專利名稱：一種高密度固定生物功能分子的材料的制備方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測、組織工程以及高分子材料領域，特別是涉及一種能高密度 固定生物分子同時排斥非特異蛋白吸附的生物功能表面的制備方法。
背景技術：
利用生物學原理將蛋白質、細胞生長因子、酶、多肽等生物活性物質固定在材料表 面上，可以有效提高材料的多種生物學功能(如抗凝血性能、與抗體結合的活性以及對細 胞的黏附性等)，這在生物檢測、組織工程、蛋白質分離純化、人工植入材料等多種生物醫用 領域中有著重要的應用價值(Pascal J. et al. Angew. Chem. Int. Ed.，2008，47 :9618_9647 ； Chen H. et al. Prog. Polym. Sci.，2008，33 1059-1087)。例如固定肝素可賦予表面抗凝 血功能以提高其血液相容性；固定纖連蛋白、膠原蛋白等細胞外基質蛋白可以有效地促進 表面細胞的黏附和繁殖。但是，在使材料表面固定盡可能多生物活性分子的同時，表面還必 須具有排斥非特異性蛋白質的吸附的能力。這是因為在生物傳感器、生物芯片等生物檢測 領域，由非特異性蛋白質造成的背景噪音是阻礙檢測準確性的主要因素；而在人工植入材 料，組織工程支架等領域，也必須盡可能減少非特異性蛋白質吸附造成的諸如血栓形成、細 菌黏附、炎癥等不良反應。目前這類生物功能表面的制備策略一般是將生物惰性表面與生物活性分子固定 化相結合。如 Xu 等人(Xu et al. Biomacromolecules，2009，10 1665-1674)在表面接枝 了具有優異排斥非特異性蛋白質吸附功能的P0EGMA，并將其側鏈末端的羥基進行活化，進 而固定了免疫球蛋白(IgG)用于制備高信噪比的生物傳感器。Tugulu等人(Tugulu et al. Biomaterials, 2007, 28 :2536_2546)在表面接枝了 P0EGMA，經過羥基活化后固定了細 胞黏附多肽，有效地促進了細胞在表面的黏附鋪展。然而，這些制備方法都需要經歷對官能 團活化的過程，無法直接固定生物分子，反應過程比較復雜；活性基團的轉化效率不高，進 而導致固定生物分子的數量不是很多，不能最大程度實現其生物學功能。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對目前生物活性表面制備方法所存在的反應過 程復雜、固定生物分子密度不高的問題，提供一種操作簡單、可以高密度固定生物分子并同 時排斥非特異性蛋白吸附的表面改性方法。本發明解決其技術問題采用以下的技術方案本發明提供的高密度固定生物功能分子材料的制備方法，其包括以下步驟(1) POEGMA改性表面的制備將固定有引發劑的材料表面，在氮氣保護下置于含有催化劑/配體體系和OEGMA 單體的溶液中進行ATRP反應，反應溫度為0 45°C，反應時間為0. 5 6小時，得到POEGMA 改性表面；POEGMA為聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的英文縮寫，OEGMA為甲基丙烯酸寡聚乙 二醇酯的的英文縮寫，ATRP為原子轉移自由基聚合的英文縮寫。
所述固定有引發劑的材料可以采用單晶硅或玻璃；該引發劑為α-溴丁酰溴， α -溴代異丁酰溴，或α -溴代丙酰溴。所述的催化劑/配體體系可以采用溴化亞銅/五甲基二亞乙基三胺，或溴化銅/ 抗壞血酸。 所述的OEGMA單體溶液為水溶液，甲醇溶液，或水和甲醇的混合溶液。(2) NHSMA 的制備在反應裝置中，先按1 1 1. 2 1的摩爾比將甲基丙烯酰氯緩慢滴入到NHS的 溶液中，在三乙胺存在的條件下攪拌反應，反應溫度為0 35°C，反應時間為1 12小時， 得到NHSMA的單體溶液；再將該單體溶液經過重結晶得到白色晶體NHSMA ；所述NHSMA為甲 基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺的英文縮寫，所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺的英文縮寫。所述的NHS溶液為N-羥基琥珀酰亞胺的三氯甲烷溶液，按W/V計，三乙胺用量為 所述溶液的10 25%。(3) P0EGMA-PNHSMA 改性表面的制備將所得的POEGMA改性表面置于含有催化劑/配體體系和所得的NHSMA的單 體溶液中進行二次ATRP反應，反應溫度為70 100°C，反應時間為2 6小時，得到 P0EGMA-PNHSMA 改性表面。所述的催化劑/配體體系可以采用溴化銅/五甲基二亞乙基三胺，或溴化亞銅/
五甲基二亞乙基三胺。所述的NHSMA單體溶液為苯甲醚溶液或二甲基亞砜溶液。(4) P0EGMA-PNHSMA改性表面固定生物活性分子將所得的P0EGMA-PNHSMA改性表面置于含有生物活性分子的溶液中進行反應，溫 度控制在0 40°C，反應時間為2 24小時，反應結束后，將所述表面置于鈍化劑(EG)2NH2 的溶液中對未反應的NHS基團進行鈍化，鈍化溫度為室溫，反應時間為2 12小時。該步 驟完成后，將P0EGMA-PNHSMA改性表面從溶液中取出，分別用乙醇或水溶劑進行清洗，得到 固定有生物素、膠原蛋白和肝素生物活性分子的生物功能表面。所述的生物活性分子為生物素酰阱、纖連蛋白、膠原蛋白、肝素、賴氨酸或其他含 有氨基的生物分子。所述的生物活性分子的溶液為乙醇溶液、乙酸溶液、磷酸鹽緩沖溶液或 其他可以溶解相應生物活性分子的溶液。所述的(EG)2NH2的溶液為乙醇溶液。經過上述步驟，最終得到高密度固定生物功能分子材料，該材料表面具有不吸附 非特異蛋白的功能。本發明與現有技術相比具有以下主要的優點本發明提供的方法為直接表面引發聚合制備生物活性表面的方法，不需要中間的 基團活化過程。與現有技術相比，本發明具有以下突出特點1.利于保持固定生物分子的活性與傳統的活化官能團而后固定生物分子的方 法相比，本方法可以固定更高密度的生物活性分子，同時POEGMA作為間隔層的存在即可以 排斥非特異性蛋白吸附，又能提供一個親水環境，從而有利于保持固定生物分子的活性。2.操作簡單、易行可以通過改變二次ATRP的聚合條件，以方便地調控材料表面 的物理和化學特性。
3.適用性較廣可以用于固定任何含有氨基的生物活性分子并有效地實現其生 物功能，適用于如生物檢測、組織工程、蛋白質分離純化等許多生物醫用領域。例如，在利用 本方法得到的活性表面固定生物素后，可以選擇性結合親和素；在POEGMA改性表面細胞沒 有出現黏附現象(見圖1)，而在表面固定膠原蛋白后，可以有效促進細胞黏附鋪展(見圖 2)；在表面固定肝素后，可以特異性結合抗凝因子ATIII (見圖3)，得到具有抗凝血功能的 表面等。從圖3可以看出，POEGMA改性表面的ATIII吸附量為0. 0129ug/cm2，而固定肝素 后表面的ATIII吸附量為0. 0942ug/cm2，即固定后的表面ATIII吸附量增加了 10倍。


圖1為POEGMA改性表面細胞的黏附，生長情況。圖2為固定了膠原蛋白表面細胞的黏附，生長情況。圖3為POEGMA改性表面及固定了肝素后表面對抗凝因子ATIII的吸附情況
具體實施例方式本發明提供一種高密度固定生物功能分子同時排斥非特異性蛋白質吸附的生物 功能表面的制備方法。在材料表面固定引發劑后，在配體/催化劑和單體OEGMA的存在 下，通過ATRP技術在材料表面接枝P0EGMA，而后利用二次引發ATRP在POEGMA末端接枝 PNHSMA。利用PNHSMA所含有的大量NHS基團高密度地固定含有氨基的生物活性分子(如 蛋白質、多糖、酶等)，最終實現其生理功能。下面通過實施例，對本發明作進一步闡述，但并不限定本發明。實施例1將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3gNHS和3. 3mL三乙 胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水清 洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和6mL 正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。在氮氣氛圍下，將7. 93g 0EGMA,312mg的2，2_聯吡啶和143mg溴化亞銅溶解于 15mL甲醇和水(4 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定有α-溴 丁酰溴引發劑的硅片，室溫下反應2h后用溴化銅/聯吡啶停止反應，并用大量的水和乙醇 對表面進行清洗，后用氮氣吹干，處理后的表面固定了 P0EGMA。將上述表面置于含有14mg 溴化亞銅，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反應在90°C下進行2h.反應結束 后用大量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。將上述表面置于lmg/mL生物素酰胼的乙酸鈉溶液(pH 5. 5)當中，并在室溫下反 應過夜。反應結束后用乙酸鈉溶液、水、乙醇清洗表面，并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙 醇溶液中以將表面殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高密度固定生物素的生物活性表 面。實施例2將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水 清洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和6mL正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。 在氮氣氛圍下，將7. 93g (^6獻，31211^的2，2-聯吡啶和143mg溴化亞銅溶于15mL 甲醇和水(1 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定α-溴丁酰溴引 發劑的硅片，室溫下反應2h后并用大量的水和乙醇對表面進行清洗，后用氮氣吹干。將上 述表面置于含有14mg溴化亞銅，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反應在70°C 下進行3h.反應結束后用大量的DMF對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。
將4wt %膠原蛋白的乙酸溶液用2. OM氫氧化鈉溶液將pH調至8. 0得到膠原蛋白 溶液。將上述表面置于膠原蛋白溶液中于4°C反應過夜。反應結束后用水、乙醇清洗表面， 并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶液中以將殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高 密度固定膠原蛋白的生物活性表面。實施例3將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水 清洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和 6mL正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。在氮氣氛圍下，將7. 93g (^6獻，31211^的2，2-聯吡啶和143mg溴化亞銅溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定α-溴丁酰溴引 發劑的硅片，室溫下反應2h后用大量的水和乙醇對表面進行清洗，后用氮氣吹干。將上述 表面置于含有14mg溴化亞銅，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反應在100°C 下進行4h。反應結束后用大量的DMF對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。將膜片置于lOmg/mL的肝素的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 8. 0)中室溫反應24h。反應 結束后用磷酸鹽緩沖溶液、水、乙醇清洗表面，并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶液中 以將殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高密度固定肝素的生物活性表面。實施例4將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3gNHS和3.3mL三乙 胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水清 洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和6mL 正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。在氮氣氛圍下，將7. 93g (^6獻，31211^的2，2-聯吡啶和143mg溴化亞銅溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定α -溴丁酰溴 引發劑的硅片，室溫下反應4h后用大量的水和乙醇對表面進行清洗，后用氮氣吹干。將上 述表面置于含有14mg溴化亞銅，0. 92gNHSMA,42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反應在100°C 下進行6h。反應結束后用大量的DMF對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。將膜片置于0. lmg/mL的RGD多肽的檸檬酸鹽緩沖溶液(pH = 8. 0)中室溫反應 24h。反應結束后用檸檬酸鹽緩沖溶液、水、乙醇清洗表面，并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2W 乙醇溶液中以將殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高密度固定RGD的生物活性表面。實施例5將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水清洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和6mL正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。在氮氣氛圍下，將7. 93g (^6獻，31211^的2，2-聯吡啶和143mg溴化亞銅溶于15mL 甲醇和水(1 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定α -溴丁酰溴 引發劑的硅片，室溫下反應3h后用大量的水和乙醇對表面進行清洗，后用氮氣吹干。將上 述表面置于含有14mg溴化亞銅，0. 92g NHSMA, 42 μ L PMDETA的6mL苯甲醚中，反應在90°C 下進行4h。反應結束后用大量的DMF對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。將膜片置于0. lmg/mL的RGD多肽的檸檬酸鹽緩沖溶液(pH = 8. 0)中室溫反應 24h。反應結束后用檸檬酸鹽緩沖溶液、水、乙醇清洗表面，并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2W 乙醇溶液中以將殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高密度固定RGD的生物活性表面。實施例6將2. 2mL甲基丙烯酰氯的IOmL三氯甲烷滴加到0°C的含有2. 3g NHS和3. 3mL三 乙胺的20mL三氯甲烷溶液中。滴加完畢后，在室溫下反應4小時。反應液用飽和的冰鹽水 清洗，并用無水硫酸鎂對有機相進行干燥。過濾沉淀，將溶劑濃縮后在0. SmL乙酸乙酯和 6mL正己烷的混合溶液中重結晶得到單體NHSMA。在氮氣氛圍下，將7. 93g OEGMA,312mg的2，2-聯吡啶和143mg溴化亞銅溶于15mL 甲醇和水(2 1)的混合溶液中。將上述溶液超聲5min后轉移到表面固定α -溴丁酰溴 引發劑的硅片，室溫下反應4h后用大量的水和乙醇對表面進行清洗，后用氮氣吹干。將上 述表面置于含有14mg溴化亞銅，0. 92g NHSMA, 42 μ LPMDETA的6mL苯甲醚中，反應在100°C 下進行6h。反應結束后用大量的DMF對硅片進行清洗并在真空箱中烘干。將膜片置于0. lmg/mL的纖連蛋白的磷酸鹽緩沖溶液(pH = 7. 4)中0°C反應24h。 反應結束后用磷酸鹽緩沖溶液、水、乙醇清洗表面，并將該膜片置于0. IM(EG)2NH2的乙醇溶 液中以將殘余的活性酯基團進行鈍化。即可得到高密度固定纖連蛋白的生物活性表面。
權利要求
一種高密度固定生物功能分子的材料的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)POEGMA改性表面的制備將固定有引發劑的材料表面，在氮氣保護下置于含有催化劑/配體體系和OEGMA單體的溶液中進行ATRP反應，反應溫度為0～45℃，反應時間為0.5～6小時，得到POEGMA改性表面；POEGMA為聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的英文縮寫，OEGMA為甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯的的英文縮寫，ATRP為原子轉移自由基聚合的英文縮寫；(2)NHSMA的制備在反應裝置中，先按1∶1～1.2∶1的摩爾比將甲基丙烯酰氯緩慢滴入到NHS的溶液中，在三乙胺存在的條件下攪拌反應，反應溫度為0～35℃，反應時間為1～12小時，得到NHSMA的單體溶液；再將該單體溶液經過重結晶得到白色晶體NHSMA；所述NHSMA為甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺的英文縮寫，所述NHS為N-羥基琥珀酰亞胺的英文縮寫；(3)POEGMA-PNHSMA改性表面的制備將所得的POEGMA改性表面置于含有催化劑/配體體系和所得的NHSMA的單體溶液中進行二次ATRP反應，反應溫度為70～100℃，反應時間為2～6小時，得到POEGMA-PNHSMA改性表面；(4)POEGMA-PNHSMA改性表面固定生物活性分子將所得的POEGMA-PNHSMA改性表面置于含有生物活性分子的溶液中進行反應，溫度控制在0～40℃，反應時間為2～24小時，反應結束后，將所述表面置于鈍化劑(EG)2NH2的溶液中對未反應的NHS基團進行鈍化，鈍化溫度為室溫，反應時間為2～12小時；經過上述步驟，最終得到高密度固定生物功能分子材料，該材料表面具有不吸附非特異蛋白的功能。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述固定有引發劑的材料為單晶硅或玻 璃；該引發劑為α “溴丁酰溴、α “溴代異丁酰溴或α “溴代丙酰溴。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的催化劑/配體體系為溴 化亞銅/五甲基二亞乙基三胺或溴化銅/抗壞血酸；步驟(3)所述的催化劑/配體體系為 溴化銅/五甲基二亞乙基三胺，或溴化亞銅/五甲基二亞乙基三胺。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的OEGMA單體溶液為水溶液，甲醇溶 液，或水和甲醇的混合溶液。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的NHS溶液為N-羥基琥珀酰亞胺的 三氯甲烷溶液，按W/ν計，三乙胺用量為所述溶液的10 25%。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的NHSMA單體溶液為苯甲醚溶液或 二甲基亞砜溶液。
7.根據權利要求1所述的改性方法，其特征在于所述的生物活性分子為生物素酰阱、 纖連蛋白、膠原蛋白、肝素、賴氨酸或其他含有氨基的生物分子。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物活性分子的溶液為乙醇溶液、 乙酸溶液、磷酸鹽緩沖溶液或其他可以溶解相應生物活性分子的溶液。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的(EG)2NH2的溶液為乙醇溶液。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟⑷完成后，將P0EGMA-PNHSMA改性 表面從溶液中取出，分別用乙醇或水溶劑進行清洗，得到固定有生物素、膠原蛋白和肝素生物活性分子的生物功能表面 。
全文摘要
本發明涉及具有生物活性功能表面的制備方法，該方法是通過原子轉移自由基聚合(ATRP)技術在材料表面接枝具有優良排斥非特異性蛋白質吸附能力的聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯(POEGMA)；而后利用二次引發ATRP在POEGMA末端接枝聚甲基丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(PNHSMA)，利用PNHSMA側鏈所含有的大量活性酯基團可以高密度地固定含氨基的生物分子。本發明提供的生物活性功能表面可以顯著提高生物分子在表面的接枝密度，同時減少由非特異性蛋白質吸附造成的不良影響，有效地保持了固定的生物分子的活性；可以固定多種生物分子，適用于較廣的生物醫用領域。
文檔編號C04B41/48GK101810888SQ20101012690
公開日2010年8月25日 申請日期2010年3月16日 優先權日2010年3月16日
發明者于謙, 張燕霞, 陳紅 申請人:武漢理工大學