通過PCR擴增小鼠和大鼠ChM1L cDNA的編碼序列(CDS)，瓊脂糖凝膠電泳后進行純化，用pCR-ScriptTMAmp克隆試劑盒(Stratagene公司)并按照產品說明書進行克隆。小鼠基因的PCR使用的引物序列如序列號9(正向引物)和序列號10(反向引物)所示，大鼠基因的PCR使用的引物序列如序列號11(正向引物)和序列號12(反向引物)所示。整合到載體的ChM1L基因序列按照產品說明書，使用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems公司)和ABI PRISMTMBigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionkit進行測序。
整合本實施例構建的人、小鼠和大鼠ChM1L基因的載體用以下略稱表示。
含有人ChM1L基因的載體pCR-hChM1L含有小鼠ChM1L基因的載體pCR-mChM1L含有大鼠ChM1L基因的載體pCR-rChM1L實施例3.含有C末端融合6個組氨酸殘基的人以及小鼠ChM1L蛋白質的編碼基因的載體的構建通過PCR擴增人和小鼠ChM1L cDNA編碼區(CDS)，瓊脂糖凝膠電泳后進行純化，用pCR-Script SK(+)載體(Stratagene公司)和pCR-ScriptTMAmp克隆試劑盒(Stratagene公司)并按照產品說明書進行克隆，其中，對pCR-Script SK(+)載體進行了改良，以便在表達蛋白質的C末端融合6個組氨酸殘基(His標記)。人基因的PCR中所用的引物序列如序列號7(正向引物)和序列號13(反向引物)所示，小鼠基因的PCR中所用的引物序列如序列號9(正向引物)和14(反向引物)所示。對ChM1L的C末端融合His標記的蛋白質的編碼堿基序列是否整合進載體，可用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems公司)和ABI PRISMTMBigDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit并按照產品說明書加以確認。C末端融合His標記的人和鼠ChM1L的氨基酸序列分別如序列號17和18所示，其編碼核酸堿基序列分別如序列號15和16所示。
整合本實施例構建的融合His標記的人、小鼠和大鼠ChM1L蛋白質編碼基因的載體用以下略稱表示。
含有融合His標記的人ChM1L蛋白質編碼基因的載體pCR-hChM1LHis含有融合His標記的小鼠ChM1L蛋白質編碼基因的載體pCR-mChM1Lhis實施例4.表達載體的構建以在哺乳動物細胞中表達ChM1L基因為目的，從上述pCR-hChM1L、pCR-mChM1L、pCR-hChM1LHis以及pCR-mChM1LHis載體中，用限制性內切酶EcoRI和NotI切出CDS，瓊脂糖凝膠電泳后，純化目的條帶，將純化的片斷用Ligation high(東洋紡)并按照產品說明書連接到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司)和pCAGGS載體(Gene，108，193-200，1991)中。將連接反應液用大腸桿菌JM109感受態細胞(寶酒造)并按照產品說明書進行轉化。純化質粒后，通過限制性酶切和瓊脂糖電泳確認是否整合了目的基因。
本實施例構建的載體用以下略稱表示。
含有hChM1L、mChM1L、hChM1LHis和mChM1L基因的pcDNA3.1(+)載體pcDNA-hChM1L、pcDNA-mChM1L、pcDNA-hChM1LHis和pcDNA-mChM1LHis含有hChM1L、mChM1L、hChM1LHis和mChM1L基因的pCAGGS載體pCAGGS-hChM1L、pCAGGS-mChM1L、pCAGGS-hChM1LHis和pCAGGS-mChM1LHis實施例5.融合FLAG標記的人可溶性ChM1L蛋白質表達載體的構建在本實施例中所述的FLAG標記(Sigma公司)是由8個氨基酸構成的標記肽(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys)，最后的5個氨基酸(Asp Asp Asp Asp Lys)是腸激酶的識別序列。本實施例所構建的載體，可表達在N末端融合了前胰島素原信號序列、FLAG標記、ChM1L細胞外區域的C末端的蛋白質。用該載體表達的蛋白質，如后述實施例9中的詳細敘述，前胰島素原信號序列被切斷后，成為可溶性蛋白質分泌到培養液中。用該載體表達的蛋白質融合有FLAG標記，因此可以用抗FLAG抗體(Sigma)純化，也可以用腸激酶消化融合蛋白質，以去除FLAG標記。
構建在pCAGGS載體中整合編碼N末端前胰島素原和FLAG標記(序列號20)的堿基序列(序列號19，含在Sigma公司制的pFLAG-CMV-1載體中)的載體。通過PCR擴增編碼含有序列號2所示人ChM1L的氨基酸序號212至317及終止密碼子的堿基序列(序列號1的堿基序列號684至1020)，將該擴增產物整合到pSF載體的FLAG編碼堿基序列的3’端。PCR所用的引物序列如序列號21(正向引物)和序列號8(反向引物)所示。對構建的載體中是否整合了目的堿基序列，用ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems公司)和ABI PRISMRTMBigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction kit并按照產品說明書進行確認。在本實施例中，整合到載體中的核酸堿基序列示于序列號22，其編碼的氨基酸序列示于序列號23。本實施例構建的載體略稱為pSF-shChM1L。實施例6.ChM1L mRNA的表達分析成熟個體(10周齡)各組織中ChM1L mRNA的表達分析圖3(a)解剖10周齡的C57BL/6小鼠，取出各組織，立刻用液氮冷凍。細細粉碎冷凍的組織，用ISOGEN(日本基因公司)并按照產品說明書提取各組織的總RNA。將得到的各組織的總RNA lμg作為模板，用Superscript II preamprefication kit(GIBCO BRL公司)并按照產品說明書合成20μL cDNA。RT-PCR反應體系的總液量定為50μL，用0.5μL各組織的cDNA和0.25μL ExTaq polymerase(寶酒造)，添加正向引物(序列號9)和反向引物(序列號10)并使其終濃度分別為0.2μL，用GeneAmpPCR System 9700(PE Applied Biosystems公司)，以96℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘擴增30個循環。得到的反應液在加入了溴化乙啶的1％瓊脂糖凝膠中進行電泳，將凝膠在紫外線照射下攝影，研究各組織中ChM1L mRNA的表達情況。
如圖3(a)所示，ChM1L mRNA在成熟小鼠個體各組織的腦、眼球、骨骼肌、肋骨以及甲狀腺中表達。ChM-I在小鼠各組織的眼球、胸腺、軟骨以及肋骨中表達。這說明ChM1L和ChM-I在生物體內的不同組織中表達，并且它們的生理功能不同的。胎兒(妊娠第17天)各組織的ChM1L mRNA表達的分析圖3(b)切開C57BL/6小鼠妊娠第17天的子宮，取出胎兒，將各組織取出后，立刻液氮冷凍，從凍結的組織中提取總RNA、合成cDNA、進行RT-PCR等按上述<成熟小鼠個體各組織中ChM1L mRNA的表達分析>進行。
如圖3(b)所示，ChM1L mRNA在胎兒各組織的眼球、腎臟、胃、肋骨以及氣管中表達。ChM1L mRNA在小鼠胎兒的腎臟和胃中表達，而在成熟小鼠個體中卻未見表達。因此，ChM1L有可能與這些臟器的發生以及形態形成有關，并有可能參與臟器的修復和再生。此外，在氣管也有ChM1L mRNA的表達。胎兒發育階段ChM1L mRNA的表達分析圖3(c)切開C57BL/6小鼠妊娠第10天到出生日各日齡的子宮，取出胎兒，將胎兒整體用液氮冷凍。從冷凍的胎兒中提取總RNA、合成cDNA、進行RT-PCR等按上述<成熟小鼠個體各組織中ChM1L mRNA的表達分析>進行。
ChM-I mRNA的分析，使用正向引物(序列號23)和反向引物(序列號24)并在同樣條件下進行。
如圖3(c)所示，在胎兒發育階段ChM1L mRNA的表達，在妊娠第10天非常弱，第11天到第13天持續上升。另一方面，ChM-I的表達和ChM1L同樣呈上升趨勢，但妊娠第10天和第11天明顯地顯示出比ChM1L有更強的表達。進而，在胎兒發育階段，ChM1L地表達上升遲于ChM-I，這說明兩種分子對于胎兒發育具有不同的功能。實施例7.抗ChM1L肽多克隆抗體的制備化學合成在人ChM1L的序列號2所示245～252殘基的序列C末端具有半胱氨酸的肽。在該合成肽上偶聯MBS/KLH(間-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥琥珀酰亞胺酯/匙孔血藍蛋白質，BoehringerMannheim公司)。將該復合體溶解在生理鹽水中后，加入等量的FCA(弗氏完全佐劑)，經超聲波處理后調制成乳液。將此乳液注入到兔子的皮下，進行初次免疫。自初次免疫4周后，使用FIA(弗氏不完全佐劑)在大腿肌肉上進行追加免疫，之后以約2周或4周為間隔，通過皮下注射進行4次免疫。追加免疫期間從耳廓部分采血，在最終免疫后進行全采血，分離血清，通過肽柱進行親合純化，得到抗ChM1L肽抗體。實施例8.人和小鼠ChM1L重組蛋白質的蛋白質印跡分析圖4用脂轉染胺試劑(GIBCO BRI公司)并按照產品說明書，將pCAGGS、pCAGGS-hChM1L和pCAGGS-mChM1L(圖4(a)和(c))以及pCAGGS、pCAGGS-hChM1LHis和pCAGGS-mChM1LHis(圖4(b)和(d))轉染到COS7細胞。轉染完了大約48小時后，將培養上清和細胞成分進行12.5％膠濃度的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)，電泳結束后將轉印到硝酸纖維素膜上。進行一抗反應和二抗反應，用ECLplus試劑(AmershamPharmacia公司)并按照產品說明書進行顯色反應。轉染pCAGGS、pCAGGS-hChM1L和pCAGGS-mChM1L時的蛋白質印跡，一抗是上述實施例中所述的抗ChM1L多肽抗體，二抗是辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔IgG抗體(Dako公司)；轉染pCAGGS、pCAGGS-hChM1LHis和pCAGGS-mChM1LHis時的蛋白質印跡，一抗是抗His標記抗體(Invitrogen公司)，二抗是HRP標記的抗小鼠IgG抗體(Amersham Pharmacia公司)。
用與蛋白質印跡相同的樣品進行SDS-PAGE，考馬氏亮蘭(CBB)染色的結果如圖4(a)和(b)所示。
蛋白質印跡的結果表明，在全部培養上清中沒有ChM1L條帶。細胞成分如圖4(b)和(d)所示，重組ChM1L蛋白質用抗ChM1L肽抗體或抗His標記抗體，在40kDa附近均可以檢測到兩個條帶。在后述實施例中也有詳細闡述，通過糖鏈結構的分析，確認高分子量的條帶為結合N結合型的糖鏈的形式。實施例9.可溶性人ChM1L重組蛋白質的蛋白質印跡分析圖5用脂轉染胺試劑(GIBCO BRL公司)并按照產品說明書，將pCAGGS和pSF-shChM1L轉染到COS7細胞。將培養上清進行12.5％膠濃度的SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素膜上。一抗使用抗FLAG M2抗體(Sigma公司)，二抗為HRP標記的抗小鼠IgG抗體(Amersham Pharmacia公司)。用ECLplus試劑(Amersham Pharmacia公司)并按照產品說明書進行顯色反應。
如圖5所示，可溶性人ChM1L蛋白質在17～18kDa附近檢測出一個條帶。實施例10.ChM1L重組蛋白質的糖鏈結構分析用脂轉染胺試劑(GIBCO BRL公司)并按照產品說明書、將pCAGGS-mChM1Lhis轉染到COS7細胞。向平皿中添加含2％SDS的PBS，用細胞刮刀回收細胞。將此懸濁液在95℃加熱60分鐘后，其上清用SDS-OUTMSDS Precipitation kit(Pierce公司)處理，除去SDS。得到的蛋白質溶液用Enzymatic Deglycosylation kit(BIO RAD公司)并按照產品說明書，用NANase II、O-糖苷酶DS和PNGaseF處理上述蛋白質溶液，進行糖鏈消化反應。將該反應液進行12.5％膠濃度的SDS-PAGE后，轉印到硝酸纖維素膜上。一抗為抗His標記抗體(Invitrogen公司)，二抗為HRP標記的抗小鼠IgG抗體(AmershamPharmacia公司)。用ECLplus試劑(Amersham Pharmacia公司)并按照產品說明書進行顯色反應。
如圖6所示，ChM1L蛋白質的高分子量條帶，只有用PNGaseF處理時(泳道2和5)才可消失。這說明ChM1L蛋白質被N結合型的糖鏈所修飾。實施例11.通過免疫染色法分析肋軟骨的ChM1L蛋白質解剖約10周齡的C57BL/6小鼠，取出完整肋骨，在含4％多聚甲醛的10mM磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)中進行固定，用石蠟包埋后，制作切片。用histofine SAB-PO(R)試劑盒并按照產品說明書進行免疫染色的各步驟，其大致概要如下。脫石蠟處理后，用3％過氧化氫水消化內源性過氧化物酶。用PBS洗滌，用10％正常山羊血清封閉后，按1/160稀釋量添加上述抗ChM1L肽抗體，4℃保溫一夜。用兔IgG作為陰性對照。與生物素標記的抗兔IgG抗體和過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白質應后，加入3，3-二氨基聯苯胺·4HCl進行顯色反應，將核用蘇木精染色，封固后進行觀測。
如圖7所示，ChM1L蛋白質表達在肋軟骨組織中存在于軟骨細胞周圍并呈現出扁平狀成纖維細胞樣形態的細胞中。另一方面，在據稱表達ChM-I的軟骨細胞中沒有發現ChM1L的表達。實施例12.人ChM1L基因的染色體圖譜從日本DNA數據庫(DDBJDNA data bank of Japan)，用人ChM1L基因序列(序列號1)，以DDBJ所有數據為對象，進行BLASTN檢索。其結果，檢索出作為ChM1L基因的基因組序列的基因庫登記編號為AL035608的序列。AL035608是位于人X染色體的序列。這表明人ChM1L基因存在于X染色體上。實施例13.可溶性人ChM1L重組蛋白質的純化用脂轉染胺試劑(GIBCO BRL公司)并按照產品說明書，將pSF-shChM1L轉染到COS7細胞，約48小時后回收培養上清。用抗FLAGM2親合膠(Sigma公司)制作親合柱，將培養上清上到柱中。用25mMTris-HCl、150mM NaCl(pH7.4)洗柱3次后，用0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脫，用1/20體積的1M Tris-HCl(pH9.5)中和洗脫液。
將培養上清和洗脫液進行SDS-PAGE后，考馬氏亮蘭(CBB)染色的結果如圖8所示。培養上清中存在多種蛋白質(圖8，泳道1)，洗脫液中可確認出可溶性人ChM1L蛋白質約20kDa的條帶，這說明通過上述操作濃縮并純化了可溶性人ChM1L蛋白質(圖8、泳道2)。實施例14.用人臍靜脈內皮細胞研究血管新生抑制作用內皮細胞專用培養基(EGM-2 Bullet Kit，Clonetics公司)培養人臍靜脈內皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial CellsHUVECs，Clonetics公司)。在12孔平板中添加Growth factor reducedMatrigel(BECTON DICKINSON公司)，添加量為600μL/每孔，37℃保溫30分鐘。用內皮細胞基本培養基(EBM-2，Clonetics公司)將不含肝素的內皮細胞專用培養基稀釋至1/8，用得到的培養基調制含有5×104細胞/mL HUVECs的細胞懸浮液。
在0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)中按1/20體積加入1M Tris-HCl(pH9.5)，用此溶液調制各待測物質溶液，并以200μL/孔的體積量進行處理。作為陰性對照，用上述緩沖液和20μg/孔的BSA(牛血清白蛋白)進行處理。作為陽性對照物質，用1和10μg/孔的血小板因子-4(PF-4、CHEMCON公司)進行處理。可溶性人ChM1L重組蛋白質用10和20μg/孔的實施例13的洗脫組分進行處理。將2mL細胞懸浮液(1×105細胞)和200μL各待測物質溶液混合后，覆蓋于用Growthfactor reduced Matrigel涂布的12孔平板上，9小時后觀察微管結構的形成并照相。其結果如圖9所示。陰性對照HUVECs形成了微管結構(圖9(a)和(b))，但用20μg/孔的ChM1L進行處理時(圖9(d))，和陰性對照相比較，微管結構的形成受到抑制。
這說明ChM1L具有血管新生抑制作用，并可以明確可溶性的ChM1L多肽可以用作糖尿病性視網膜病、癌、類風濕性關節炎等與血管新生有關的疾病的治療藥。
序列表序列表<110>帝人株式會社(TEIJIN LIMITED)<120>新型多肽及其編碼基因<130>PCT<140><141><160>25<170>Patentln Ver.2.1<210>1<211>1200<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(67)..(1020)<400>1ctccacctca gcaggtgtct ctcagtcctc tcaaagcaag gaaagagtac tgtgtgctga 60gagacc atg gca aag aat cct cca gag aat tgt gaa gac tgt cac att 108Met Ala Lys Asn Pro Pro Glu Asn Cys Glu Asp Cys His Ile1 5 10cta aat gca gaa gct ttt aaa tcc aag aaa ata tgt aaa tca crt aag 156Leu Asn Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Lys Ile Cys Lys Ser Leu Lys15 20 25 30att tgt gga ctg gtg ttt ggt atc ctg gcc cta act cta att gtc ctg 204Ile Cys Gly Leu Val phe Gly Ile Leu Ala Leu Thr Leu Ile Val Leu35 40 45ttt tgg ggg agc aag cac ttc tgg ccg gag gta ccc aaa aaa gcc tat252Phe Trp Gly Ser Lys His Phe Trp Pro Glu Val Pro Lys Lys Ala Tyr50 55 60gac atg gag cac act ttc tac agc aat gga gag aag aag aag att tac300Asp Met Glu His Thr Phe Tyr Ser Asn Gly Glu Lys Lys Lys Ile Tyr65 70 75atg gaa att gat cct gtg acc aga act gaa ata ttc aga agc gga aat348Met Glu Ile 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1.一種人基因，它編碼實質上含有序列號2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一種小鼠基因，它編碼實質上含有序列號4所示的氨基酸序列的多肽。
3.一種大鼠基因，它編碼實質上含有序列號6所示的氨基酸序列的多肽。
4.權利要求1所述的人基因，它具有序列號1所示的堿基序列。
5.權利要求2所述的小鼠基因，它具有序列號3所示的堿基序列。
6.權利要求3所述的大鼠基因，它具有序列號5所示的堿基序列。
7.一種人基因編碼的多肽，它實質上含有序列號2所示的氨基酸序列。
8.一種小鼠基因編碼的多肽，它實質上含有序列號4所示的氨基酸序列。
9.一種大鼠基因編碼的多肽，它實質上含有序列號6所示的氨基酸序列。
10.一種寡核苷酸探針，它與權利要求1～6任一項所述的基因的至少一部分雜交。
11.一種重組DNA，它含有權利要求1～6任一項所述的基因。
12.一種轉化體，它由權利要求11所述的重組DNA轉化而來。
13.一種制備上述多肽的方法，其特征在于，培養權利要求12所述的轉化體，并由得到的培養物提取人、小鼠及大鼠基因編碼的多肽。
14.一種單克隆抗體，它與權利要求7～9任一項所述的多肽特異性反應。
15.一種多克隆抗體，它與權利要求7～9任一項所述的多肽特異性反應。
16.一種雜交瘤，它通過融合用權利要求7～9任一項所述的多肽免疫的抗體生成細胞與骨髓瘤細胞獲得，并產生權利要求14所述的單克隆抗體。
17.一種檢測試劑，它含有權利要求10所述的寡核苷酸探針。
18.一種診斷用試劑盒，它含有權利要求7～9任一項所述的多肽、權利要求14所述的單克隆抗體和/或權利要求15所述的多克隆抗體。
19.一種藥物組合物，它包括權利要求7～9任一項所述的多肽。
20.一種藥物組合物，它包括權利要求14所述的單克隆抗體或權利要求15所述的多克隆抗體。
21.一種藥物組合物，它包括與權利要求1～6所述的基因的一部分特異性雜交的反義寡核苷酸。
22.一種藥物組合物，它包括含有權利要求1～6所述的基因的至少一部分的、可用于基因治療的核酸。
23.權利要求1或4所述的人基因，其特征在于，它存在于X染色體上。
24.權利要求7～9所述的多肽，其特征在于，該多肽是細胞膜結合型。
25.一種基因，它編碼權利要求24所述的細胞膜結合型多肽。
26.權利要求7～9所述的多肽，其特征在于，該多肽具有血管新生抑制作用。
27.一種基因，它編碼權利要求26所述的具有血管新生抑制作用的多肽。
全文摘要
本發明提供具有序列號2、4和6所示氨基酸序列的多肽及編碼該多肽的DNA，以及針對該多肽的抗體，以及這些物質的使用。上述氨基酸序列與調節軟骨細胞增殖及分化和具有血管新生抑制作用的軟骨調節因子－I具有同源性。
文檔編號C07H21/04GK1402783SQ00816403
公開日2003年3月12日 申請日期2000年9月29日 優先權日1999年9月29日
發明者山名慶, 長澤幸美, 和田仁, 笠原義典 申請人:帝人株式會社