專利名稱：與g蛋白激酶信號途徑修飾劑形成的n－甲酰基肽受體復合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及在外周血細胞表面上發現的N-甲酰基肽受體，尤其涉及該受體與改變或破壞G蛋白信號途徑的藥劑(尤其是某些N-甲酰基肽)形成的復合物，并涉及通過促炎劑的共刺激改變信號轉導的方法。
背景技術：
人體進化形成了通過使用細菌產生的N-甲酰甲硫氨酰基肽作為吞噬細胞，尤其是嗜中性粒細胞和單核細胞，的化學引誘物，防御細菌感染的機制。N-甲酰基肽中，f-Met-Leu-Phe(FMLP)被鑒定為具有最強的募集吞噬細胞和刺激嗜中性粒細胞釋放溶酶體酶的能力(Showell等，J.Exp.Med.1431154-1169，1976)。隨后顯示，合成的四肽，尤其是f-Met-Ile-Phe-Leu和f-Met-Leu-Phe-Ile，也可以引起嗜中性粒細胞應答(Rot等，Proc.Natl.Acad.Scie.USA 847967-7971，1987)。最初這些肽的效力被歸因于(1)N端甲酰基、(2)甲硫氨酸側鏈、和(3)亮氨酸和苯丙氨酸側鏈。
N-甲酰基肽受體(FPR)cDNA的克隆和之后FPR蛋白一級結構的描繪使N-甲酰基肽作用機制的理解獲得重大突破(Boulay等，Biochemistry 2911123-11133，1990；Boulay等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1681103-1109，1990)。FPR最初是在嗜中性粒細胞和單核細胞上發現的，但隨后顯示FPR也在人腦、肝細胞、樹突細胞、和星形膠質細胞中表達(Lacy等，J.Neuroimmunol.6171-78，1995；Sozzani等，J.Immunol，1553292-3295，1995)。之后分離到另外兩種FPR基因，FPR2(又稱FPRL1和FPRH1)(Bao等，Genomics 13437-440，1992；Murphy等，J.Biol.Chem.2677637-7643，1992；Ye等，Biochem.Biophys.Res.Commun.184582-589，1992)和FPRL2(Bao等，同上)。FPRL1由351個氨基酸組成，與FPR有70％的一致性，但發現它比最初的FPR對FMLP的親和力低400倍(Kd＝1nM)。FPRL2與FPR有56％一致性，與FPRL1有83％一致性。然而，與在單核細胞和嗜中性粒細胞中均表達的FPRL1不同，FPRL2被發現在單核細胞中表達但不在嗜中性粒細胞中表達(Durstin等，Biochem.Biophys.Res.Commun.201174-179，1994)。
FPR含有7個跨質膜疏水結構域，它們通過暴露在細胞外區或細胞內區的親水序列相連接(Murphy，Annu.Rev.Immunol.12593-633，1994)。第一個和第三個胞內環相對較小，分別由5和16個氨基酸組成。羧基端暴露在細胞內區，而N端暴露在細胞外區。細胞內序列還含有G蛋白偶聯域(受體發揮功能所必需的域，見下述)和潛在的磷酸化域。
FMLP結合域似乎定位在FPR的第一個和第三個胞外域中(Quehenberger等，J.Biol.Chem.26818167-18175，1993)。此外，有人還提出了FPR的可相互轉化狀態，即結合FMLP的高親和結合狀態和低親和結合狀態間的交替(Kermode等，Biochem.J.276715-723，1991)。G蛋白被認為可以調節這些可相互轉化狀態。不與G蛋白相連的單獨FPR是低親和狀態，而與G蛋白結合的FPR表現為高親和結合狀態。該模型進一步將與G蛋白結合的FPR分解為三個不同的狀態，這些狀態說明了通過不同肽觀察到的不同效力。狀態I是低親和結合狀態，其中FPR不與G蛋白相連，但它可以在結合G蛋白后轉變為高親和狀態，即狀態II。狀態III是高親和中間步驟，其中受體與配體結合，同時釋放G蛋白的Gα亞基。狀態IV是瞬時的低親和狀態，其中剩下的G蛋白亞基(Gβ和Gγ)與受體解離。G蛋白亞基Gα的解離導致G蛋白發揮效應子功能，引起細胞激活。Sklar等(J.Biol.Chem.2648483-8486，1989)也提出了相似的模型。
根據以上模型，通過狀態III的停留時間可以確定肽的效力(Kermode等，同上)。這些作者提出，最有效的甲酰基肽如fMet-Leu-Phe-Phe和fMet-Leu-Phe-MHBzl可以暫時穩定住并維持狀態III，這就引發了立即的細胞脫粒反應(degranulation response)，而狀態III的持續使得可以產生持續的趨化反應信號，造成最大的遷移。效力較低的甲酰基肽介導高親和狀態III向低親和狀態IV的快速轉變。盡管狀態III時的最初脫粒反應不受影響，但趨化信號傳導能力被最小化并由此限制了細胞的遷移。因此，一般地，可以認為高效力配體通過結合FPR的高親和狀態實現趨化反應，而較低效力的配體通過結合FPR的低親和狀態實現脫粒反應。
還可以使用該模型定義激動劑活性和拮抗劑活性。激動劑穩定激活的受體狀態III，其效力反映了穩定的程度。另一方面，拮抗劑與受體結合，但造成激活的狀態III不穩定并使受體失活。該模型并不限于FPR。
而且，當配體與受體結合而相同或不同的受體對相同或不同配體的隨后刺激出現不應性時，則認為發生了脫敏作用。在細胞激活的正常過程中該脫敏狀態可以在受體占據后形成，從而導致狀態III不穩定；或在受體占據前形成，這樣根本不形成狀態III。當一種刺激劑誘導的不應狀態或受體失活影響到多個未與配體結合的受體時，這種情況被稱作異源性脫敏作用。
研究得最清楚的N-甲酰基肽是f-Met-Leu-Phe(FMLP或fMLP)。然而，體外采用兔嗜中性粒細胞上的受體已經表征了更有效力的肽，尤其是fMet-Leu-Phe-Phe、fMet-Leu-Phe-NHBzl(fMet-Leu-Phe苯甲酰胺)、和fNle-Leu-Phe-Tyr(N-甲酰基-L-正亮氨酰-Leu-Phe-Tyr)(Kermode等，同上)。這些肽顯示出最大的遷移(20-35μm左右)和脫粒作用(大約10-10-10-11的ED50)。較為近來的研究提示，非甲酰基化的肽也可以和FPR結合并能夠充當嗜中性粒細胞功能的有力激活劑。例如，Met-Met-Trp-Leu-Leu是一種有效力的五肽，在活性方面可以和FMLP相比(Chen等，J.Biol.Chem.27023398-23401，1995)。該五肽向N-甲酰基化形式的轉變可以增強其效力100-500倍，這說明盡管生物活性似乎并不嚴格由N-甲酰基化確定，但N-甲酰基化對肽的效力仍有顯著的作用。
對肽的其它修飾顯示，一些肽可以被轉變成FPR的有力激動劑(Derian等，Biochemistry 351265-1269，1996；Higgins等，J.Med.Chem.391013-1017，1996)。這些修飾包括氨基端基團的脲取代和氨基甲酸酯修飾。而且，已顯示，正如通過超氧陰離子的釋放和嗜中性粒細胞與血管內皮的粘著所確定的，改變MLF肽的氨基酸組成也可以將FPR的激動劑轉變為拮抗劑。
人們已深入研究了N-甲酰基肽通過FPR刺激的嗜中性粒細胞的趨化性。甚至在N-甲酰基肽刺激前，嗜中性粒細胞也可以瞬時與內皮細胞上表達的P-選擇蛋白結合。由炎癥部位產生的N-甲酰基肽所介導的嗜中性粒細胞激活將導致嗜中性粒細胞在該部位的聚積。N-甲酰基肽上調嗜中性粒細胞上的L-選擇蛋白，并引導嗜中性粒細胞沿著內皮滾動，之后上調嗜中性粒細胞表面的整聯蛋白。整聯蛋白介導細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，并與內皮上發現的層粘連蛋白、纖連蛋白、victronectin、以及ICAM(細胞間細胞粘著分子)和VCAM(血管細胞粘著分子)結合。當整聯蛋白和ICAM及VCAM結合后，通過與細胞骨架的相互作用，信號被轉導至嗜中性粒細胞的內部。然后嗜中性粒細胞脫掉L-選擇蛋白，并開始沿內皮擴散。之后內皮細胞表面的E-選擇蛋白和ICAM-1的上調將介導嗜中性粒細胞遷移跨過內皮(Luscinskas等，J.Immunol.1461617-1625，1991)。當跨過內皮障礙后，嗜中性粒細胞通過感知N-甲酰基肽的濃度梯度向炎癥部位遷移。一旦達到含有高濃度的該肽的目的地后，嗜中性粒細胞就發動其抗微生物作用。
受激的嗜中性粒細胞快速地激活呼吸爆發氧化酶，該酶催化超氧化物自由基O2-生成。該超氧化物自由基與其它分子反應產生過氧化氫和次氯酸，兩者均是強反應劑，因此可以有效地干擾微生物的功能。脫粒也是一種有效破壞外源微生物的手段。然而，脫粒也會損傷宿主組織。吞噬作用是嗜中性粒細胞清除外源微生物所采用的另一機制。這些功能中的許多都是通過G蛋白、使用磷脂酶(其中的三種已獲得表征)作為第二信使而被激活的。
磷脂酶C，PLCβ2，產生兩種第二信使，即1，4，5-肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DG)。FPR激活過程中產生的G蛋白βγ亞基激活PLCβ2。IP3與某些鈣通道結合，刺激鈣自細胞內儲存庫釋放，導致胞質鈣濃度增加，這可以在用化學引誘物刺激的過程中觀察到。與釋放的鈣一致，DG也激活蛋白激酶C(PKC)。近來文獻(Beaven等，J.of Immunology1605136-5144，1998)報道，G蛋白激活的PLC激酶是體外大鼠腹膜細胞中肥大細胞脫粒的主要途徑，而且這與Ca2+的增加有關。
磷脂酶A2(PLA2)催化質膜內表面的磷脂生成花生四烯酸。花生四烯酸為炎癥介質，如白細胞三烯和前列腺素，提供了前體。PLA2通過促分裂原活化蛋白(MAP)激酶的磷酸化作用被激活。
第三種磷脂酶是磷脂酶D(PLD)，其催化磷脂酰膽堿生成磷脂酸和膽堿。磷脂酸可能參與激活呼吸爆發氧化酶，并在DG的產生中起作用，而DG又激活PKC。然而，PLD的激活需要鈣，且FMLP不能在鈣耗竭的細胞中刺激PLD(Kessels等，J.Biol.Chem.26623152-23156，1991)。此外，似乎G蛋白Arf和G蛋白Rho能調節PLD活性(Brown等，Cell，751137-1144，1993；Cockcroft等，Science 263523-526，1994；Singer等，J.Biol.Chem.27014944-14950，1995)。
蛋白磷酸化在FMLP起始的信號轉導中有著中心作用。有三種主要的蛋白激酶參與FMLP刺激引起的蛋白質磷酸化。
如上討論的，PKC由PLC所產生的DG激活。PKC起到磷酸化絲氨酸和蘇氨酸殘基的作用。PKC由6種不同的同工型組成，其中三種對細胞內鈣敏感(α、β和γ型)，而三種不敏感(δ、ε和ζ型)。嗜中性粒細胞含有α、β和ζ型，但不含γ型。鈣依賴性和DG依賴性PKC(PKC-β)通過從胞質向膜轉移來響應FMLP和佛波酯的刺激。然后，它使大量胞質蛋白磷酸化，如使參與呼吸爆發氧化酶系統的那些胞質蛋白磷酸化。FMLP還可以激活不依賴鈣但依賴DG和磷脂酰絲氨酸的PKC形式，但它們的功能不清。
據報道，MAP激酶(MAPK)可以被Ras和Raf的活性由G蛋白βγ亞基激活。最近的文獻提示，高強度的Ras信號轉導參與誘導細胞凋亡(Bar-Sagi等，J.Mol.Cell Biol.19(9)5892-901，1999)和促進內皮細胞的粘著(Finkel，等，………………)。目前提出Raf在包括細胞存活、生長和分化在內的生長信號中起著重要作用(Rapp，等，………)。C5a和IL-8也可以刺激此激酶途徑(Buhl等，J.Biol.chem.27019828-19832，1995；Knall等，J.Biol.Chem.2712832-2838，1996)。MAP激酶誘導幾種調節蛋白，如胞外信號調節激酶(ERK)-1，的酪氨酸磷酸化。最近的文獻提示，MAPK途徑負責細胞因子的產生；但是，TH-1和TH-2細胞因子、及其它促炎分子如C5a、IL-8和FMLP的激活作用均依賴于G蛋白三聚體信號轉導。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)負責FMLP刺激下觀察到的PI三磷酸(PIP3)的形成。升高的PIP3水平似乎有助于呼吸爆發氧化酶系統的激活、和嗜中性粒細胞中肌動蛋白的聚合(這被認為在調節細胞骨架的改變和細胞的遷移中是重要的)。最近的文獻(Rankin等，J.Exp.Med.188(9)1621-32，1998)報道，升高的PI3激酶水平還可以促進以IL-5激活的G蛋白信號轉導為基礎的嗜酸性粒細胞的脫粒。而且，Sagi-Eisenberg等，Eur.J.Immunol，1998，283468-3478提示，使用PKC和PI3激酶作為中間途徑的G蛋白信號轉導可以通過IgE激活FCεR受體，以釋放組胺和其它參與變應性呼吸道過敏反應的促炎細胞因子。Uckun等，J.of Biolog.Chemistry，第274卷，第38期，1999年9月，第27028-27038頁報道，通過IgE-FCεR的交聯，JAK3激酶途徑中的G蛋白信號轉導導致肥大細胞脫粒。Beaven等，J.ofImmunology，1998，1605136-5144報道，通過PKC的激活和所導致的Ca2+攝取，G蛋白信號轉導也會造成肥大細胞分泌和脫粒。因此，G蛋白可能是IgE抗原攻擊時FCεR1的下游激活作用所必需的，而干擾G蛋白信號轉導的相應能力可能是抑制FCεR受體的下游激活作用的重要基礎。
兔嗜中性粒細胞FPR的幾種拮抗劑已得到鑒定，但造成某些分子成為拮抗劑的性質仍不清楚。FMLP的某些丁氧基羰基類似物表現出可以競爭性抑制趨化肽誘導的細胞激活，其中BocPLPLP被發現最為有效(Schiffman等，FEBS Lett.1171，1980；Freer等，Biochemisrty192404，1980；Kanaho等，J.Leukocyte Biol.47420，1990)。環孢菌素H，一種環十一肽，是環孢菌素A的類似物，也顯示出對甲酰基肽受體具有拮抗活性(Wenzel-Seifert等，J.Immunol.1504591-4599，1993)。此外還鑒定到一種天然存在的甲酰基肽受體拮抗劑，其是一種來源于逆轉錄病毒的六肽(Oostendorp等，J.Immunol.1491010，1992)。然而，這些拮抗劑均不能以高親和力與甲酰基肽受體結合，因此不能實際用作研究工具或抗炎癥藥物。
有趣的是，Inflammation，第5卷，第1期，第13-16頁(1981)中報道，N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸可以抑制肥大細胞的脫粒。該文獻報道，兩種結構不同的趨化肽，即胃酶抑制劑和N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸，可以抑制由于皮內注射40/80抗大鼠IgE血清、或分離自小牛肺的大分子陰離子透性因子引起的大鼠皮膚血管透性增加。據報道，這些肽似乎直接作用于肥大細胞。因為FPR從未被報道過在肥大細胞上表達，所以該抑制的機制不清。
明顯地，關于FPR的功能和作用機制，有許多問題仍未有答案。而且，FPR在非白細胞如在腦和樹突細胞中表達的這一發現提示，FPR可能在其它細胞類型中有著新的功能，而這些仍有待闡明。因此就需要可抑制細胞促炎反應的其它藥劑、以及研究細胞促炎反應的方法。
發明概述目前已發現，在促炎劑刺激人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞后，用G蛋白激酶信號途徑修飾劑處理這些細胞可以抑制常規促炎反應，尤其是促炎劑(如C5a、FMLP、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和TNFα)或FCε受體誘導的下游促炎反應。改變G蛋白的細胞產生可以抑制G蛋白介導的炎癥反應信號轉導途徑。尤其有用的G蛋白激酶信號途徑修飾劑是具有式f-Met-Leu X的N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰(“f-Met-Leu”)肽，其中X選自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr，最優選f-Met-Leu-Phe-Phe。
人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞可以是淋巴細胞和粒細胞，優選嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和激活的T細胞，以及肥大細胞。
在本發明優選實施方案中，G蛋白激酶信號途徑修飾劑與這些細胞上存在的細胞表面受體，優選甲酰基肽受體(“FPR”)，形成復合物，其在促炎劑存在時抑制G蛋白γ亞基的磷酸化。進而，通過抑制或阻斷G蛋白的下游磷酸化作用，依賴于三聚體G蛋白成分的各種途徑將阻斷或下調細胞對促炎劑的反應。
在本發明一個優選實施方案中，IgE存在時，此G蛋白激酶信號途徑修飾劑在FCε受體(FCεR)水平上抑制IgE對FCεR的激活。
根據本發明，用于刺激人外周血單個核細胞和多形核細胞、或固定的組織細胞的促炎劑優選是細胞因子、趨化物(chemotaxins)、或促分裂原。尤其優選的促炎劑是N-甲酰基肽如FMLP、激活的補體片段(C5a)、白細胞三烯B4(LTB4)、血小板活化因子(PAF)、和細胞因子如TNFα、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-13、以及與抗原交聯的IgE、IgG或IgA。
在本發明另一實施方案中，提供抑制人外周血單個核細胞或多形核細胞的促炎反應的方法，該方法包括將細胞和G蛋白激酶信號途徑修飾劑接觸，并使該藥劑與細胞上的受體結合。促炎介導細胞(pro-inflammatory mediating cell)可以是淋巴細胞或粒細胞。優選地，該細胞首先接受促炎劑如上述促炎劑的刺激。
在本發明一個優選實施方案中，與配體結合的受體是甲酰基肽受體。下游阻斷FCεR受體的G蛋白激活可以提供類似的治療益處。
本發明還提供鑒定G蛋白激酶信號途徑修飾劑的方法，該方法包括步驟a)將選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的促炎介導細胞與選自細胞因子、趨化物和促分裂原的已知促炎介質(pro-inflammatory mediator)接觸，并引起促炎反應；b)向步驟a)加入候選的G蛋白信號途徑修飾劑；和c)檢測(i)同時與所述候選藥劑和所述促炎介質接觸的促炎細胞，與(ii)僅接觸所述促炎介質的促炎細胞相比，細胞中G蛋白激酶量的減少、或G蛋白激酶的解離失敗。
優選的G蛋白激酶是G蛋白γ激酶。
在本發明另一實施方案中，通過促炎介導細胞與G蛋白激酶信號途徑修飾劑的接觸，在促炎介導細胞表面提供與G蛋白激酶信號途徑修飾劑形成復合物的受體，籍此抑制促炎反應，其中所述促炎介導細胞選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。
在本發明再一實施方案中，鑒定G蛋白激酶信號途徑修飾劑的方法包括步驟使選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的促炎介導細胞與候選G蛋白信號途徑修飾劑接觸；和測定所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與未接觸候選G蛋白信號途徑修飾劑的細胞相比，PLCγ、Pp60Src和ERK-1的量不變，PI3(102Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Raf、Ras、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。
因此，本發明還提供包含細胞表面受體和G蛋白信號途徑修飾劑的人外周血單個核細胞或多形核細胞的新受體復合物，其中與沒有所述受體復合物的細胞相比，這些細胞中的蛋白激酶分布如下PLCγ、Pp60 Src和ERK-1的量不變，PI3(102Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Raf、Ras、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。優選地，細胞表面受體是FPR受體。也優選繼發阻斷FCER受體的G蛋白激活。
IL-4刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的受激細胞相比，PLCγ、PI3(102Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Ras和G蛋白γ激酶的量減少。
IL-6刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的受激細胞相比，PLCγ、PI3(102Kd)、Raf、Pp60 Src、ERK-1和G蛋白α的量增加，PI3(83Kd)、G蛋白β和G蛋白γ激酶的量減少。
IL-10刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的受激細胞相比，PI3(102Kd)、ERK-1和G蛋白γ的量增加，PLCγ、PI3(83 Kd)、Ras、和激酶的量減少。
促炎劑IL-13刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的受激細胞相比，PLCγ、PI3(102Kd)、PI3(83Kd)、ERK-1和Raf的量增加，Ras、Pp60 Src、G蛋白α、G蛋白β和G蛋白γ激酶的量減少。
促炎劑C5a刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的受激細胞相比，Pp60 Src和Raf的量增加，PLCγ、PI3(102Kd)、G蛋白α、G蛋白β和G蛋白γ激酶的量減少。
促炎劑TNFα刺激具有與G蛋白信號途徑修飾劑形成復合物的細胞表面受體的人外周血單個核細胞或多形核細胞，提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與沒有所述受體復合物的接受刺激的細胞相比，Raf、Ras和Pp60 Src的量增加，PLCγ、PI3(83Kd)、G蛋白α、G蛋白β和G蛋白γ激酶的量減少。
附圖簡述

圖1顯示了FITC標記的HK-X(f-Met-Leu-Phe-Phe)與人外周血具核細胞的結合。
圖2A-圖2C是FITC標記的HK-X與激活的淋巴細胞結合的點圖。圖2A顯示了在與100nM FITC標記的HK-X一起培養24小時后，用6μg伴刀豆凝集素A(ConA)刺激的淋巴細胞。圖2B顯示了在沒有FITC標記的HK-X時培養120小時后，用6μg ConA刺激的淋巴細胞。圖2C顯示了與100nM FITC標記的HK-X一起培養120小時后用6μg ConA刺激的淋巴細胞。
圖3A-圖3B是圖2A-C的淋巴細胞的DNA含量直方圖。圖3A是圖2A細胞的直方圖，圖3B是圖2B和2C的細胞的直方圖。
圖4是從人嗜中性粒細胞總裂解物和各種樹脂回收的35S-甲硫氨酰標記蛋白的放射自顯影圖。
圖5A-圖5B顯示，通過針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體檢測到在載體(0.3％DMSO)處理的單個核細胞中存在磷酸化蛋白質。圖5A是正常細胞的SDS-PAGE的光密度測定，圖5B是僅用載體(DMSO)處理的正常細胞的SDS-PAGE凝膠照片。
圖6A-圖6B顯示通過針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體檢測，在HK-X處理的單個核細胞中存在磷酸化蛋白質。圖6A是HK-X處理的細胞的SDS-PAGE的光密度測定，圖6B是僅用HK-X處理的正常細胞的SDS-PAGE照片。
圖7A-圖7B顯示了通過針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體檢測，在IL-8處理的單個核細胞中存在磷酸化蛋白質。圖7A是IL-8處理的細胞的SDS-PAGE的光密度測定，圖7B是僅用IL-8處理的正常細胞的SDS-PAGE照片。
圖8A-圖8B顯示了通過針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體檢測，在HK-X和IL-8處理的單個核細胞中存在磷酸化蛋白質。圖8A是HK-X和IL-8處理的細胞的SDS-PAGE的光密度測定，圖8B是用HK-X和IL-8處理的正常細胞的SDS-PAGE照片。
圖9A-圖9B顯示通過針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體檢測，在新鮮收集自外周血的單個核細胞中存在磷酸化蛋白質。圖9A是新鮮收集的細胞的SDS-PAGE的光密度測定，圖9B是新鮮收集的細胞的SDS-PAGE凝膠照片。
發明詳述根據本發明，發現G蛋白激酶信號途徑修飾劑可以使經促炎劑或分子刺激的人外周血細胞的某些促炎反應失活。
根據本發明，優選的G蛋白激酶信號途徑修飾劑可以與促炎介導細胞如淋巴細胞(尤其是激活的T細胞)、粒細胞(如嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞)、及固定的組織細胞(如肥大細胞)上的受體結合。
當G蛋白激酶信號途徑修飾劑與其受體結合后，促炎反應被抑制。根據本發明的優選實施方案，G蛋白亞基α、β和γ被修飾，而且這些亞基的磷酸化也受到抑制。能夠被該修飾劑-受體復合物抑制的促炎反應有受體攜帶細胞的分泌、脫粒和遷移，以及其它促炎分子的合成和分泌。
優選地，本發明G蛋白激酶信號途徑修飾劑能夠使先前被促炎分子刺激的受體失活，但對未接受刺激的細胞沒有作用。對刺激細胞有用的促炎劑的例子是IL-8、N-甲酰基肽、激活的補體片段(C5a)、白細胞三烯B4(LTB4)和血小板活化因子(PAF)。優選地，本發明修飾劑-受體復合物還可以使受體脫敏，不再應答相同促炎劑或不同促炎劑的刺激。
可以將所觀察到的G蛋白激酶信號途徑修飾劑-受體復合物對受體攜帶細胞的作用應用于鑒定G蛋白激酶信號途徑修飾劑。可以通過以下方式篩選這些藥劑使促炎介導細胞和已知促炎介質接觸以引發促炎反應，然后加入候選藥劑，并檢測和僅接觸促炎分子的促炎介導細胞相比，同時與候選藥劑和促炎分子接觸的促炎細胞中G蛋白激酶量的減少。
尤其有用的G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu-Phe-Phe。使用上述程序之一通過常規測試可以鑒定出其它有用的藥劑。
本文所用促炎反應包括促炎介導細胞的分泌或脫粒以及白細胞三烯、組胺和其它細胞因子的釋放。該反應還包括由于淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和嗜中性粒細胞的趨化粘附、遷移和聚集，嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞在炎癥組織中的浸潤。炎癥部位血管的通透性、和IgE、IgG和IgA及它們各自的FC受體產生的增加，也可能與促炎反應有關。
因此，抑制促炎反應可以包括在根據本發明的肽-受體結合后，減少，或在優選實施方案中完全終止，促炎介導細胞的脫粒和白細胞三烯、組胺和其它細胞因子的釋放。還可以極大地降低，或完全抑制，促炎介導細胞的浸潤和遷移。還可以降低炎癥部位的血管通透性、和IgE的水平。
為了可以更全面地理解本文所描述的本發明，我們給出以下實施例。應當理解，這些實施例僅用于舉例說明，而不應理解為以任何方式限制本發明。
實施例1標記的HK-X與外周血具核細胞的結合測定外周血具核細胞上HK-X(“f-Met-Leu-Phe-Phe”)的Kd和Bmax(飽和結合)。在含有0.1％疊氮化鈉的1％BSA-PBS溶液中預先洗滌100μl溶液中來自密度離心制備的各種組分(單核細胞、淋巴細胞、粒細胞)的2×105個細胞。根據表1，向各組試管中加入100μl以下摩爾濃度的FITC標記HK-X(溶于1％BSA-PBS溶液中)表1
混合這些試管并渦旋30秒。然后將試管置于4-8℃30分鐘。然后加入100μl Cal-Lyse，孵育5分鐘，或加入500μl 1％甲醛。如果加入Cal-Lyse，則加入1ml水并再孵育5分鐘。然后在流式細胞儀(Coulter Epics Elite)上分析細胞。圖1顯示了結合結果。測定的Bmax為47.66，Kd＝1.674×10-10M。因此，這些結果顯示HK-X可以和外周血具核細胞如單核細胞、淋巴細胞及粒細胞結合。
通過相似的方法學，還確定了HK-X可以和激活的T細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、及嗜堿性粒細胞結合、以及HK-X和嗜中性粒細胞的已知結合。
實施例2HK-X與激活的受體結合在培養的第24或120小時，用促分裂原伴刀豆凝集素A(ConA)刺激外周血淋巴細胞。然后將這些細胞或者暴露或者不暴露于100nM FITC標記的HK-X。并用DAPI染色細胞以確定細胞周期。然后通過流式細胞儀分析細胞。
圖2A-2C顯示了ConA激活的淋巴細胞和FITC標記的HK-X的結合位點出現之間的關系。這四個象限顯示了以下特征左上象限代表DNA含量超過1n，且具有背景水平(使用圖1的分布曲線確定的)以上的增加的FITC HK-X結合水平的細胞；右上象限代表DNA含量超過1n，且FITC-配體的結合高于背景的細胞；右下象限包含具有1n DNA含量、但結合的FITC-配體高于背景水平的細胞；和左下象限包含具有1n DNA含量和背景水平的FITC-配體的細胞。
正如圖2B和2C的檢測結果所顯示的，暴露于該植物凝集素或促分裂原可以刺激細胞進入細胞周期并表達FITC標記的HK-X的結合位點。120小時的更長培養期允許更大部分的細胞進入細胞周期(與圖2A相比)。通過使用與ConA一起培養但未用FITC標記的HK-X染色的細胞設定閾值(象限)，極為準確測定了內源性熒光的背景水平(見圖2B)。
統計學分析證實了通過這些點圖測量提供的定性觀察結果。圖2C中大約25％的細胞含有超過1n的DNA含量并具有高于背景水平的FITC-配體結合。這分別與圖2A和2B右上象限中的細胞數量形成鮮明對比。
我們使用Phoenix Software(Phoenix，AZ)的軟件包“MultiCycle”，更正規地檢測了細胞周期各相中細胞的分布。該軟件將該DNA直方圖去卷積(deconvolute)，并統計分析這些成分以確定適合度和顯著性程度。
圖3A顯示圖2A所包含的相同樣品，圖3B顯示圖2B和2C中所包含的樣品。正如二倍體(＞1n DNA含量)細胞百分數的檢測結果顯示的，該分數從圖2A的2.2％增加至圖2B和2C的29％。
因此，明顯地，促分裂原刺激人外周血淋巴細胞可以起始它們的DNA復制，而且在此過程的同時還引起FITC標記的HK-X的結合位點表達。DNA含量為1n、或處于細胞周期G0/G1相的細胞僅小部分表現出該配體結合位點的表達增加。相反，具有二倍體DNA含量(＞1n)的所有細胞都含有該配體的結合位點。
實施例3HK-X受體的鑒定和表征從鼠腹膜肥大細胞、人多形核細胞和單個核細胞群分離和表征結合HK-X和其它N-甲酰基肽的受體。而且，FCεR受體的G蛋白激活作為PKC、PI3增加和Ca2+動員的下游結果，使得FCε受體成為干擾G蛋白的下游效應受體。
正如由暴露于HK-X后生物反應性的改變、和與熒光或放射活性標記的HK-X的結合所證實的，結合HK-X的細胞包括肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞。尚未鑒定到HK-X的受體。相反，嗜中性粒細胞在其表面表達甲酰基肽受體。然而，血液淋巴細胞和單核細胞似乎比嗜中性粒細胞與HK-X結合較少。
詳細材料和方法1.分離細胞--通過將35ml Tyrode氏溶液注入麻醉大鼠的腹腔中，分離大鼠腹膜肥大細胞。然后注射過量麻醉劑以處死大鼠。收獲腹膜細胞，將之放入15ml離心管中。通過室溫250-×g離心10分鐘沉淀細胞。
從由正常供體獲得的外周血中分離人外周血單個核細胞和多形核細胞。在肝素中收集血液。通過在Ficoll-Hypaque上室溫500-×g離心60分鐘，分離各種細胞類型。分別收獲并匯集各個組分，在含有抗生素的RPMI 1640中洗滌1次。
2.用35S-甲硫氨酸代謝標記細胞--將細胞調節至每ml含有10μCi35S-甲硫氨酸的無甲硫氨酸RPMI 1640培養基中有1×107個細胞，然后37℃在5％CO2中放置過夜。
3.收獲細胞并制備粗細胞膜--在PBS中洗滌細胞3次，之后在含有0.3％NP40和蛋白酶抑制劑雞尾酒的Hepes緩沖液(pH7.2)中作超聲破碎。所獲細胞制品在600-×g下離心10分鐘，收集上清液用于進一步分析。
4.Sepharose和Sepharose HK-X層析分離各種細胞蛋白質--使細胞制品通過未經取代的Sepharose樹脂柱、或通過Sepharose HK-X樹脂并分為兩個部分A和B。
部分A通過HK-X取代的Sepharose柱。洗滌柱子，并用含有HK-X(5mg/ml)的緩沖液，之后用0.1M甘氨酸(pH2.5)，進行洗脫。
部分B在存在可溶性HK-X時與HK-X取代的柱結合，然后洗脫蛋白質。濃縮并凍干各個組分。
此步驟中采取的方法涉及HK-X與Sepharose樹脂結合以制備HK-X取代的樹脂。在暴露于HK-X取代的樹脂之前，使標記的細胞蛋白質混合物通過未經HK-X取代的樹脂以除去與天然樹脂反應的任何蛋白種類。由此，當包含受體蛋白的細胞蛋白在適當的離子環境下通過HK-X取代的樹脂時，存在于其它蛋白質中的受體蛋白質(HK-X的受體)與HK-X緊密結合。用溫和的試劑如中性pH的磷酸緩沖液洗滌樹脂，以除去所有的低親和結合蛋白。隨后，將該樹脂暴露于過量的游離HK-X，以競爭性地洗脫與樹脂結合的受體蛋白。對所有這些步驟中釋放的放射活性蛋白進行濃縮并在12％SDS-PAGE系統上分析，詳見以下步驟。
5.12％SDS-PAGE--將含有250cpm至2000cpm放射活性的25μl放射活性細胞制品加在凝膠的各泳道上。90V、30mA電泳凝膠，直到可以良好分辨帶色的標準物為止。該標準物是磷酸酶b(MW＝94,000)；牛血清白蛋白(MW＝68,000)；卵白蛋白(MW＝43,000)；碳酸酐酶(MW＝30,000)；和大豆胰蛋白酶抑制劑(MW＝21,000)。
6.估計分離出的放射活性蛋白質的分子量--計算標準物和凝膠上觀察到的所有不同分子量蛋白種類的相對遷移率。就標準物的log分子量對各標準物的相對遷移率作圖。在PRISM軟件中鍵入數據，從標準曲線程序預測未知蛋白質的分子量。結果與文獻(Goetz等，Biochemistry 205717-5722，1981)公開的FPR受體蛋白質作比較。
圖4顯示了代表性實驗的結果。泳道A顯示了細胞裂解物中存在的所有蛋白質。泳道B中，來自無HK-X取代的Sepharose柱的未結合物質顯示出類似于整個細胞裂解物的蛋白條帶分布情況。泳道C含有洗脫前物質。泳道D是空白泳道。泳道E中，當在1mg HK-X(競爭物)存在下洗脫柱子時，可見到三條蛋白帶。估計分子量分別是～94,000、～68,000和～40,000道爾頓。該實驗的條件確立了該結合的特異性。
將本實驗中所洗脫的條帶的相對豐度與Goetzl等報道的作比較，揭示出令人感興趣的差異(見表2)。對受體標化比例的檢測結果顯示，從FMLP柱(Goetzl)回收的三種蛋白和從HK-X柱(本實驗)回收的三種蛋白在分布上有實質性的不同。68Kd蛋白種類是Goetzl等從FMLP親和柱回收到的優勢種類，而40Kd蛋白種類是從HK-X親和柱回收到的主要種類。
表2報道的從FMLP-Sepharose回收的甲酰基受體與從HK-X-Sepharose回收的甲酰基受體的差異
圖4的放射自顯影圖清楚地顯示，通過加入1mg HK-X從大鼠腹膜肥大細胞中洗脫了3種分子。這些蛋白質的計算分子量與Goetzl等報道的分子大小一致。用HK-X或酸競爭后從大鼠腹膜肥大細胞和嗜中性粒細胞回收到的蛋白質的分子量與Goetzl報道的從人嗜中性粒細胞得到的相同。
盡管40Kd分子中甲硫氨酸殘基總平均數是5.1，但它比每分子分別含有11和14個殘基的68,000和94,000分子種類具有更強的放射顯影圖像。在本實施例中，用35S-甲硫氨酸通過生物合成放射標記確定了所回收的各蛋白質的相對豐度。通過對來自放射自顯影圖的曲線下面積進行積分，確定從親和層析回收到的相對比例。Goetzl通過使用化學方法測定蛋白質來測量各種蛋白的相對豐度。因此，為了更準確地比較兩個研究中回收的蛋白質的分布，用各種類的相對豐度除以甲硫氨酸殘基的數目，標化分布值。該比值校正了由于方法學不同造成的潛在數值差異。校正后的比值揭示出，Goetzl報道的數值與本實施例獲得的數值之間有極為不同的結合和/或回收分布情況。一種可能是去污劑解離的受體復合物選擇性結合FMLP取代的Sepharose的方式與選擇性結合HK-X取代的Sepharose的方式不同。
總之，在本實施例中，在用35S-甲硫氨酸體外標記蛋白質后，使用HK-X可以選擇性地從得到的細胞裂解物中回收結合蛋白。分離到分子量不同的3種分子，它們與以前報道的FMLP受體復合物相關肽的大小是一致的。
通過本實施例所用技術，我們還闡明，HK-X可以與人多形核細胞和單個核細胞，尤其是激活的T細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，結合。
實施例4信號轉導和作用機制白細胞可以對大量化學引誘物和其它促炎介質產生應答。一些介質引起趨化性、酶系統的激活和病理方面重要的介質的釋放。典型的N-甲酰基肽(原型-FMLP)、激活的補體片段(C5a)、白細胞三烯B4(LTB4)、血小板活化因子(PAF)、和一些趨化細胞因子(如IL-8)是熟知的趨化和促炎劑。這些藥劑與G蛋白偶聯受體(GPCR)結合，隨后通過蛋白激酶系統介導多種信號轉導產生。這些初始事件導致的級聯事件是復雜的并相互關聯，還負責所有具核細胞的整個行為。程序化細胞死亡(細胞凋亡)、免疫應答的產生、自身識別T細胞的去除、和對細胞外基質合成的控制僅是信號轉導途徑作用的幾個例子。
根據其將磷酸基團從磷酸供體轉移至位于蛋白質內的受體氨基酸上的能力，鑒定蛋白激酶。通常，供體是ATP的γ磷酸。蛋白質內的三種主要受體氨基酸殘基是酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。到1999年，已在文獻中鑒定和描述了超過115種蛋白激酶。
文獻(Prosnitz等，Pharmacol.Ther.7473-102，1997)極好地描述了細胞應答FMLP刺激的行為。FMLP與吞噬細胞結合刺激與細胞功能有關的磷酸化發生。FMLP和其它化學引誘物刺激磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，而這又激活蛋白激酶(PKC)。在嗜中性粒細胞中，FMLP的結合引起胞外調節激酶(ERK-1)的磷酸化，該激酶屬于稱作促分裂原活化蛋白激酶(MAP激酶)的一個總激酶家族。MAP激酶家族的一些成員是Raf-1和Ras。
這些蛋白激酶家族的成員一般在分子量上有一定程度的差異，以致通過SDS-PAGE它們可以彼此分開。而且，可以通過僅識別磷酸酪氨酸表位的單克隆抗體從全部細胞內蛋白質集合中鑒定出磷酸酪氨酸蛋白質(Ross等，Nature(London)294654，1981；Frackleton等，Mol.Cell Biol.31343，1983)。
為了闡明HK-X的作用機制，我們分析了加入HK-X所介導的人外周血單核和多形核細胞中蛋白激酶的改變。單獨加入HK-X，以及此外還加入已知的趨化和促炎劑FMLP或IL-8。
詳細的材料和方法1.分離細胞-從獲自正常供體的外周血中分離人外周血單核和多形核細胞。在肝素中收集血液。通過在Ficoll-Hypaque上500-×g室溫離心60分鐘，分離各種細胞類型。分別收集并匯集各個組分，然后在含有抗生素的RPMI 1640中洗滌1次。
2.培養和處理細胞-為了使細胞可以在磷酸化的蛋白質庫中達到穩態，在加入刺激劑前將每ml培養基107個細胞置于37℃30分鐘。然后向每ml細胞中加入以下刺激劑A.100μl載體(培養基中的0.3％DMS0溶液)，B.100μl含有20μg HK-X的HK-X，C.100μl含有0.1μg FMLP的FMLP，D.100μl含有0.1μg IL-8(重組人IL-8)的IL-8，E.100μl含有20μg HK-X的HK-X加上100μl含有0.1μg FMLP的FMLP，F.100μl含有20μg HK-X的HK-X加上100μl含有0.1μg IL-8的IL-8，
G.無任何刺激劑的細胞培養基。
細胞在37℃、5％CO2中再孵育30分鐘。
3.收獲細胞和SDS-PAGE分析-室溫250×g、5分鐘沉淀細胞。去除上清液并加入25μl 2×SDS-PAGE起始緩沖液。煮沸沉淀15分鐘并10,000×g離心5分鐘。取出少量樣品在12％丙烯酰胺凝膠上作凝膠電泳。
4.免疫印跡檢測磷酸蛋白-13V、30分鐘將蛋白質轉移至尼龍膜上，之后用1％BSA封閉12小時。加入溶于0.3％BSA的與HRP偶聯的抗體，60分鐘。對膜進行洗滌、固定和拍攝。
5.數據分析-將照片帶到專業實驗室，使用極高反差和低顆粒膠片制備每塊凝膠的負片。隨后以600dpi掃描照片，并使用Image ProPlus軟件，SPSS進行光密度分析。計算每一條帶的分子量。
為了標化SDS-PAGE每個泳道上加入的細胞蛋白質量，每次處理均使用相同數量的細胞，每一泳道均加上幾乎相同體積的樣品。在圖5至圖9中，顯示了抗磷酸酪氨酸的單克隆抗體所檢測到的磷酸蛋白的化學發光圖像。為了獲得最大程度的條帶分辨率以及它們相應的化學發光強度，由專業攝像師制作這些化學發光像的負片。例如，在圖5A中，暴露于載體30分鐘的細胞中存在的蛋白激酶顯示出9種不同的蛋白質，如凝膠的光密度測量分析中的峰所示。為了清楚起見，用箭頭標出了光密度測量分析中的峰，并用同樣的箭頭標出了凝膠上相應的分子種類。(凝膠的起始端在凝膠的右邊，此處定位的是具有較大分子量的種類)。
圖6中描述了細胞對HK-X的蛋白激酶應答。檢測到約83Kd分子量的種類明顯增加，而這在其它處理中沒有被觀察到。用20μg HK-X和0.1μg IL-8、以及20μg HK-X和0.1μg FMLP同時處理細胞后，觀察到顯著差異(數據未顯示)。較小分子量的種類極大地減少(凝膠的左邊大部分)。峰的面積定量地反映了此減少。光密度測量圖中的此面積用水平雙頭箭頭作了顯示。圖9中顯示了新鮮單個核細胞的蛋白激酶含量和分布。這些細胞與載體處理的細胞(圖5)和HK-X處理的細胞(圖6)在激酶分布上極為相似。沒有顯示對單獨的FMLP刺激和對HK-X加上FMLP的刺激出現的激酶應答情況。然而，所有這些情況均分別與單使用IL-8和使用HK-X加上IL-8時所觀察到的情況基本上一致。
外周血多形核細胞的蛋白激酶情況和分布與單個核細胞的基本相同。兩種細胞類型間的主要差異是單個核細胞比多形核細胞代謝更為活躍。
使用光密度測量分析方法，計算每種分子量分子的峰下面積。由此，定量評價總激酶含量中各激酶的百分數。此外，還將已知激酶的分子量和本實驗中從相對遷移率(Rf)計算得出的分子量作了比較。
表3顯示了人外周血細胞在暴露于HK-X后蛋白激酶分布的定量改變。
表3蛋白激酶 分子量 使用HK-X后改變的％PLCγ150Kd NCPI3102Kd +57PI383Kd +55Raf65-68Kd-42Pp60 Src 62Kd NCG-蛋白α56Kd -49ERK-1 44-49KdNCG-蛋白β33-35Kd-25Ras21Kd -32G-蛋白γ 9KdNC表4顯示了各種實驗的G蛋白γ激酶的數量，這驗證并擴展了前面的定性數據。盡管我們嘗試每次處理使用相同數量的細胞而且每個泳道加上幾乎等量的回收的細胞內蛋白質，但正如通過這些面積所觀察到的，激酶的總量是不同的。
表4從暴露于HK-X和IL-8及FMLP后的外周血細胞得到的蛋白激酶總結
表5描述了另一實驗的結果，該實驗顯示了與共刺激暴露于(1)HK-X及(2)fMLP或IL-8比較，暴露于HK-X后人外周血細胞中蛋白激酶的分布改變。
表6和7描述了再一實驗的結果，該實驗顯示了與共刺激暴露于(1)HK-X及(2)Ca5、TNFα、IL-4、IL-6、IL-10或IL-13相比，暴露于HK-X后人外周血細胞的蛋白激酶分布改變。
表5 外周血細胞中酪氨酸蛋白激酶的鑒定和分布總結------------百分數分布---------
表6 外周血細胞中酪氨酸蛋白激酶的鑒定和分布總結----------百分數分布---------
表7 外周血細胞中酪氨酸蛋白激酶的鑒定和分布總結----------百分數分布---------
帶有甲酰基肽受體的細胞在接受刺激的過程中，發生了許多重要事件。這些事件包括A.當與FMLP或其它類似物結合后，FPR與G蛋白庫相互作用，該蛋白庫是其它化學引誘物的受體如LTB4和C5a受體所共同的(Jacobs等，J.Leukoc.Biol.57679-686，1995；Mcleish等，Mol.Pham.36384-390)。
B.在用FMLP或其它化學引誘物刺激后，細胞對再次或隨后的相同或其它化學引誘物產生不應。當一種刺激劑誘導的不應狀態或受體失活影響到多種未結合配體的受體時，該情況是異源性脫敏。據推測，此種形式的脫敏可能是由于下游激活的激酶磷酸化這些未結合配體的受體所致的，如FCεR受體的情形。
C.IL-8、C5a和FMLP使彼此的受體脫敏。這些研究被擴展到包括PAF和LTB4受體。起始該過程的機制可能涉及PKC對受體的磷酸化。然而，FPR不含有能夠被PKC磷酸化的細胞內域，而似乎由另一激酶負責。
D.缺少FPR磷酸化時出現下游FPR應答的脫敏。
單獨HK-X處理不會特異地下調激酶。HK-X和IL-8或HK-X和FMLP同時刺激單個核細胞后，造成G蛋白γ激酶選擇性地顯著降低。這些觀察結果提示了以下HK-X的作用機制，見下述。
HK-X和潛在的促炎分子如IL-8和FMLP能夠一起存在。下調G蛋白三聚體復合物中的一個。具體地，在穩態條件下，G蛋白γ磷酸化被減少。因此，當IL-8或FMLP存在時HK-X似乎可以起始直接或間接地抑制G蛋白γ亞基磷酸化的受體脫敏。
從此處給出的數據和以前的報道可以推出許多推論。它們是1.HK-X表現出對能夠應答特異促炎受體介導的促炎刺激的細胞具有特異性。
2.如果炎癥事件過程中在系統中保持HK-X，則HK-X將維持潛在應答細胞的脫敏。
3.使用本報道描述的體外培養系統，可以根據對HK-X作用的靈敏性，篩選其它細胞靶標和其它促炎介質。因此，可以使用一個簡單的測定快速地甄別潛在的治療效力并建立治療的可預測性。
部分地，HK-X似乎通過使促炎介質受體的脫敏來介導其治療效力。通過直接或間接地抑制G蛋白γ亞基磷酸化，可以從該事件的下游介導和維持促炎細胞的失活。
我們已對本發明作了詳細描述，包括其優選實施方案。然而，應當理解，本領域技術人員可以在權利要求書所述的本發明精神和范圍內進行改動和改進。
權利要求
1.抑制人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞在接觸促炎劑后的促炎反應的方法，所述方法包括使所述細胞和G蛋白激酶信號途徑修飾劑接觸，籍此抑制G蛋白介導的促炎反應信號轉導途徑。
2.權利要求1的方法，其中人外周血單個核細胞選自淋巴細胞和單核細胞，或者多形核細胞選自粒細胞。
3.權利要求1的方法，其中人外周血單個核細胞或多形核細胞選自嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和激活的T細胞。
4.權利要求1的方法，其中固定的組織細胞選自肥大細胞、樹突細胞、星形膠質細胞或巨噬細胞。
5.權利要求1的方法，其中促炎劑選自細胞因子、趨化物、和促分裂原。
6.權利要求1的方法，其中促炎劑選自fMLP、激活的補體片段、白細胞三烯B4、血小板活化因子、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和TNFα。
7.權利要求1的方法，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu肽。
8.權利要求1的方法，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu-Phe-Phe。
9.抑制人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞在接觸促炎劑后的促炎反應的方法，所述方法包括使細胞表面受體和G蛋白激酶信號途徑修飾劑形成復合物，籍此抑制促炎反應。
10.權利要求9的方法，其中細胞表面受體是甲酰基肽受體。
11.權利要求9的方法，其中促炎反應包括抑制下游受體，其中下游受體是FC受體，該FC受體是選自免疫球蛋白的藥劑、選自IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和TNFα的細胞因子、或選自C5a、FMLP、PAF、LTB4的趨化因子的受體。
12.權利要求9的方法，其中人外周血單個核細胞選自淋巴細胞和單核細胞，或者多形核細胞選自嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。
13.權利要求9的方法，其中人外周血單個核細胞或多形核細胞選自嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和激活的T細胞。
14.權利要求9的方法，其中固定的組織細胞選自肥大細胞、樹突細胞、星形膠質細胞和巨噬細胞。
15.權利要求9的方法，其中促炎劑選自細胞因子、趨化因子、趨化物和促分裂原。
16.權利要求9的方法，其中促炎劑選自fMLP、激活的補體片段、白細胞三烯B4、血小板活化因子、或IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和TNFα。
17.權利要求9的方法，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu肽。
18.權利要求9的方法，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu-Phe-Phe。
19.受體復合物，其包含G蛋白激酶信號途徑修飾劑和經促炎劑刺激的人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞的細胞表面受體。
20.權利要求19的受體復合物，其中人外周血細胞是選自淋巴細胞和單核細胞的單個核細胞，或是選自嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的多形核細胞。
21.權利要求19的受體復合物，其中固定的組織細胞選自肥大細胞、樹突細胞、星形膠質細胞和巨噬細胞。
22.權利要求19的受體復合物，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu肽。
23.權利要求19的受體復合物，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑是f-Met-Leu-Phe-Phe。
24.權利要求19的受體復合物，其中促炎劑選自細胞因子、趨化因子、趨化物和促分裂原。
25.權利要求19的受體復合物，其中促炎劑選自fMLP、激活的補體片段、白細胞三烯B4和血小板活化因子、或IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13和TNFα。
26.鑒定G蛋白激酶信號途徑修飾劑的方法，該方法包括步驟a)使選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、和嗜堿性粒細胞的促炎介導細胞和選自細胞因子、趨化因子、趨化物和促分裂原的已知促炎介質接觸，并引起促炎反應；b)在步驟a)中加入候選的G蛋白激酶信號途徑修飾劑；和c)檢測(i)同時接觸所述候選拮抗劑和所述促炎介質的促炎介導細胞，和(ii)僅接觸所述促炎介質的促炎介導細胞相比，細胞中調節性G蛋白激酶的量的減少或增加。
27.權利要求26的方法，其中促炎介質選自fMLP、激活的補體片段、白細胞三烯B4、和血小板活化因子、或IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、和TNFα。
28.包含G蛋白激酶信號途徑修飾劑的細胞表面受體復合物，其中該修飾劑與選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的促炎介導細胞的表面受體結合，籍此抑制對促炎劑的促炎細胞反應。
29.鑒定G蛋白激酶信號途徑修飾劑的方法，所述方法包括步驟使選自激活的T淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的促炎介導細胞與候選的三聚體G蛋白信號途徑修飾劑接觸；和確定所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中與未和候選三聚體G蛋白信號途徑修飾劑接觸的細胞相比，PLCγ、Pp60 Src和ERK-1的量不變，PI3(102Kd)和PI3(83Kd)的量增加，且Raf、Ras、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。
30.細胞表面受體復合物，其包含人外周血單個核細胞或多形核細胞的細胞表面受體，和G蛋白信號途徑修飾劑，其中，與沒有展示所述細胞表面受體復合物的細胞相比，該細胞中蛋白激酶分布的結果是PLCγ、Pp60 Src和ERK-1的量不變，PI3(113Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Raf、Ras、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。
31.權利要求30的細胞表面受體復合物，其中該細胞表面受體是FPR受體。
32.權利要求30的細胞表面受體復合物，其中IL-4刺激人外周血單個核細胞或多形核細胞提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中，與未展示所述受體復合物的受刺激細胞相比，PLCγ、PI3(102Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Ras和G蛋白γ激酶的量減少。
33.權利要求30的細胞表面受體復合物，其中促炎劑IL-13刺激人外周血單個核細胞或多形核細胞提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中，與未展示所述受體復合物的受刺激細胞相比，PLCγ、PI3(113Kd)和PI3(83Kd)的量增加，Raf、Ras、Pp60 Src、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。
34.權利要求30的細胞表面受體復合物，其中促炎劑C5a刺激人外周血單個核細胞或多形核細胞提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中，與未展示所述受體復合物的受刺激細胞相比，PI3(83Kd)和Raf的量增加，PLCγ、PI3(113Kd)、G蛋白α和G蛋白β激酶的量減少。
35.權利要求30的細胞表面受體復合物，其中促炎劑TNFα刺激人外周血單個核細胞或多形核細胞提供了所述細胞產生的蛋白激酶的分布，其中，與未展示所述受體復合物的受刺激細胞相比，Raf、ERK-1、Ras、G蛋白α、G蛋白β和G蛋白γ的量增加，PLCγ、PI3(113Kd)和Pp60 Src激酶的量減少。
全文摘要
本發明描述了抑制人外周血單個核細胞或多形核細胞、或固定的組織細胞的促炎反應的方法。使細胞和促炎劑接觸，以刺激促炎反應。然后，使細胞與G蛋白激酶信號途徑修飾劑接觸，藉此抑制G蛋白介導的炎癥反應信號轉導途徑。本發明描述了受體復合物，其中G蛋白激酶信號途徑修飾劑與經促炎劑刺激的人外周血單個核細胞或多形核細胞的細胞表面受體結合。
文檔編號C07K14/72GK1633447SQ00815686
公開日2005年6月29日 申請日期2000年10月12日 優先權日1999年10月15日
發明者J·A·克拉格特, C·帕爾默 申請人:海斯塔泰克有限責任公司