用于微粒遞送鋅原卟啉的制劑的制作方法
【專利摘要】本發明提供了涉及生物相容遞送鋅原卟啉(ZnPP)的制劑及其使用方法。在一些實施方案中，將所述ZnPP配制用于口服遞送。制劑可包含ZnPP微粒，其中將所述ZnPP活性劑與藥學上可接受的穩定劑混合或用藥學上可接受的穩定劑涂布，以提供對酸性條件增加的穩定性和在中性pH增加的溶解性。
【專利說明】用于微粒遞送鋅原卟啉的制劑
[0001] 相關申請
[0002] 本申請請求保護于2014年2月3日提交的美國臨時專利申請序列號61/935,200的 優先權權益，將其全部內容引入本文作為參考。
[0003] 政府支持
[0004] 本發明是基于美國國立衛生研究院授予的契約TW008781在政府支持下完成的。美 國政府具有本發明一定的權利。
【背景技術】
[0005] 金屬卟啉是血紅素的結構類似物且對它們在處理新生兒高膽紅素血癥和其他病 癥中的潛在用途已經進行了大量研究，持續超過三十年。使用這類化合物來控制膽紅素水 平的藥理學基礎是通過競爭性抑制血紅素加氧酶(H0)靶向阻止膽紅素生成，所述血紅素加 氧酶是膽紅素生成途徑中的限速酶。目前的研究繼續通過限定用于治療過度新生兒高膽紅 素血癥的治療窗和靶向干預來尋求鑒定安全且有效的金屬卟啉。
[0006] H0酶以組成型(H0-2)和誘導型(H0-1)亞型存在。血紅素加氧酶是代謝性酶，其利 用NADPH和氧來分裂血紅素部分，從而釋放膽綠素、一氧化碳(C0)和鐵。膽綠素(BV)和膽紅 素(分別是膽綠素還原酶的底物和產物)是有效的抗氧化劑。H0-1在細胞內環境穩定中的作 用包括充當細胞應激的重要"感受器"和限制或預防組織損傷的直接貢獻者的特征;參與產 生在對應激的細胞適應中的H0活性。H0-1路徑及其產物的藥理學處理可用于提供針對以氧 化應激和炎癥為特征的各種病癥的保護。
[0007] 鋅原卟啉(ZnPP)是在血紅素生物合成中以痕量形成的正常代謝產物。血紅素的生 物合成途徑中的最終反應是鐵與原卟啉的螯合。在鐵不足或所用鐵被削弱期間，鋅成為亞 鐵螯合酶的另一金屬底物，從而增加 ZnPP的形成。證據表明，這一金屬取代是對鐵衰竭的第 一生物化學響應中的一種，導致增加的ZnPP出現在循環的紅細胞中。因為這一鋅-對-鐵的 替代主要發生在骨髓中，因此紅細胞中ZnPP/血紅素的比率反映出骨髓中鐵的狀態。此外， ZnPP可通過H0的競爭性抑制來調節血紅素的分解代謝，所述H0是產生膽紅素和C0的血紅素 降解途徑中的限速酶。在臨床上，ZnPP量化作為用于評估鐵營養和代謝的靈敏且特異性的 工具是有價值的。診斷測定適用于各種臨床情況，包括兒科、產科和血庫。
[0008] ZnPP具有用于治療新生兒黃疸和其他病癥的一些所需特性：其是高度有效的；其 無需穿過血腦屏障(BBB);其對光活化是相對惰性的并因此在體內沒有光敏化/光毒效應； 且其不會被H0降解。但是，該化合物的遞送是困難的。本發明解決了這個問題。

【發明內容】

[0009] 本發明提供了涉及生物相容的遞送有效劑量的鋅原卟啉(ZnPP)的制劑及其使用 方法。在一些實施方案中，將所述ZnPP配制用于口服遞送。這些制劑提供了ZnPP微粒，其中 所述ZnPP活性劑涂覆有藥學上可接受的賦形劑。在一些實施方案中，提供了治療組合物，其 包含含有ZnPP的包衣微粒和藥學上可接受的賦形劑。所述治療組合物可配制用于口服給 藥，包括但不限于通過胃管等例如作為液體給藥至新生兒和嬰兒。
[0010]本文所述微粒包含所述ZnPP活性劑和藥學上可接受的穩定劑，例如，其中所述活 性劑可以是總微粒重量的至少約5%，且優選不超過總微粒重量的約50%。所述穩定劑可防 止所述活性劑在低pH下（例如，存在于胃中的酸性條件)不穩定。所述穩定劑還可以增加所 述活性劑在中性pH的溶解度，例如，提高在存在于腸的中性條件下的吸收。
[0011] 可將所述微粒混懸于藥學上可接受的載體中，以提供充分濃縮的制劑來遞送在合 理的制劑體積中的所需劑量的活性劑。載體包括藥學上可接受的賦形劑，包括水性賦形劑。 這種組合物可以單位劑量制劑提供，例如，包含一定劑量的微粒ZnPP以用于給藥至患者。所 述單位劑量通常還將進一步包含賦形劑，例如，提供用于增強穩定性和溶解性的賦形劑。在 某些實施方案中，有效劑量的活性劑是指當提供給患者時，有效抑制誘導型血紅素加氧酶 (H0-1)、但比其抑制組成型血紅素加氧酶(H0-2)的程度要高、優選基本上不抑制組成型血 紅素加氧酶(H0-2)的劑量。在某些實施方案中，相對于不存在用本文所述組合物或方法進 行治療的對照而言，有效劑量刺激在嬰兒或新生兒中增加了膽紅素降解。
[0012] 也提供了用本文所述的制劑和組合物進行治療的方法。在一些實施方案中，提供 了用ZnPP治療高膽紅素血癥的方法，其包括向有此需要的個體給藥有效劑量的本文所述 ZnPP的微粒制劑的步驟。
[0013] 更具體地，所公開的實施方案包括在嬰兒中治療高膽紅素血癥或其癥狀的方法。 在一些實施方案中，所述嬰兒是約35周至約43周的胎齡。在其他實施方案中，所述嬰兒的年 齡不超過30天。在一些實施方案中，所述嬰兒具有約2,500g的最小出生體重。在一些實施方 案中，所述嬰兒具有約1，700g至約4，000g的出生體重。在一些實施方案中，所述嬰兒具有至 少一種危險因素，例如，溶血性疾病、ΑΒ0血型不相容、抗-C Rh不相容、抗-c Rh不相容、抗-D Rh不相容、抗-E Rh不相容、抗-e Rh不相容、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏，或其任意組 合。在一些實施方案中，本文所述的ZnPP制劑在選自以下的時間進行給藥：出生約6小時內、 出生約12小時內、出生約24小時內和出生約48小時內。在一些實施方案中，所述ZnPP制劑通 過口服給藥。
[0014] 一些實施方案還包括在給藥所述ZnPP制劑后測定治療后總膽紅素水平。在一些實 施方案中，治療后總膽紅素水平在向所述嬰兒給藥治療量的ZnPP制劑后24小時為基線總膽 紅素(TB)水平以下至少5%。在一些實施方案中，治療后TB水平在向所述嬰兒給藥治療量的 ZnPP制劑后48小時為基線TB水平以下至少10%。在一些實施方案中，治療后TB水平在向所 述嬰兒給藥治療量的ZnPP制劑后72小時為基線TB水平以下至少20%。在一些實施方案中， 治療后TB水平在向所述嬰兒給藥治療量的ZnPP制劑后48小時為超過基線TB水平不到3mg/ dL〇
[0015] 還發現本文所述制劑用于其他方法，其中需要遞送有效劑量的ZnPP。在一些實施 方案中，提供了治療癌癥的方法。H0-1已經顯示出涉及促癌活性。通過抑制H0,本文所述 ZnPP制劑在單獨或與化學療法或放射療法組合時可在例如治療實體瘤(如癌等）中發揮抗 腫瘤活性。
[0016] 其他方法包括，但不限于，在各種需要選擇性抑制H0的病癥中治療年齡相關性黃 斑變性、治療感染等。還發現，本文所述的組合物能用作NMR成像的造影增強劑。
【附圖說明】
[0017] 圖1提供了血紅素降解途徑的示意圖。膽紅素生成的減少可通過抑制血紅素加氧 酶(H0)(其為血紅素降解途徑中的限速酶)而被靶向。血紅素被H0降解以產生等摩爾量的一 氧化碳(C0)和膽綠素，然后將所述膽綠素立即用膽綠素還原酶降解以形成膽紅素。
[0018] 圖2包括三組（(A)、（B)和(C))，其顯示了光毒性研究的實驗裝置。以3.75-30μπι〇1/ kg體重(BW)范圍內的劑量向3日齡的幼鼠（在組(Α)中放大)腹腔給藥載劑或Μρ，并然后將其 暴露于熒光3小時，所述熒光由2個冷白光和1個藍光管組成（如組(Β)所示），其發射35.0 ± 1.0yW/cm2/nm的福照，由BiliBlanket II Meter測量（如組(C)所示）。
[0019 ]圖3描述了總結ZnBG的安全性和有效性的數據。向暴露于光的3日齡幼鼠給藥3.7 5 μπιο? ZnBG/kg BW，其顯示出無光毒性，正如100%的存活率（空心欄)和高達75%的抑制H0 活性(實心欄)所示。
[0020] 圖4描述了在與各種鋅制劑接觸后H0活性的體外抑制。使用從3日齡幼鼠中采集的 肝、脾和腦的超聲處理物評估30μΜ的ZnPP制劑的體外H0抑制效力。
[0021] 圖5包括顯示了胃內注射ZnPP制劑的兩個組。向3日齡小鼠幼鼠直接胃內（IG)注射 30ymol/kg BW劑量的ZnPP制劑。圖5還包括顯示了給藥如下制劑后3小時的胃內容物的四個 組：水性ZnPP磷酸鹽（ZnPP-P〇4); ZnPP-殼聚糖（ZnPP-A和ZnPP-Β); ZnPPEUDRAG丨T? (ZnPP-Poly);和ZnPP磷脂（ZnPP脂質）。
[0022] 圖6(A)描述了H0活性的體內抑制。將制劑或VEH胃內注射到3日齡新生的FVB小鼠 幼鼠中。給藥后3小時，采集肝、脾和腦并通過氣相色譜(GC)測定H0活性。抑制表示為對照值 的％。
[0023]圖7描述了兩個組（（A)和(B))，其顯示了具有以下成分的噴霧干燥的顆粒的SEM圖 像：（A)75%w/wEUDRAG丨T?;和⑶38%EUDRAGmi^褶皺的形態表明在顆粒形成期 間的早期聚合物沉淀確保了有效的藥物包封。
[0024]圖8描述了兩個組（（A)和(B))。組(A)顯示了給藥在磷酸鈉緩沖液中的ΖηΡΡ-Ρ04的 幼鼠胃內容物；原卟啉在胃中沉淀。組(B)顯示了給藥ZnPP噴霧干燥微粒的幼鼠的胃內容 物;所述噴霧干燥的微粒不沉淀。
[0025]實施方案詳述
[0026] 在描述本發明方法之前，應理解本發明并不限于所述的具體方法，因此當然可能 變化。還應理解，本文所用術語僅用于描述具體實施方案且不旨在繼續限制，因為本發明的 范圍僅在所附權利要求中進行限定。
[0027] 當提供數值范圍時，應理解每個在該范圍的上限和下限之間的中間值(除非本文 另有明確提及，否則為下限單位的十分位）以及在所述范圍內的任意其他提及的或中間值 均包括在本發明中。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括在本發明所涵蓋的較小的范 圍內，以所述范圍內具體排除的限定為準。
[0028] 除非另外提及，本文所述所有技術和科學術語與本發明所屬技術領域一般技術人 員通常所理解的具有相同的含義。雖然與本文所述的那些方法和材料類似或等同的任意方 法和材料也可用于實施或測試本發明，但目前所描述的是優選的方法和材料。本文所提及 的所有出版物通過引用的方式并入本文中以公開和描述與所引用的出版物相關的方法和/ 或材料。
[0029]需要注意的是：除非上下文中另有明確提及，否則本文和在所附權利要求中所用 的單數形式"一"、"該"和"所述"包括復數對象。因此，例如，針對"微球"的提及，其包括多個 這樣的微球且對于"所述支架"的提及，其包括一個或多個支架及本領域技術人員已知的它 的等價物，等等。
[0030] 本文所用術語"治療（treating和treatment)"通常是指獲得所需的藥理學和/或 生理學效果。該效果就預防或部分預防疾病、癥狀或其病癥而言可以是預防性的，和/或就 部分或完全治愈病癥、癥狀或由該病癥引起的不良反應而言可以是治療性的。本文所用術 語"治療"具體包括施用包含微粒形式的ZnPP活性劑的組合物，包括口服給藥。本文所用術 語"預防"是指用于預防或部分預防疾病或病癥所采取的一種或多種措施。
[0031] 術語"預防"是本領域公認的，且當用于病癥時是本領域熟知的且包括給藥組合 物，該組合物相對于未接受該組合物的受試者而言在受試者中降低該病癥的可能性或延遲 其發作。因此，高膽紅素血癥的預防包括，例如，相對于未接受所述組合物的受試者而言，降 低接受所述組合物的受試者出現高膽紅素血癥的可能性，和/或相比于未治療的對照人群， 在治療人群中（平均而言)例如以統計學和/或臨床上顯著的量推遲高膽紅素血癥的發作。
[0032] 術語"受試者"包括哺乳動物，例如，貓、狗、馬、豬、牛、綿羊、嗤齒類動物、兔、松鼠、 熊和靈長類動物，例如黑猩猩、大猩猩和人。
[0033]生理性黃疸在過渡時期（出生后1周）是常見的且在60%_70%的足月嬰兒中觀察 到。該病癥是由以下導致的:胎盤對膽紅素清除的突然停止和在肝臟膽紅素攝取、胞內運輸 和葡糖醛酸基轉移酶(UGT1A1)共輒活性方面的瞬間缺乏。一個主要的致病因素是在新生兒 中膽紅素產生的速率相比于成人中的速率增加2-3倍。所述血紅素降解過程產生等摩爾量 的C0和膽紅素。患有同族免疫性溶血性疾病(例如，Rhesus和ΑΒ0不相容)或其他溶血性病癥 (例如，G6H)缺乏）的新生兒通常具有升高的膽紅素產生速率，其與升高的TB水平相關。在經 驗上，在溶血性疾病的情況下，升高的TB濃度已與神經毒性和腦損傷(核黃疸）相關且已促 使使用攻擊性且相對高風險的干預，例如換血療法。
[0034](在成年期)低智商分數的風險可在患有嚴重非溶血性黃疸的男嬰中顯著增加。此 外，已經在表面健康的長期和短期母乳喂養的嬰兒中或患有未鑒定的溶血性疾病的嬰兒中 報道了越來越多的核黃疸病例。此外，近期的隨機對照試驗結果顯示，積極的光療顯著降低 神經發育損傷(NDI)的速度，但其被極輕出生體重(ELBW)嬰兒(重501-750g)中增加的死亡 率所抵消，這進一步強調了對預防性方法的需求，包括調節膽紅素的產生并因此降低危險 性高膽紅素水平在這一高風險群體中的可能性的藥理學方法。
[0035]目前批準的且常用于高膽紅素血癥的治療包括光療和換血療法。光療涉及用430-490nm范圍的光（藍光）照射新生兒。該光將膽紅素轉變成光紅素和光膽紅素 (photobilirubin)，其為低毒性的水溶性光致同分異構體，其更容易被嬰兒排出并由此可 導致膽紅素水平的降低。
[0036] 本文所用術語"藥學上可接受的"是指化合物或化合物的組合，其不會將人或動物 接受者的生理損傷到會危害該接受者的生存力的程度。優選地，所給藥的化合物或化合物 組合最多是引起對人或動物接受者的健康暫時的有害影響。
[0037] 本文所用術語"載體"是指任意藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或其他分散試劑， 其將使得治療組合物通過所需途徑進行給藥，例如，通過口服給藥。因此，本文所用的"載 體"包括本領域技術人員已知的這種賦形劑和化合物，其對人或動物接受者是藥學上和生 理學上可接受的。
[0038]本文所述制劑包括上文所述的穩定化ZnPP微粒，其中相對于未包衣的ZnPP，所述 微粒在酸性條件下具有增加的穩定性，和/或在中性pH下具有提高的溶解性。在酸性條件 下，例如在不超過4.5、不超過4.3、不超過4、不超過3.5的pH下，ZnPP沉淀并降解成無活性成 分。在一些實施方案中，所述微粒對酸性條件至少10%更穩定、至少20%更穩定、至少30% 更穩定、至少40 %更穩定、至少50 %更穩定、至少75 %更穩定，且可至少2倍更穩定、至少5倍 更穩定、至少10倍更穩定或更多倍更穩定。穩定性可通過觀察在體外實驗條件下的沉淀和 降解進行實驗性確定。
[0039]本發明的穩定化微粒制劑還能夠提高ZnPP在中性pH的吸收，例如，在大于5.5但小 于8.5的pH，包括大于約6.0、大于約6.5、大于約7.0和小于約8.5、小于約8.0的pH。在一些實 施方案中，所述微粒在中性pH下至少10%更可溶、至少20%更可溶、至少30%更可溶、至少 40 %更可溶、至少50 %更可溶或至少75 %更可溶，且可至少2倍更可溶、至少5倍更可溶、至 少10倍更可溶或更多倍更可溶。溶解性可通過常規方法進行實驗性確定。
[0040] 所述微粒可包含活性劑和穩定劑或基本上由活性劑和穩定劑組成。在一些實施方 案中，所述活性劑在該微粒中的濃度為總重的至多約5 %、至多約10 %、至多約15 %、至多約 20%、至多約25%、至多約30%、至多約35%、至多約40%、至多約45%、至多約50%，等等， 且可為約5%重量至約50%重量、約10%重量至約40%重量、約15%重量至約35%重量、約 20%重量至約30%重量，優選約5%重量、約6%重量、約7%重量、約8%重量、約9%重量、約 10%重量、約11 %重量、約12%重量、約13%重量、約14%重量、約15%重量、約16%重量、約 17%重量、約18%重量、約19%重量、約20%重量、約21 %重量、約22%重量、約23%重量、約 24%重量、約25%重量、約26%重量、約27%重量、約28%重量、約29%重量或約30%重量。
[0041] 所述微粒重量的余量通常由穩定劑提供，即，所述穩定劑為總重的至多約95%、至 多約90%、至多約85%、至多約80%、至多約75%、至多約70%、至多約65%、至多約60%、至 多約55%、至多約50%、至多約45%、至多約40%。在一些實施方案中，在該微粒中的穩定劑 的濃度優選為約95 %重量、約94 %重量、約93 %重量、約92 %重量、約91 %重量、約90 %重 量、約89%重量、約88%重量、約87%重量、約86%重量、約85%重量、約84%重量、約83%重 量、約82%重量、約81 %重量、約80%重量、約79%重量、約78%重量、約77%重量、約76%重 量、約75%重量、約74%重量、約73%重量、約72%重量、約71 %重量或約70%重量。所述穩 定劑在酸性條件下提供增加的穩定性，并在中性pH條件下提供增加的溶解性。
[0042] 所述微粒可具有控制的尺寸，以適用于最優化的藥物遞送。通常，所述顆粒將具有 至多約l〇nm、至多約50nm、至多約100nm、至多約250nm、至多約500nm、至多約Ιμπι、至多約2 · 5 μπι、至多約5μηι和不超過約ΙΟμπι的直徑。在一些實施方案中，所述微粒尺寸為直徑約lOOnm至 約5μηι，例如約100至約500nm、約500nm至約Ιμπι等。多個微粒任選地具有確定的平均尺寸范 圍，其可以是基本均勻的，其中該差異可不超過直徑的100 %、50 %或10 %。微粒的直徑可例 如使用掃描電子顯微鏡檢查(SEM)進行測量。
[0043] 微粒可通過各種方法形成，包括，在一些實施方案中，本文所列舉的方法。感興趣 的方法可包括，但不限于，控制的陽離子誘導的微乳液;和噴霧干燥。多聚微粒制造方法可 包括聚合電解質絡合物的形成、復乳劑/溶劑蒸發技術、乳液聚合技術等。噴霧干燥是一種 方法，其使用在水性或其他液體相中溶解或懸浮的藥物的射流，其通過高壓噴嘴加壓以產 生細霧。通常，也將增量劑加至該液體中。所述霧的水性或其他液體內容物蒸發，留下細粉 末。噴霧干燥的修飾方法，稱為空氣霧化的噴霧干燥，使用兩個楔形噴嘴，壓縮的空氣通過 該噴嘴且液體溶液以高速通過。所述楔形噴嘴充當液體加速區，其中四股流以高速碰撞，產 生沖擊波，該沖擊波產生細小的液滴。然后將該液滴沉降到柱上并在收集前被熱空氣干燥 成固體粉末。
[0044] 感興趣的穩定劑包括，但不限于，海藻酸鹽、殼聚糖、卵磷脂，其是與磷酸的膽堿酯 相連的硬脂酸、棕櫚酸和油酸的甘油二酯的天然存在的混合物;三偏磷酸鈉;泊洛沙姆，即， 由聚氧丙烯(聚(環氧丙烷））的中央疏水鏈以及側面的聚氧乙烯(聚(環氧乙烷））的兩個親 水鏈組成的非離子型三嵌段共聚物，包括各種尺寸，例如，泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等；陽 離子脂質，尤其是磷脂；油，例如椰子油等。殼聚糖是由無規分布的_(1，4)D-葡糖胺和N-乙 酰基-D-葡糖胺組成的線性多糖。其他感興趣的穩定劑包括，例如蛋白質，例如白蛋白（例如 牛血清白蛋白、人血清白蛋白等）和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(N-乙烯基吡咯烷酮的水溶性支 鏈聚合物）。用于本文所述組合物和方法的PVP可具有約10K或更高的分子量，例如，約20K至 50K〇
[0045] 術語"陽離子脂質"旨在包括在生理學pH帶正電荷的分子，且更具體地，組成型正 電荷分子，其例如包含季銨鹽基團。用于本發明方法中的陽離子脂質通常由親水性極性頭 基和親脂性脂肪鏈組成。參見，例如，Farhood等人（1992)Biochim.Biophys .Acta 1111: 239-246;Vigneron等人（1996)Proc.Natl .Acad. Sci.(USA)93:9682-9686。
[0046] 感興趣的陽離子脂質包括，例如，咪唑啉衍生物(WO 95/14380)、胍衍生物(WO 95/ 14381)、磷酯酰膽堿衍生物(W0 95/35301)和哌嗪衍生物(W0 95/14651)。可用于本發明的 陽離子脂質的實例包括1，2_二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DSPC); 1，2_二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿（DPPC) ;D0TIM(也稱為B0DAI)(Solodin等人，（1995)Biochem.34: 13537-13544)、DDAB(Rose等人，（1991 )BioTechniques 10(4) :520-525)、D0TMA(美國專利 No.5,550,289)、D0TAP(EibMPWooley(1979)Biophys.Chem.l0:261-271)、DMRIE(Felgner 等人，（1994)J. Biol. Chem. 269(4) :2550-2561 )、EDMPC(可商購自 Avanti Polar Lipid， Alabaster，Alabama)、DCChol(Gau和Huang(1991)Biochem.Biophys·Res·Comm.179:280-285)、D0GS(Behr等人，（1989)Proc.Natl .Acad. Sci.USA，86 : 6982-6986)、MB0P(也稱為 MeBOP) (W0 95/14651)和描述于W0 97/00241 中的那些。
[0047] 在一些實施方案中，所述ZnPP用一種或多種陽離子脂質穩定于微粒制劑中。感興 趣的脂質包括任意上文所列的那些，例如，包括DSPC、DPPC、D0TIM、DDAB、D0TMA、DMRIE、 EDMPC、DCCho 1、DOGS、ΜΒ0Ρ等，其可單獨使用或可作為不同脂質的混合劑，例如，比例為10: 1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10等的兩種脂質。所述脂質可占以重量計至多所述微粒的約 90%、至多所述微粒的約85 %、至多所述微粒的約80 %、至多所述微粒的約75 %、至多所述 微粒的約70%、至多所述微粒的約65%或至多所述微粒的約50%，其中余量可為活性劑，或 可與以下組合，例如，EUDRAGIT?L 30D-55,其是具有甲基丙烯酸作為官能團的的陰離 子聚合物的水性分散體，其濃度為所述制劑重量的約35%至約75%。但是，在一些實施方案 中，所述微粒不含有EUDRAGFT?。在某些實施方案中，所述微粒包含約10%至約25%重 量的ZnPP，且余量是上述比例的DSPC和DPPC的混合物。
[0048]在一些實施方案中，將所述ZnPP用包含卵磷脂、泊洛沙姆、中性油載體(例如，椰子 油)和海藻酸鹽、三偏磷酸鈉和殼聚糖中的一種或多種的混合物穩定于微粒制劑中。在某些 實施方案中，所述微粒包含按重量計約5%至約25%的ZnPP、約10%至約20%的ZnPP。在這 樣一些實施方案中，所述卵磷脂以微粒重量的約10%至不超過約40%、約20 %至不超過約 30%的濃度存在。在這樣一些實施方案中，所述泊洛沙姆以微粒重量的約10 %至不超過約 40 %、約15 %至不超過約25%的濃度存在。該制劑的余量包含中性油載體和所述穩定劑、基 本上由中性油載體和所述穩定劑組成、或由中性油載體和所述穩定劑組成。
[0049] 在這樣一些實施方案中，所述穩定劑是海藻酸鹽，其以微粒重量的約3%至約6%、 約4%至約5%和可為約4.5%的量存在。
[0050] 在這樣一些實施方案中，所述穩定劑是殼聚糖，其以微粒重量的約3%至約6%、約 4%至約5%和可為約4.5%至5%的量存在。
[0051] 在這樣一些實施方案中，所述穩定劑是三偏磷酸鈉，其以微粒重量的約3%至約 6%、約4%至約5%和可為約4.5%至5%的量存在。
[0052] 優選的藥物組合物被配制用于口服遞送。在一些實施方案中，本發明的微粒例如， 以單位劑量提供，例如在給藥前立即重構的干粉。根據所需的制劑，藥物組合物可包含藥學 上可接受的無毒載體或稀釋劑，其被定義為通常用于配制成用于人或動物給藥的藥物組合 物的載劑。選擇所述稀釋劑以便不影響該組合的生物學活性。這種稀釋劑的實例是蒸餾水、 緩沖水、生理鹽水、PBS、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，所述藥物組合物或制劑 可包含其他載體，或無毒、非治療性、非免疫原性的穩定劑、賦形劑等。所述組合物也可包含 額外的物質以接近生理條件，例如pH調節劑和緩沖劑、毒性調節劑、濕潤劑和洗滌劑。
[0053]在其他實施方案中，口服遞送制劑作為薄膜提供，例如其中將微粒的干燥粉末制 劑分散于含有膜形成聚合物的溶劑中，其可被鑄造于薄膜中并包裝成例如單位劑量。
[0054]其他口服制劑包括，但不限于，片劑、錠劑、膠囊、噴灑劑(sprinkles)、囊劑、支裝 (s t i ck-pack)等本領域已知的并適用于本發明的微粒。
[0055] 如上所述，本領域技術人員將理解，可使用多種不同的治療和給藥方法以治療單 個患者。
[0056] 每日的總劑量優選每日給藥至少一次，但可分成每日兩或更多個劑量。一些患者 可從以下周期獲益:在數天或數周的時間中用更高劑量或更高頻率的給藥"加載"至所述患 者，然后給藥減少的劑量或維持劑量。
[0057] 針對可與氣霧遞送裝置連接使用的制劑的具體信息描述于Remington ' s Pharmaceutical Sciences,A.R.Gennaro editor(最新版）Mack Publishing Company。對 于藥物遞送方法的簡述，參見，Langer，Science249:1527-1533(1990)。
[0058] 可給藥所述藥物組合物以用于預防性和/或治療性治療。活性成分的毒性和治療 效果可根據細胞培養和/或實驗動物的標準藥物規程確定，包括，例如，測定LD 5Q(50%群體 致死的劑量)和ED5Q(50%群體治療有效的劑量）。毒性和治療效果之間的劑量比是治療指數 且其可表達為比率LD 5Q/ED5Q。優選呈現大治療指數的化合物。
[0059] 從細胞培養和/或動物研究中獲得的數據可用于配制一系列的用于人的劑量。所 述活性成分的劑量通常位于循環濃度的范圍內，其包括了具有低毒性的ED 5Q。所述劑量可根 據所采用的劑型和所用給藥途徑在此范圍內變化。
[0060] 用于配制所述藥物組合物的成分優選是高純度的且基本上不含可能有毒的污染 物（例如，至少是國家食品（NF)級的，通常至少是分析級的，且更通常至少是藥用級的）。此 外，旨在體內使用的組合物通常是無菌的。如果給定的化合物必須在使用前合成，那么所得 產物通常基本上不含任何可能有毒的試劑，特別是任何內毒素，其可存在于合成或純化過 程中。用于胃腸外給藥的組合物也是無菌的、基本上等滲的以及在GMP條件下制成的。
[0061] 本發明的組合物可以使用任意醫學上合適的操作進行給藥。給藥至具體患者的治 療組合物的有效量將取決于各種因素，其中的一些將因患者的不同而有所不同。有能力的 臨床醫生將能夠確定治療劑的有效量。所述組合物可以多于一次給藥的系列給藥方式給藥 至所述受試者。
[0062] 本領域技術人員將容易地了解，劑量水平可根據具體化合物、癥狀的嚴重性以及 受試者對副作用的敏感性而變化。一些藥物比其他藥物更有效。給定試劑的優選劑量由本 領域技術人員通過各種方式容易地確定。優選的方法是測量給定化合物的生理學效力。 [0063] 試劑盒和包裝
[0064]在一些實施方案中，提供了用于本發明方法中的制劑。這種制劑可包含穩定化的 ZnPP微粒等，其可提供于適于臨床使用的包裝中，包括作為凍干、無菌粉末的包裝;例如微 粒在載體中的穩定混懸液的包裝;適用于使用前混合的微粒和載體的單獨包裝;等等。該包 裝可為單個的單位劑量，在制備用于提高患有高膽紅素血癥的患者功能的藥物中提供有效 劑量的微粒形式的ZnPP活性劑。
[0065]治療方法
[0066] 本文所述的方法包括以有效抑制H0酶的劑量給藥(優選口服給藥)包含本文所述 的含有ZnPP的微粒的藥物組合物。口服給藥利用"首過效應"得以靶向遞送，從而定位至肝 和脾。所述ZnPP也可在口服遞送后為全身性的。所述有效劑量可根據個體的年齡、所治療的 病癥等而變化。
[0067] 實施方案包括在嬰兒中治療高膽紅素血癥或其癥狀的方法。在一些實施方案中， 所述嬰兒的胎齡是約35至約43周。在其他實施方案中，所述嬰兒的年齡不超過30天。在一些 實施方案中，所述嬰兒具有約2,500g的最小BW。在一些實施方案中，所述嬰兒具有約l，700g 至約4,000g的BW。在一些實施方案中，所述嬰兒具有至少一個危險因素，例如，溶血性疾病、 ΑΒ0血型不相容、抗-C Rh不相容、抗-c Rh不相容、抗-D Rh不相容、抗-E Rh不相容、抗-e Rh 不相容、G6H)缺乏及其組合。在一些實施方案中，在選自以下的時間進行治療量ZnPP制劑的 給藥：出生約6小時內、出生約12小時內、出生約24小時內和出生約48小時內。在一些實施方 案中，所述ZnPP制劑通過口服給藥。
[0068]金屬卟啉表現為在給藥后大約6-12小時起效。給藥本文所公開的ZnPP可降低發病 率或降低對光療或換血療法的需求。在一些實施方案中，給藥本文所公開的ZnPP可縮短光 療的持續時間。在一些實施方案中，給藥本文所公開的ZnPP可降低光療的光強度。在一些實 施方案中，給藥本文所公開的ZnPP避免了對光療的需要。
[0069] 在作為治療高膽紅素血癥的藥物的治療用途中，ZnPP可以約O.lmg至約20mg ZnPP/kg BW(n〇的初始劑量進行給藥。在某些實施方案中，用金屬卟啉的治療是一次性單 次劑量的治療。在一些實施方案中，ZnPP以約0.5至約6mg/kg ZnPP/kgaM)的劑量進行給 藥。在一些實施方案中，ZnPP以約0.5mg/kg至約4mg/kg、約0.5mg/kg至約2mg/kg、約0.75mg/ kg至約1 · 5mg/kg、約1 · 5mg/kg至約4 · 5mg/kg或約3 · Omg/kg至約4 · 5mg/kg的劑量進行給藥， 包括約1.5mg/kg、約3. Omg/kg和約4.5mg/kg。但是，該劑量可根據患者的需要、待治療病癥 的嚴重性和所用的化合物而變化。針對特定情況的確定合適劑量屬于本領域技術范圍內。 例如，治療可用較小的劑量起始，該劑量低于所述化合物的最佳劑量。此后，該劑量可以小 的增量遞增直至達到該情況下的最佳效果。
[0070] -些實施方案還包括確定入選條件和篩選評估。在一些實施方案中，確定入選條 件和篩選評估包括，但不限于，經皮膽紅素(TcB)監測、聽力檢查(包括聽性腦干反應(ABR) (也稱為自動化聽性腦干反應[A-ABR]或腦干聽覺誘發電位[BAEP]))、12-導聯ECG、孕產婦 和受試者人口數據的檢查、受試者醫療史的檢查、入選和排除因素的檢查、受試者伴隨藥物 的檢查、生命體征評估、體檢(包括體重、身高、頭圍和眼）、皮膚檢查、Amiel-Tison神經病學 檢查、用于以下分析的采血樣:臨床化學、血液學(包括血涂片）、藥代動力學及其組合。
[0071] -些實施方案還包括對所述受試者在治療前、治療中、治療后或其組合的持續評 估。在一些實施方案中，持續評估包括，但不限于，cB監測、包括ABR(也稱為A-ABR或BAEP)的 聽力檢查、三個12-導聯ECG、孕產婦和受試者人口統計數據的檢查、受試者醫療史的檢查、 入選和排除因素的檢查、受試者伴隨藥物的檢查、生命體征評估、體檢(包括體重、身高、頭 圍和眼）、皮膚檢查、Amiel-Tison神經病學檢查、用于以下分析的采血樣:臨床化學、血液學 (包括血涂片）、藥代動力學及其組合。在一些實施方案中，生命體征包括測量體溫(腋下）、 血壓（用對于年齡和尺寸合適的設備進行測量）、脈率、呼吸速率及其組合。
[0072]本文所述制劑還發現用于其他方法中，其中需要遞送有效劑量的ZnPP。在一些實 施方案中，提供了治療癌癥的方法。已顯示，H0-1參與促腫瘤活性。通過抑制H0,在本文所述 制劑中的ZnPP(單獨或與化學療法或放射療法組合)可提供抗-腫瘤活性，例如，在治療實體 瘤例如癌等中。
[0073]其他方法包括，但不限于，在各種需要選擇性抑制H0的病癥中治療年齡相關性黃 斑變性、治療感染等。本文所述組合物還發現可用作用于NMR成像的造影增強劑。
[0074]雖然本發明已參考一些優選的實施方案相當詳盡地進行了描述，但其他形式也是 可能的。因此，所附權利要求的精神和范圍不應限于該說明書和說明書中所含的優選版本。 [0075] 實施例1
[0076] 光對金屬卟啉-治療的新生小鼠的影響
[0077] 新生兒高膽紅素血癥源于膽紅素生成及其清除之間的失衡。針對在極低出生體重 (ELBM)嬰兒中積極和保守光療的研究表明用積極的光療僅顯著降低神經發育損傷(NDI)的 速率，但是這種降低被在<501_750g的嬰兒中增加的死亡率所抵消。此外，已經在動物中顯 示了光(包括藍光）的光氧化作用。此外，也建議在ELBW嬰兒中較低的血紅蛋白水平可使他 們處于較高風險的光毒性中，因為較少的光被血液循環中的血紅蛋白吸收。金屬卟啉(Mp) 是用于治療高膽紅素血癥的有希望的藥物，但是其中大部分是光敏化的，且進而潛在會有 光毒性。鋅原卟啉(ZnPP)是一種有希望的Mp，其具有足夠的效力，但具有較差的溶解性且無 法經口吸收。我們已使用了各種FDA批準的可生物降解的聚合物和磷脂類來設計并研發 ZnPP微粒制劑，其提高了生物利用度并增強胃通道。我們發現，向3日齡小鼠灌胃給藥30μ mol/kg的ZnPP微粒引起的療效是30-μπιο1 ZnPP/kg在磷酸鹽緩沖液中的2倍，且沒有顯示光 毒性的跡象。我們的結論是，使用多聚物顆粒遞送系統(微米顆粒或納米顆粒)可提高ZnPP 的穩定性并提高其腸吸收，同時保留HO的抑制能力而沒有光敏效應，并因此可用于治療新 生兒高膽紅素血癥。
[0078]已經研究了血紅素加氧酶(H0)在特定生物過程中的功能;評估在成人和新生兒動 物模型中的血紅素周轉(turnover)，目的是通過給藥作為治療性化合物的金屬卟啉(Mp)來 調節酶活性。沒有發現Mp具有使得我們能夠預測最有效的化合物的具體的化學結構特征。 希望的藥物性質包括低IC 5Q;沒有光敏劑活性；口服吸收;不應穿過血腦屏障;應是短效的； 應該基本上不會上調HO-lmRNA、蛋白質或活性;且不應被螯合金屬離子的隨后釋放所降解。 [0079]光暴露對用金屬卟啉治療的新生小鼠的影響。我們證明了用于預防新生兒黃疸的 兩種有希望的Mp(鉻中卟啉(CrMP)和二甘醇鋅卟啉(ZnBG))的可能的光敏效應。我們選擇了 這兩種化合物，因為它們均是口服吸收的、相對有效、同時在所需劑量范圍內光反應性最小 且最低限度地上調恥-1轉錄。在這項研究中，我們以3.75-30.(^111 〇1/1^81的劑量范圍向3 日齡的小鼠幼鼠腹膜內（IP)給藥CrMP或ZnBG。將幼鼠置于黑暗中（對照)或暴露于由兩個冷 白光管(F20T12cW)和一個藍光(TL20W/52)管組成的熒光下，持續3小時（圖2)。在用CrMP治 療的幼鼠中，我們發現，置于黑暗中和暴露于光下的幼鼠分別具有LD 5Q(50%致死劑量)為 21.5和23. Oymol/kg的劑量依賴性死亡率。
[0080] 這兩組的存活率之間沒有顯著差異。相比于CrMP，被給藥30ymol/kg ZnBG并置于 黑暗中的幼鼠并沒有顯示出任何化學毒性。但是，暴露于光下之后，我們發現了 19.5μπι〇1/ kg的LD5Q且幼鼠出現顯著的體重降低、肝臟抗氧化能力下降以及肌酸激酶(CK-MB)和天冬氨 酸氨基轉氨酶(AST)水平的升高。此外，在光暴露后6天，用ZnBG處理的幼鼠在>7.5ymol/kg BW的劑量出現明顯的（gross)組織學皮膚的變化。有趣的是，在用30-μπιο 1 ZnBG/kg BW治療 和并暴露于發射藍光二極管(LED)光下的小鼠中未觀察到致死。綜上所述，我們發現，CrMP 具有化學毒性，但是沒有光毒性。ZnBG表現為不具有化學毒性，但其光毒性取決于光源。最 重要的是，低劑量的21^6(〈3.75以111 〇1/1^81)保留最大!10抑制效力而沒有光敏效應(圖3)。 [0081 ]使用鋅原卟啉(ZnPP)的決定。我們專注于對天然存在的ZnPP的研究，即在積極和 消極特征之間存在平衡的另一種有利化合物。它是一種具有足夠的效力的Mp，其在大鼠和 小鼠中對脾和腦的抑制50%酶活性的劑量（即IC 5Q)分別為約6.0和3. ΟμΜ;測量不到其跨越 血腦屏障;其不具有光化學活性;最低限度地上調細胞培養或新生小鼠中的Η0-1;具有快速 起效時間；短效；且不被Η0降解。此外，該化合物可以主要影響Η0-1、但不對一氧化氮合酶 (N0S)或基底可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)活性具有任何顯著程度的影響的低劑量進行給藥。 [0082]但是，ZnPP難以維持在溶液中且無法口服吸收，需要胃腸外給藥。在用熱損傷的紅 細胞處理的新生恒河猴的溶血性黃疸模型中，我們發現，皮下（SC)給藥40ymol/kg BW劑量 的ZnPP在24小時內有效將碳氧血紅蛋白和總膽紅素水平降低至基線水平。H0抑制靶向肝和 脾，而不影響腎或腦。
[0083]因此，該化合物在用于治療新生兒黃疸中是非常有希望的。盡管其本身在口服給 藥后并不有效，但使用多聚顆粒遞送系統的制劑提供口服生物利用度并增強胃通道。我們 之前已顯示，將Mp摻入脂質體中可顯著增加對脾的遞送并因此提高其療效。對于口服遞送 的需求也是重要的，因為不是所有的嬰兒都有用于胃腸外給藥的靜脈內（IV)通路，例如因 高膽紅素血癥再入院的晚期早產兒和足月嬰兒。此外，口服給藥利用"首過效應"將H0抑制 劑靶向遞送至肝和脾(靶器官）；而IV給藥引起全身性分布。因此，我們使用藥物遞送系統設 計和研發制劑，所述藥物遞送系統提高口服生物利用度并增強胃通道從而能夠將Mp靶向遞 送至肝和脾。這種多聚顆粒藥物遞送系統(微米顆粒或納米顆粒)提高藥物穩定性并增強胃 通道，以用于人類新生兒。
[0084]使用該方法，我們評估了很多制劑，其已成功地改善ZnPP的口服生物利用度和有 效性。使用多聚顆粒遞送系統(微米顆粒和納米顆粒)提供遞送方法，其可提高抵抗降解的 穩定性并增強腸吸收。在我們的研究中，ZnPP/脂質微粒是通過受控的陽離子誘導的微乳液 或噴霧干燥制備的。具體地，DPSS (1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)和DPSC(二硬脂 酰-sn-甘油基磷酸膽堿)是由FDA批準作為表面活性劑用于早產兒的可生物降解的磷脂。 [0085]鋅制劑。我們使用多聚顆粒遞送系統（微米顆粒或納米顆粒）設計了 5種不同的 ZnPP制劑以提高其穩定性并增強其腸吸收。腸溶包衣的微粒被設計為不僅保護ZnPP抵御胃 的酸性環境(我們發現所述酸性環境會導致ZnPP失活），而且在運輸至小腸的過程中在>5.5 的pH值使其釋放最大化。甲基丙烯酸共聚物（&^耶_兒100-55，在?!1〈5.5不溶）與0??〇 和/或DSPC組合使用，或僅使用磷脂。這些磷脂是FDA-批準的賦形劑，且是內源性磷脂，其用 作人工肺表面活性劑的主要成分，此前被批準以高濃度用于早產兒。所述微粒是由乳液或 噴霧干燥技術形成的。
[0086]制備并測試的ZnPP制劑如表1所示。將使用乳劑制備的制劑冷凍儲存并凍干以獲 得最終的基于殼聚糖的微粒(ZnPP-A和ZnPP-B)。使用噴霧干燥制成的制劑作為干粉儲存并 冷凍。盡管海藻酸鹽和殼聚糖是FDA批準用于成人的可生物降解的聚合物，但是它們并沒有 被批準用于早產嬰兒。進一步考慮批準供人類使用的乳劑，使得我們利用丙烯酸珠子(例 如，EUDRAGIT? )合成ZnPP-Poly。此外，制成ZnPP脂質制品，其由FDA批準的磷脂（即 DPPC和DSPC)所組成。
[0087] 表 1
[0088]
[0089] ZnPP制劑的評估。我們測試了 ZnPP制劑（ZnPP-A、ZnPP-B和ZnPP-Poly)相對于我們 之前的制備于〇.4M Na3P〇4、生理鹽水和蒸餾水中的磷酸鈉水溶液(ZnPP-P〇4)在從3日齡小 鼠幼鼠中采集的肝、脾和腦的組織超聲處理物中的體外H0抑制效力。我們發現，ZnPP-Poly 最有效地抑制肝H0活性，然后是我們的ΖηΡΡ-Ρ04溶液（圖4)。基于殼聚糖/海藻酸鹽的制劑 效力最差。所有制劑在脾和腦組織中具有類似的效力。基于這些有希望的發現以及ZnPP-月旨 質的設計，隨后我們評估了這些ZnPP制劑相比于ZnPP-P〇4溶液的體內H0抑制效力。通過直 接胃內（IG)注射向3日齡小鼠給藥載劑(VEH)或30ymol/kg BW的五種ZnPP制劑之一或僅給 藥VEH(圖5)。311后，將幼鼠處死并采集肝、脾和腦以用于測量H0抑制效力。H0活性按pmol C0/h/mg鮮重(FW)計算，然后表示為對照值的平均值土 SD %。
[0090] 為了評估毒性，對幼鼠進行類似處理，然后立即置于螢光管（2冷白/1藍TL52)下3 小時以測試光毒性，或置于黑暗中以測試化學毒性。然后監測幼鼠的整體存活最多1周。盡 管發現ΖηΡΡ-Ρ0 4在體外是最有效的（80%)(圖4)，但是其效力在IG給藥后顯著降低（圖6A)， 可能是由于其較差的胃通道(圖5)。正如所預料的，它沒有顯示光毒性或化學毒性（圖6B)。
[0091] ZnPP基于殼聚糖/海藻酸鹽的制劑在體內是有效的，但是由于殼聚糖/海藻酸鹽未 經FDA批準用于早產兒，因此并未對這些制劑的毒性進行進一步評估。ZnPP-Poly在肝和脾 中是最有效的（圖6A)，但它是光毒性的，從而在光暴露后48小時導致90%的死亡率（圖6B)， 這可能是由于所述聚合物本身，因為僅用Poly處理的幼鼠在光暴露和避光暴露后分別具有 100%和70%的死亡率。重要的是，我們觀察到，ZnPP-脂質制劑也是有效的，但沒有表現出 光-或化學毒性。因為所述ZnPP-脂質制劑在IG給藥后有效抑制肝H0活性且沒有毒性，我們 由此得出結論，它在用于治療新生兒黃疸中是最為有效的。
[0092]這些數據顯示，天然存在的ZnPP是有效的且能快速起效而不具有長效抑制作用， 使得其在旨在用于過渡期間治療新生兒的抗-高膽紅素血癥藥物中是高度有用的。將ZnPP 設計為口服生物可用的，同時保持這些療效和安全性的特點，這為兒科醫生在用它們對靶 向新生兒的膽紅素水平進行控制中提供了信心，所述新生兒具有溶血或其他造成膽紅素生 成增加的原因。
[0093] 實施例2
[0094] 制劑
[0095] ZnPP的一個缺點是它不是口服生物可用的且其需要胃腸外給藥。ZnPP的低口服生 物利用度是由于其低溶解性以及在低pH環境下化學不穩定，例如在胃中所見，以及在中性 pH的低水溶性，其限制了 ZnPP的溶解和隨后在腸道中的吸收。ZnPP在低pH水溶液中反應以 形成原卟啉IX游離酸，其無法抑制H0。
[0096]需要一種制劑，其通過保護所述分子避免與胃中所發現的酸性環境相互作用以及 提高其在中性pH的水溶性以促進小腸上部的吸收從而提高ZnPP的口服生物利用度和有效 性。理論上，所述制劑是粉末形式的固體狀態，用以提高最終藥物劑型的貯存期限及其可制 造性。
[0097]微粒是通過噴霧干燥形成的，所述噴霧干燥保證了在GMP環境下的直接擴增路徑， 所述GMP環境對于GMP制造最終劑型而言是必需的。
[0098]噴霧干燥粉末制劑;制劑成分：
[0099] ZnPP；20%w/w
[0100] DPPC；5%w/w
[0101] EUDRAGIT?L100-55;75%w/w
[0102] 用于噴霧干燥的1 %固體(w/v)原料溶液的制備:將ZnPP通過超聲溶解于1M氫氧化 銨中（構成總溶劑體積的12.5% )。加入溶于乙醇的DPPC(總溶劑體積的12.5% )。加入溶于 乙醇的EUDRA.GlT?L100-55(剩余的75%溶劑體積）。
[0103] Biichi-290噴霧干燥條件：
[0104]入 口溫度：70 Γ
[0105]出 口溫度：50Γ
[0106]吸氣器:75%
[0107] 氮:30mm測量儀高度
[0108] 栗：8%
[0109] 在該過程中將進樣溶液容器和噴霧干燥器避光。將所述干粉冷凍避光儲存。
[0110] 觀察該制劑，如圖7A所示:20 %的ZnPP含量通過LCMS證實。在0.1 N HC1介質中有明 顯受限的ZnPP釋放，洗滌并將酸暴露的顆粒重新混懸于PBS pH 7.4緩沖液中導致ZnPP的大 量釋放，其通過HPLC/MS測量。SEM圖像為含有75 % w/w EUDRAGIT?的噴霧干燥顆粒。褶 皺形態表明在顆粒形成過程中早期的聚合物沉淀，從而確保有效的藥物包封。
[0111]實施例3
[0112]具有更高ZnPP含量的噴霧干燥粉末的制備
[0113] 具有更低EUDRAGIT?含量的ZnPP制劑;制劑成分：
[0114] ZnPP；20%w/w
[0115] DPPC；42%w/w
[0116] EUDRAGIT? LI 00-55 ； 38%w/w
[0117] 用于噴霧干燥的1%固體(w/v)原料溶液的制備：將ZnPP用超聲溶于1M氫氧化銨 (構成總溶劑體積的12.5% )。加入溶于乙醇中的DPPC(總溶劑體積的50% )。加入溶于乙醇 中的EUDRAGrT?L100-55(剩余37.5 %溶劑體積）。噴霧干燥條件:與上文所述相同。
[0118] 觀察該制劑，如圖7B所示:20%的ZnPP含量通過LCMS證實。盡管在0.1N HC1介質中 有一些ZnPP釋放，但洗滌并將酸暴露的顆粒重新混懸于PBS pH 7.4緩沖液中導致ZnPP的大 量釋放，其通過HPLC/MS測量。SEM圖像顯示，這些38%w/wFJJDRAGrr?顆粒相比于之前 測定的制劑(75%w/w EUDRAGIT?)具有相似的形態。褶皺形態表明在顆粒形成過程中 早期的聚合物沉淀，從而確保有效的藥物包封。
[0119] 實施例4
[0120] 含有粉末的小瓶或注射器，其將被合適的稀釋劑重構以通過飼管口服遞送
[0121] 給嬰兒
[0122] 可將所需劑量的ZnPP包含在少量的噴霧干燥粉末中或者更少量的所述粉末中，這 取決于最終的ZnPP含量和目標受試者（例如新生小鼠或大鼠、猴或通過飼管給藥的患兒）。 噴霧干燥粉末通常尺寸小且往往比顆粒粉末更粘。可使用增量劑以摻合該噴霧干燥粉末以 幫助填充至小瓶中，然后在給藥至測試受試者(新生小鼠或大鼠、猴等)或通過飼管給藥的 患兒前用合適的稀釋劑再混懸。這個可通過下文所述實現。
[0123] 將ZnPP-DPPC-EUDRAGIT?噴霧干燥的粉末與作為增量劑的D-葡萄糖混合以 獲得含有目標量的噴霧干燥粉末的均一混合物，所述目標量是基于ZnPP含量的量和所需劑 量計算的，然后可用適當量的D-葡萄糖(范圍在10%-90%w/w的量)手動或用填充機將該粉 末摻合物填充至玻璃或塑料小瓶或注射器中。
[0124] 給藥前，通過將適當量的含有0.25% (w/v)檸檬酸鹽緩沖液的稀釋劑(pH4.7)加至 含有所需劑量的目標量的粉末中形成混懸液。該稀釋劑的pH是重要的，其使得該聚合物微 粒的溶解最小化，但pH不能過低而造成ZnPP的化學降解。將該混懸液攪拌并準備用于給藥。
[0125] 圖8A，在磷酸鈉溶液中給藥的ZnPP-P〇4顯示了原卟啉的沉淀。圖8B.給藥ZnPP噴霧 干燥的微粒后3小時。在所治療的3只3日齡小鼠幼鼠的兩只中，沉淀被完全抑制。
[0126] 實施例5
[0127] ZnPP 口服薄膜劑型
[0128] 所述ZnPP噴霧干燥粉末制劑可分散于含有膜形成聚合物的有機溶劑的溶液中。然 后將所述含有混懸的噴霧干燥粉末的聚合物溶液制成薄膜，然后將其切割成適當的尺寸部 分，各部分含有一個劑量。所述薄膜預期即刻溶于患兒口中而無需任何額外的液體。
[0129] 實施例6
[0130] ZnPP 速溶片
[0131] 可將所述ZnPP噴霧干燥粉末制劑混懸于含有0.25% (w/v)檸檬酸鹽緩沖液的稀釋 劑(pH 4.7)中，可向其中加入適當量的甘露醇。然后將該混懸液轉移到片劑大小的模具中， 然后將其在液氮流中冷凍。然后將該冷凍混懸液凍干并可將含有所得片劑的模具用保護罩 密封。凍干的片劑預期即刻溶于患兒口中而無需任何額外的液體。
[0132] 實施例7
[0133] ZnPP/殼聚糖微粒的制備
[0134] 制劑含量(w/w):椰子油(40 % )、卵磷脂(30 % )、ZnPP(5 % )、泊洛沙姆-188 (20 % ) 和殼聚糖(Mff-15000)(5%)
[0135] 制備過程:通過在室溫(RT)攪拌，將椰子油（40mg)和卵磷脂（30mg)溶于10mL乙醇 中。向該溶液中加入ZnPP(5mg)并加熱至40 °C同時攪拌，獲得澄清溶液。單獨地，將泊洛沙 姆-188(20mg)溶于8mL蒸餾水中并然后加至上述乙醇溶液中同時在室溫攪拌。將殼聚糖-15K (5mg)溶于lmL的0.01N鹽酸水溶液中并然后加至上述混合物溶液，同時在室溫攪拌。使 用旋轉蒸發器，將該溶劑在真空下從該均一溶液中除去。通過超聲處理20min，將該殘余物 用1 OmL水重構。將溶液冷凍并凍干以獲得最終的Zn-PP/殼聚糖微粒。
[0136] 實施例8
[0137] ZnPP/海藻酸鹽微粒的制備
[0138] 制劑含量(w/w):椰子油（35 % )、卵磷脂（20 % )、ZnPP(20 % )、泊洛沙姆-188(20 % ) 和海藻酸鈉(4.5%)氯化鈣(0.5%)
[0139] 制備過程:通過在室溫攪拌，將椰子油（35mg)和卵磷脂(20mg)溶于10mL乙醇中。向 該溶液中加入ZnPP (20mg)并加熱至40 °C同時攪拌，獲得澄清溶液。單獨地，將泊洛沙姆-188 (20mg)和海藻酸鈉(4.5mg)溶于8mL蒸餾水中并然后加至上述乙醇溶液中同時在室溫攪拌。 將氯化鈣(〇.5mg)溶于lmL水中，并然后加至上述混合物溶液中同時在室溫攪拌。使用旋轉 蒸發器，將該溶劑在真空下從該均一溶液中除去。通過超聲處理20min，將該殘余物用10mL 水重構。將溶液冷凍并凍干以獲得最終的ZnPP/海藻酸鹽微粒。
[0140] 實施例9
[0141] ZnPP/三偏磷酸鈉(STMP)微粒的制備
[0142] 制劑含量(w/w):椰子油（35% )、卵磷脂（20% )、ZnPP(20% )、泊洛沙姆-188(20% ) 和三偏磷酸鈉(STMP)(5%)
[0143] 制備過程:通過在室溫攪拌，將椰子油（35mg)和卵磷脂(20mg)溶于10mL乙醇中。向 該溶液中加入ZnPP (20mg)并加熱至40 °C同時攪拌，獲得澄清溶液。單獨地，將泊洛沙姆-188 (20mg)和STMP(5mg)溶于8mL蒸餾水中并然后加至上述乙醇溶液中同時在室溫攪拌。使用旋 轉蒸發器，將該溶劑在真空下從該均一溶液中除去。通過超聲處理20min，將該殘余物用 1 OmL水重構。將溶液冷凍并凍干以獲得最終的ZnPP/STMP微粒。
[0144] 實施例10
[0145] ZnPP微粒制劑的制備
[0146] 制劑含量(w/w) :DSPC(45% )、DPPC(45% )、ZnPP(10% )。
[0147] 制備過程:通過超聲處理，將ZnPP(lOmg)溶于lOmL的1M氫氧化銨溶液中。將溶于 45mL乙醇中的DPPC(45mg)加至其中。加入溶于45mL乙醇中的DSPC(45mg)并充分混合。使用 Buchi-290迷你噴霧干燥器將該溶液混合物噴霧干燥。該設定參數為:入口溫度55°C、出口 溫度50 °C、吸氣器75 %、進液栗8 %和氮氣流為30mm。所述進液容器和噴霧干燥隔間在該過 程中避光。將所述干粉避光冷凍儲存。
[0148] 實施例11
[0149] 在負載有血紅素的新生小鼠中，使用鋅原卟啉的微粒制劑對血紅素加氧酶
[0150] 活性的體內抑制
[0151] 血紅素加氧酶(H0)(血紅素降解中的限速酶)產生膽紅素。因為溶血可導致增加的 膽紅素生成并造成新生兒高膽紅素血癥，因此例如通過金屬卟啉(Mp)抑制H0可能是理想的 策略。鋅原卟啉(ZnPP)是一個有希望的Mp，因為它是天然存在的、有效的、無光毒性的且具 有最小限度的H0-1上調，但由于其無法口服吸收而限制了其使用。
[0152]我們設計了一種基于脂質的ZnPP制劑(ZL)，如實施例10所述且已顯示，其在新生 小鼠模型口服給藥后能有效且安全地抑制肝的H0活性。我們進一步拓展了這些研究以調查 ZL在負載有血紅素的新生小鼠（與溶血嬰兒類似的模型）中的有效性和安全性。所述ZL如實 施例10所述進行制備且以指定的濃度再混懸于PBS中。
[0153] 將3日齡FVB幼鼠通過SQ注射給藥30ymol/kg的血紅素(H)或載劑(V)。用血紅素治 療后24h，通過胃內注射向小鼠給藥V(H-V)或ZLa.S-eOymol/kgJ-ZLI.S-H-ZLeOhSh后， 將幼鼠處死并采集肝和腦用于通過氣相色譜測量H0活性。H0-1的上調是通過以下評估的： 分別通過RT-PCR和蛋白質免疫印跡(Western Blot)測定肝ΗΟ-lmRNA和蛋白水平。數據表示 為對照的％。
[0154]血紅素負載(H-V)后，肝H0活性顯著升高1.6倍，正如所預期的（表2)。這一血紅素 誘導的H0活性升高在用ZL治療后以劑量依賴的方式被抑制，該H0活性在30ymol/kg的劑量 時恢復到對照水平。在給藥30ym 〇l ZL/kg后，未發現顯著的腦H0活性的抑制或肝H〇-lmRNA 和蛋白質水平的變化。
[0155] 30ymol/kg劑量的ZL在血紅素負載后有效地抑制肝H0活性。此外，其并沒有表現出 跨血腦屏障或誘導ΗΟ-lmRNA或蛋白水平。我們總結出：ZL是有效且安全的并因此在用于治 療由于溶血造成的新生兒高膽紅素血癥中是有吸引力的化合物。
[0156] 表2-H0活性(對照的％，平均值土SD) … | 組 | Y-V H-V H-ZL1.8一 H-ZL3.8 H-ZL7.5 H-ZL.15 - H-ZL30-| H-ZL60
[0157] "?ρ 1〇?±14*^ l；64±28f^ 138±34t^ 1:22土nf 1忉±：1對^ 115±22f*. .105士 19* 91±1S*
[0158] ρ<0·05 VS fV-V或*H-V，n = 7-35/組
[0159] 等效替代
[0160] 本領域技術人員將理解，或使用不超過常規的試驗能夠確定，本文所述具體實施 方案和方法的許多等效替代。這種等效替代旨在包括在本發明的范圍內。
[0161] 本文所引用的所有專利、專利申請和參考文獻通過引用的方式清楚地并入本文 中。
【主權項】
1. 微粒，其包含： ZnPP和藥學上可接受的穩定劑，其中ZnPP的濃度為微粒重量的至少約5 %。2. 權利要求1的微粒，其中ZnPP在該微粒中的濃度為微粒重量的約5 %至約50 %。3. 權利要求1或2的微粒，其中相比于僅有ZnPP，所述微粒在酸性條件下具有增加的穩 定性。4. 權利要求3的微粒，其中相比于僅有ZnPP，所述微粒對酸性條件更加穩定至少10%。5. 權利要求3的微粒，其中所述微粒對酸性條件的穩定性是僅有ZnPP時的2倍。6. 權利要求1 _5中任一項的微粒，其中相比于僅有ZnPP，所述微粒在中性pH具有增加的 溶解性。7. 權利要求6的微粒，其中相比于僅有ZnPP，所述微粒在中性pH的溶解性大至少10 %。8. 權利要求6的微粒，其中所述微粒在中性pH的溶解性是僅有ZnPP時的至少2倍。9. 權利要求1-8中任一項的微粒，其中所述微粒基本上由ZnPP和藥學上可接受的穩定 劑組成。10. 權利要求1 -9中任一項的微粒，其中所述微粒具有約1 Onm至約1 Ομπι的直徑。11. 權利要求1 -9中任一項的微粒，其中所述微粒具有約1 OOnm至約5μπι的直徑。12. 權利要求1-11中任一項的微粒，其中所述穩定劑是海藻酸鹽、殼聚糖、卵磷脂、泊洛 沙姆、三偏磷酸鈉、陽離子脂質、蛋白質、油、聚乙烯吡咯烷酮或其組合。13. 權利要求1-11中任一項的微粒，其中所述穩定劑是陽離子脂質或陽離子脂質的混 合物。14. 權利要求13的微粒，其中所述陽離子脂質是DSPC、DPPC、DOIIM、DDAB、D0TMA、DMRIE、 EDMPC、DCCho 1、DOGS、MB0P，或其任意組合。15. 權利要求1-11中任一項的微粒，其中ZnPP的濃度為微粒重量的約10%至約25%，且 所述穩定劑是DSPC和DPPC的混合物。16. 權利要求15的微粒，其中DSPC與DPPC的重量比為約1:1。17. 權利要求1-11中任一項的微粒，其中所述穩定劑包括(i)卵磷脂，（ii)泊洛沙姆，和 (iii)海藻酸鹽、三偏磷酸鈉或殼聚糖。18. 權利要求17的微粒，其中ZnPP的濃度為微粒重量的約5 %至約25 %。19. 權利要求17或權利要求18的微粒，其中卵磷脂的濃度為微粒重量的約10 %至約 40%，且泊洛沙姆的濃度為微粒重量的約10%至約40%。20. 權利要求17-19中任一項的微粒，其中所述穩定劑還包括油。21. 權利要求17-20中任一項的微粒，其中所述穩定劑包括三偏磷酸鈉。22. 權利要求21的微粒，其中三偏磷酸鈉的濃度為微粒重量的約3 %至約6 %。23. 權利要求17-20中任一項的微粒，其中所述穩定劑包括海藻酸鹽。24. 權利要求22的微粒，其中海藻酸鹽的濃度為微粒重量的約3 %至約6 %。25. 權利要求17-20中任一項的微粒，其中所述穩定劑包括殼聚糖。26. 權利要求25的微粒，其中殼聚糖的濃度為微粒重量的約3 %至約6 %。27. 組合物，其包含權利要求1-26中任一項的多個微粒以及，任選地，藥學上可接受的 載體。28. 權利要求27的組合物，其以用于口服給藥的單位劑量。29. 權利要求27或權利要求28的組合物，其中將多個微粒混懸于藥學上可接受的載體 中。30. 在有此需要的受試者中抑制誘導型血紅素加氧酶(H0-1)的活性的方法，所述方法 包括： 向所述受試者給藥有效量的權利要求27-29中任一項的組合物。31. 權利要求30的方法，其中所述給藥為□服給藥。32. 權利要求30或權利要求31的方法，其中所述受試者是患有高膽紅素血癥的人類嬰 兒。33. 權利要求30-32中任一項的方法，其中誘導型HO-1的活性相比于在對照受試者中誘 導型HO-1的活性被抑制，或者誘導型HO-1的活性相比于給藥所述微粒前誘導型HO-1的活性 被抑制。
【文檔編號】A61K33/30GK106061487SQ201580012237
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月2日 公開號201580012237.4, CN 106061487 A, CN 106061487A, CN 201580012237, CN-A-106061487, CN106061487 A, CN106061487A, CN201580012237, CN201580012237.4, PCT/2015/14079, PCT/US/15/014079, PCT/US/15/14079, PCT/US/2015/014079, PCT/US/2015/14079, PCT/US15/014079, PCT/US15/14079, PCT/US15014079, PCT/US1514079, PCT/US2015/014079, PCT/US2015/14079, PCT/US2015014079, PCT/US201514079
【發明人】D.K.史蒂文森, J.拉賈達斯, C.埃斯帕達斯, R.J.黃, D.萊丘加
【申請人】里蘭斯坦福初級大學理事會, D.K.史蒂文森, J.拉賈達斯, C.埃斯帕達斯, R.J.黃, D.萊丘加