一種自組裝納米止血劑、其制備方法及應用
【專利摘要】本發明公開了一種自組裝納米止血劑、其制備方法及應用，該納米止血劑由親水性陽離子聚合物和含羧基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的質量比為1：0.1～1：5，所述納米止血劑的粒徑為20nm～800nm。制備時，將親水性陽離子聚合物溶于強極性溶劑中，含羧基的疏水化合物溶于與水互溶的有機溶劑中，然后將溶有羧基化合物的有機溶液在超聲作用下緩慢加入聚合物溶液中，將混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析去除有機溶劑。本納米止血劑既可以通過滴于或涂抹于組織局部止血，也可以通過注射預防出血。該納米止血劑合成簡單，價格低廉，自組裝法簡單易行，有機溶劑容易去除，穩定性較好、無免疫原性。
【專利說明】
一種自組裝納米止血劑、其制備方法及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及納米止血材料領域，具體是一種自組裝納米止血劑、該止血劑的制備 方法及其在防治機體出血中的應用。
【背景技術】
[0002] 在外傷和臨床手術中，機體的大量出血是造成死亡的主要因素之一。血液凝集是 創傷后傷口愈合的第一步。在損傷不嚴重情況下，如一些小血管的破壞會刺激機體產生生 理性止血。但如果是較為嚴重的機體損傷，就必須采取一系列措施以達到快速、有效的止 血。目前臨床手術和外傷處理中普遍應用的止血方法主要包括化學止血法、熱止血法和機 械止血法。
[0003] 化學法主要通過化學試劑改變血液的凝血活性，例如血管收縮劑(血栓素 A2)可以 導致血管收縮，減少血液流動，從而促進凝血。熱凝止血法包括灼燒止血和激光止血。機械 止血法主要是通過按壓、結扎以及使用繃帶止血。目前多采用化學和機械方法聯合止血，常 用纖維蛋白原、凝血酶和鈣離子形成纖維蛋白膠作為血小板替代物。盡管如此，該方法仍受 到很多限制，例如有些試劑是固體的，不能到達創口起到止血的效果;一些液體止血劑(如 氰丙烯酸鹽類)需要在干燥的環境中才能發揮止血作用；而部分止血材料易產生免疫原性 或移植物抗宿主病，從而對機體造成二次傷害，或是本身存活時間短，需要臨用現配。
[0004] 為了克服上述問題，近年來逐步發展了一些新型止血技術，包括使用功能性脂質 體、嵌段共聚物、合成血小板和納米材料等。其中，納米止血劑因其良好的止血效果和使用 的靈活多樣性，具有較大的臨床應用價值，備受研究人員的關注。比如一些多肽自組裝的納 米纖維，可以形成類似細胞外基質的屏障，同時分解成天然的氨基酸，從而促進傷口的恢 復，提高了止血效率。并且有研究表明碳納米粒以及Clottocytes納米粒可以激活血小板， 減少機體出血時間。聚(乳酸-乙醇酸)和聚賴氨酸的嵌段共聚物(PLGA-PLL)，通過在其中引 入的聚乙二醇(PEG)的遠端鍵合RGD短肽，由其自組裝形成納米粒，該類納米粒可以激活血 小板從而促進凝血，故被稱之為"人造血小板"。R⑶和血小板受體糖蛋白Π b-ma以及整聯 素 ανβ3結合，激活血小板從而促進血小板凝集。
[0005] 盡管上述有關納米止血劑的研究取得了一定的進展，但是通過納米粒止血仍然受 到很多限制，諸如在體循環時間短、本身具有納米毒性、對機體造成不可逆的損傷、使血栓 相關疾病的風險增加等。另外目前研究的止血劑尚存在儲存穩定性差、合成工藝復雜、制備 成本高等問題。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種自組裝納米止血劑的組成、制備方法，同時還驗證該納 米止血劑在不同出血模型中的作用。
[0007] 本發明通過親水性陽離子聚合物和含羧基的疏水化合物間的多重非共價鍵力(包 括靜電作用、氫鍵作用及疏水作用)介導的自組裝來構建新型納米止血劑，通過促進小血管 的收縮，促進血小板凝集和凝血系統的啟動，與血紅細胞中鐵離子結合形成凝塊減少機體 出血時間。并且由于該納米粒表面帶有正電荷，其可以與血液中帶有負電荷的白細胞、紅細 胞及血小板等物質相互作用、結合、形成凝血栓，最終發揮其止血效應，極大地提高了止血 效率。相對于其他止血劑，本發明通過自組裝制備的納米止血劑具有諸多優勢，因而有較廣 闊的應用前景。
[0008] 鑒于此，本發明采用的技術方案如下：一種自組裝納米止血劑由親水性陽離子聚 合物和含羧基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的 質量比在1 :〇· 1至1:5之間，所述納米止血劑的粒徑在20nm至800nm之間。其中親水性陽離子 聚合物選自聚乙烯亞胺(包括支化聚乙烯亞胺和線性聚乙烯亞胺）、聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽 和聚（L-精氨酸）鹽酸鹽，分子量在500Da至50000Da之間；含羧基的疏水化合物選自膽酸 (Cholic acid)、熊去氧膽酸(Ursodeoxycholic acid)、鶴去氧膽酸（Chenodeoxycholic acid)、豬去氧膽酸（Hyodeoxycholic acid)、石膽酸（Lithocholic acid)、脫氧膽酸 (Deodeoxycholic acid)、去氛膽酸(Dehydrocholic acid)、布洛芬（Ibuprofen)、酬洛芬 (Ketoprofen)、非諾洛芬(Fenoprofen)、氣比洛芬(Flurbiprofen)、奧沙普秦(Oxaprozin)、 萘普生(Naproxen)、吲噪美辛（Indomethacin)、舒林酸（Sulindac)、依托度酸(Etodolac)、 甲滅酸（Mefenamic acid)、甲氯芬那酸（Meclofenamic acid)、氣芬那酸（Flufenamic acid)、托滅酸(Tolfenamic acid)、羅美昔布(Lumiracoxib)、利克飛龍(Licofelone)、二氣 尼柳（Diflunisal)、阿司匹林（Aspirin)、吉非貝齊（Gemfibrozil )、環丙沙星 (Ciprof Ioxacin)、諾氣沙星(Norf Ioxacin)及氧氣沙星(Of Ioxacin)。
[0009] 本發明還提供一種自組裝納米止血劑的制備方法，包括以下步驟:首先將親水性 陽離子聚合物溶于一定量的強極性溶劑中，得到聚合物溶液，將含羧基的疏水化合物溶于 水溶性有機溶劑中，然后將溶有含羧基的疏水化合物的有機溶液在超聲作用下緩慢加入聚 合物溶液中，之后將上述混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析去除有機溶 劑，即可得到自組裝納米止血劑。
[0010] 其中，上述強極性溶劑選自去離子水、二甲基亞砜、N，N_二甲基甲酰胺、N，N_二甲 基乙酰胺。水溶性有機溶劑選自丙酮、乙腈、乙醇、二甲基亞砜、N，N_二甲基甲酰胺、N，N_二 甲基乙酰胺、醋酸。
[0011] 以上聚合物溶液的濃度在lmg/mL至100mg/mL之間，含羧基的疏水化合物的有機溶 液的濃度在lmg/mL至100mg/mL之間。
[0012] 本發明進一步提供了自組裝納米止血劑的應用，包括將所述納米止血劑外用于組 織局部(包括噴灑、涂抹或外敷于組織局部），或將納米止血劑用于靜脈注射，達到止血或預 防出血的目的。
[0013]本發明具有以下的優點：
[0014] 1)本發明所使用的親水性陽離子聚合物均有商品化產品，其合成簡單，價格相對 低廉，故易于實現相應制劑的產業化。
[0015] 2)本發明采用的自組裝法簡單易行，且使用的有機溶劑容易去除，保證了最終納 米止血劑應用的可行性和安全性。
[0016] 3)本發明所制備的納米止血劑的粒徑大小可以通過制備工藝參數來調控。
[0017] 4)本發明所制備的納米止血劑為液體，使用靈活方便。
[0018] 5)本發明所制備的納米止血劑的穩定性較好、無免疫原性，保證了體內安全性。
[0019] 6)本發明所制備的納米止血劑既可以局部涂抹使用，也可以靜脈注射使用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸通過自組裝制備得到的 質量比在1:1至1:4之間的納米粒的透射電鏡圖。
[0021] 圖2為空白對照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血劑)促進血小板凝集的相 差顯微鏡圖，其中標尺為l〇ym。
[0022] 圖3為空白對照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血劑)促進血小板凝集的共 聚焦圖，其中標尺為5μηι。
[0023] 圖4為大鼠股動脈靜脈注射Α(0.9%生理鹽水）、B(Cy5標記熊去氧膽酸/聚乙烯亞 胺納米粒，不做處理的一段股動脈)和C(Cy5標記熊去氧膽酸/聚乙烯亞胺納米粒，局部刺破 的一段股動脈)溶液后，活體成像觀察血液凝集情況。
[0024]圖5為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸以1:1至1:4的質量比制 備的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股動脈、肝臟以及靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血 時間的影響。
[0025]圖6為不同濃度（1、2及4mg/mL)的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股動脈、肝臟以及 靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血時間的影響。
[0026] 圖7為不同聚乙烯亞胺（分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺PEI1800和分子量為 1000 ODa的線性聚乙烯亞胺PEI10000)和熊去氧膽酸制備的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股 動脈、肝臟以及靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血時間的影響。
【具體實施方式】
[0027]下面結合【具體實施方式】對本發明的
【發明內容】
作進一步的詳細描述。應理解，本發 明的實施例只用于說明本發明而非限制本發明，在不脫離本發明技術思想的情況下，根據 本領域普通技術知識和慣用手段，做出的各種替換和變更，均應包括在本發明的范圍內。
[0028] 下面結合非限定性的實施例對本發明做詳細說明。在自組裝過程中，可以控制納 米止血劑的粒徑在20nm至800nm之間。
[0029] 實施例1
[0030] 將5mg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于5mL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為lmg/mL;將25mg熊去氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中熊去氧膽酸的濃度為25mg/mL; 超聲波作用下，將ImL熊去氧膽酸的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截 留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換 去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑 在200~500nm之間。
[0031] 實施例2
[0032] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將Img膽酸溶于ImL乙腈中，其中膽酸的濃度為lmg/mL;超聲波作用下，將 ImL膽酸的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為7000Da的透 析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收集透 析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在200_400nm之間。 [0033] 實施例3
[0034] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基甲酰胺中，聚合 物溶液的濃度為10mg/mL;將2mg鵝去氧膽酸溶于ImL乙醇中，其中鵝去氧膽酸的濃度為2mg/ mL;超聲波作用下，將ImL鵝去氧膽酸的乙醇溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為1000 ODa的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的 粒徑在150-300nm之間。
[0035] 實施例4
[0036] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，聚合 物溶液的濃度為10mg/mL;將5mg豬去氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中豬去氧膽酸的濃度 為5mg/mL;超聲波作用下，將ImL豬去氧膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將 上述混合液置于截留分子量為SOOODa的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20 tC，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液， 納米止血劑的粒徑在100-300nm之間。
[0037] 實施例5
[0038] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，聚合物 溶液的濃度為IOmg/mL;將IOmg石膽酸溶于ImL N，N-二甲基甲酰胺中，其中石膽酸的濃度為 10mg/mL;超聲波作用下，將ImL石膽酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液緩慢加入聚合物溶液中；將 上述混合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20 tC，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液， 納米止血劑的粒徑在100-200nm之間。
[0039] 實施例6
[0040] 將IOmg分子量為SOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg脫氧膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中脫氧膽酸的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL脫氧膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在200-300nm之間。
[0041 ] 實施例7
[0042] 將IOmg分子量為500Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將30mg去氫膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中去氫膽酸的濃度為30mg/mL;超 聲波作用下，將ImL去氫膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在150-250nm之間。
[0043] 實施例8
[0044] 將IOmg分子量為2500Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為lOmg/mL;將20mg布洛芬溶于ImL丙酮中，其中布洛芬的濃度為20mg/mL;超聲波作用下， 將ImL布洛芬的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為3500Da 的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收 集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在200-300nm之間。 [0045] 實施例9
[0046] 將IOmg分子量為5000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg酮洛芬溶于ImL乙腈中，其中酮洛芬的濃度為20mg/mL;超聲波作用下， 將ImL酮洛芬的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為3500Da 的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收 集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在100-200nm之 間。O
[0047] 實施例10
[0048] 將20mg分子量為5000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將60mg非諾洛芬溶于ImL二甲基亞砜中，其中非諾洛芬的濃度為60mg/mL;超 聲波作用下，將ImL非諾洛芬的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在200-350nm之間。
[0049] 實施例11
[0050] 將20mg分子量為20000Da的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將IOOmg氟比洛芬溶于ImL二甲基亞砜中，其中氟比洛芬的濃度為100mg/mL; 超聲波作用下，將ImL氟比洛芬的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的 粒徑在300-450nm之間。
[0051 ] 實施例12
[0052] 將20mg分子量為1000 ODa的線性聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為20mg/mL;將80mg奧沙普秦溶于ImL二甲基亞砜中，其中奧沙普秦的濃度為80mg/mL;超 聲波作用下，將ImL奧沙普秦的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在300-480nm之間。
[0053] 實施例13
[0054] 將50mg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為50mg/mL;將50mg萘普生溶于ImL二甲基亞砜中，其中萘普生的濃度為50mg/mL;超聲波 作用下，將ImL萘普生的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分 子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離 子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在 100-200nm之間。
[0055] 實施例14
[0056] 將80mg分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為80mg/mL;將40mg吲哚美辛溶于ImL N，N-二甲基乙酰胺中，其中吲哚美辛的濃度為 40mg/mL;超聲波作用下，將ImL吲哚美辛的N，N-二甲基乙酰胺溶液緩慢加入聚合物溶液中； 將上述混合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度 20°C，每隔30min更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶 液，納米止血劑的粒徑在150-250nm之間。
[0057] 實施例15
[0058] 將IOOmg分子量為50000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的 濃度為l〇〇mg/mL;將IOOmg舒林酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中舒林酸的濃度為100mg/mL;超 聲波作用下，將ImL舒林酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截 留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換 去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑 在 100-200nm之間。
[0059] 實施例16
[0060] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為lOmg/mL;將30mg依托度酸溶于ImL丙酮中，其中依托度酸的濃度為30mg/mL;超聲波 作用下，將ImL依托度酸的丙酮溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量 為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在150-250nm之間。
[0061 ] 實施例17
[0062] 將IOmg分子量為ISOODa的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將25mg甲滅酸溶于ImL乙腈中，其中甲滅酸的濃度為25mg/mL;超聲波作用 下，將ImL甲滅酸的乙腈溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在150-250nm之間。
[0063] 實施例18
[0064] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將25mg甲氯芬那酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中甲氯芬那酸的濃度為25mg/ mL;超聲波作用下，將ImL甲氯芬那酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混 合液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在140_200nm之間。
[0065] 實施例19
[0066] 將IOmg分子量為2000Da的聚（L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將20mg氟芬那酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中氟芬那酸的濃度為20mg/ mL;超聲波作用下，將ImL氟芬那酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在170_230nm之間。
[0067] 實施例20
[0068] 將IOmg分子量為5000Da的聚（L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將I Omg托滅酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中托滅酸的濃度為I Omg/mL; 超聲波作用下，將ImL托滅酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在200-400nm之間。
[0069] 實施例21
[0070] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶 液的濃度為10mg/mL;將15mg羅美昔布溶于ImL二甲基亞砜中，其中羅美昔布的濃度為15mg/ mL;超聲波作用下，將ImL羅美昔布的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在180_230nm之間。
[0071] 實施例22
[0072] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為10mg/mL;將15mg利克飛龍溶于ImL二甲基亞砜中，其中利克飛龍的濃度為15mg/ mL;超聲波作用下，將ImL利克飛龍的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在230-300nm之間。
[0073] 實施例23
[0074] 將20mg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為20mg/mL;將20mg二氟尼柳溶于ImL二甲基亞砜中，其中二氟尼柳的濃度為20mg/ mL;超聲波作用下，將ImL二氟尼柳的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在300_400nm之間。
[0075] 實施例24
[0076] 將IOmg分子量為15000Da的聚(L-精氨酸)鹽酸鹽溶于ImL去離子水中，聚合物溶液 的濃度為10mg/mL;將50mg阿司匹林溶于ImL二甲基亞砜中，其中阿司匹林的濃度為50mg/ mL;超聲波作用下，將ImL阿司匹林的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合 液置于截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔 30min更換去離子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止 血劑的粒徑在200_300nm之間。
[0077] 實施例25
[0078] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL ;將20mg吉非貝齊溶于ImL二甲基亞砜中，其中吉非貝齊的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL吉非貝齊的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在180-220nm之間。
[0079] 實施例26
[0080] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為I Omg/mL;將I Omg環丙沙星溶于ImL醋酸中，其中環丙沙星的濃度為I Omg/mL;超聲波作 用下，將ImL環丙沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在180-250nm之間。
[0081 ] 實施例27
[0082] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為I Omg/mL;將15mg諾氟沙星溶于ImL醋酸中，其中諾氟沙星的濃度為15mg/mL;超聲波作 用下，將ImL諾氟沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在200-260nm之間。
[0083] 實施例28
[0084] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg氧氟沙星溶于ImL醋酸中，其中氧氟沙星的濃度為20mg/mL;超聲波作 用下，將ImL氧氟沙星的醋酸溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分子量為 7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離子水； 24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在180-160nm之間。
[0085] 實施例29
[0086] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL二甲基亞砜中，聚合物溶液的 濃度為10mg/mL;將15mg吲哚美辛溶于ImL二甲基亞砜中，其中吲哚美辛的濃度為15mg/mL; 超聲波作用下，將ImL吲哚美辛的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置 于截留分子量為3500Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min 更換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的 粒徑在20-60nm之間。
[0087] 實施例30
[0088] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將20mg去氫膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中去氫膽酸的濃度為20mg/mL;超 聲波作用下，將ImL去氫膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于 截留分子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更 換去離子水;24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒 徑在500-600nm之間。
[0089] 實施例31
[0090] 將IOmg分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺溶于ImL去離子水中，聚合物溶液的濃 度為10mg/mL;將30mg石膽酸溶于ImL二甲基亞砜中，其中石膽酸的濃度為30mg/mL;超聲波 作用下，將ImL石膽酸的二甲基亞砜溶液緩慢加入聚合物溶液中；將上述混合液置于截留分 子量為7000Da的透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透析，溫度20°C，每隔30min更換去離 子水；24h后收集透析液即可得到含有自組裝納米止血劑的水溶液，納米止血劑的粒徑在 700-800nm之間。
[0091 ]按照以上方法制備的納米止血劑中納米粒的透射電鏡圖如圖1所示。
[0092]圖2為空白對照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血劑)促進血小板凝集的相 差顯微鏡圖，其中標尺為IOymt3Sprague-Dawley雄性大鼠（230-250g)麻醉后取血，室溫下 1000 rpm離心10min，取上清可獲得富血小板血漿(PRP)，取IOOyL PRP置96孔板內，加入IOyL 熊去氧膽酸(UDCA)和分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺自組裝（質量比為2:1)納米粒溶 液作為凝血前刺激（圖2實驗組)或加入生理鹽水作為空白對照（圖2空白對照組）。樣品加入 同等體積的2%戊二醛固定lh，室溫下孵育IOmin后于相差顯微鏡下觀察血小板的聚集狀態 (圖 2)。
[0093]圖3為空白對照組(0.9%生理鹽水)和治療組（納米止血劑)促進血小板凝集的共 聚焦圖，其中標尺為5μπι。精密量取ImL 20mg/mL的枝化聚乙烯亞胺PEI(MW = 25000)的DMSO 溶液，加入ImL 2.36mg/mL Cy5NHS ester的DMSO溶液，于40°C避光反應12h，即得PEI-Cy5溶 液。然后，吸取PEI-Cy5溶液ImL與ImL的20mg/mL UDCA的DMSO溶液混合，置于分子量3500的 透析袋中，純水透析24h，即得Cy5標記的納米粒。取500yL的PRP加入3mL的THB (臺式液），用 50yL CD61/FITC標記，室溫下共孵育40min后，1600g離心5min，用1.5mL PPP稀釋即得重建 血小板。取150yL重建血小板加入15yL Cy5修飾的PEI/UDCA(10:20)納米粒溶液或15yL THB 作為空白對照后加15yL甲醛固定;共聚焦觀察血小板的聚集狀態（圖3)。
[0094]圖4為大鼠股動脈靜脈注射A(0.9%生理鹽水）、B(Cy5標記熊去氧膽酸/聚乙烯亞 胺納米粒，不做處理的一段股動脈)和C(Cy5標記熊去氧膽酸/聚乙烯亞胺納米粒，局部刺破 的一段股動脈)溶液后，活體成像觀察血液凝集情況。Sprague-Dawley雄性大鼠（230-250g) 麻醉后，尾靜脈注射〇. 5mL Cy5-PEI-UDCA納米粒或生理鹽水，5min之后暴露出大鼠股動脈， 用0.45_的針頭刺穿股動脈，待止血后，剪下股動脈觀察熒光分布。
[0095]圖5為分子量為25000Da的枝化聚乙烯亞胺和熊去氧膽酸以1:1至1:4的質量比制 備的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股動脈、肝臟以及靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血 時間的影響。
[0096]圖6為不同濃度（1、2及4mg/mL)的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股動脈、肝臟以及 靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血時間的影響。
[0097] 圖7為不同聚乙烯亞胺（分子量為1800Da的枝化聚乙烯亞胺PEI1800和分子量為 1000 ODa的線性聚乙烯亞胺PEI10000)和熊去氧膽酸制備的納米止血劑對小鼠尾部、大鼠股 動脈、肝臟以及靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血時間的影響。
[0098]圖5-7中所述不同出血模型的建立和評價方法如下：
[0099] 1)小鼠尾部出血模型及評價
[0100] 20~25g C57BL小鼠，麻醉后，用利剪在麻醉小鼠尾尖0.5cm處橫向切斷，當血液自 動流出第一滴后用濾紙吸去，將小鼠尾尖分別置于生理鹽水、PEI25000、PEI1800、PEI10000 水溶液和不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量 的聚乙烯亞胺(bPEI 1800和bPEI 10000)納米粒懸液，小鼠尾部與納米粒混懸液充分接觸后， 取出并開始計時，每隔15秒用濾紙吸去血液，直至完全停止流血，記錄出血時間。
[0101] 2)大鼠股動脈出血模型及評價
[0102]取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，使后肢展開暴露出大腿內側，切開皮 膚，切開上覆肌肉，暴露出股動脈和坐骨神經，股動脈損傷產生高壓使老鼠大量出血，股動 脈損傷后分別在動脈損傷處加入生理鹽水、PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比 例（10:10、10: 20、10: 30和10:40)，不同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺 (bPE 11800、bPE 110000)納米粒懸液300yL，記錄出血時間。
[0103] 3)肝臟出血模型及評價
[0104] 取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，用手術刀切開腹部后暴露出肝臟，并 從喙尾方向在肝臟中葉橫向切開，使肝臟形成一個約4_的創口，在肝臟損傷處分別加入生 理鹽水、PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不 同濃度（1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺(bPEI1800和bPEIlOOOO)納米粒混懸液 300yL，記錄出血時間。
[0105] 4)靜脈注射納米止血劑后股動脈的出血
[0106] 取250~300g Sprague-Dawley大鼠，麻醉后，尾靜脈注射0 · 5mL生理鹽水， PEI25000、PEI1800和PEI10000水溶液，不同比例（10:10、10:20、10:30和10:40)，不同濃度 (1、2和4mg/mL)與不同分子量的聚乙烯亞胺(bPEI1800和bPEIlOOOO)納米粒混懸液。5min之 后暴露出大鼠股動脈，用〇.45_的針頭刺穿股動脈，記錄出血時間。
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【主權項】
1. 一種自組裝納米止血劑，其特征是:所述納米止血劑由親水性陽離子聚合物和含羧 基的疏水化合物組成，其中所述親水性陽離子聚合物與含羧基的疏水化合物的質量比在1: O· 1至1:5之間，所述納米止血劑的粒徑在20nm至800nm之間。2. 根據權利要求1所述一種自組裝納米止血劑，其特征是:所述親水性陽離子聚合物選 自枝化或線性聚乙烯亞胺、聚(L-賴氨酸)氫溴酸鹽和聚(L-精氨酸)鹽酸鹽，所述親水性陽 離子聚合物的分子量在500Da至50000Da之間。3. 根據權利要求1所述一種自組裝納米止血劑，其特征是:所述含羧基的疏水化合物選 自膽酸、熊去氧膽酸、鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸、石膽酸、脫氧膽酸、去氫膽酸、布洛芬、酮洛 芬、非諾洛芬、氟比洛芬、奧沙普秦、萘普生、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、甲滅酸、甲氯芬那 酸、氟芬那酸、托滅酸、羅美昔布、利克飛龍、二氟尼柳、阿司匹林、吉非貝齊、環丙沙星、諾氟 沙星及氧氟沙星。4. 權利要求1到3任一項所述自組裝納米止血劑的制備方法，其特征是，包括以下步驟： 首先將親水性陽離子聚合物溶于一定量的強極性溶劑中，得到聚合物溶液，將含羧基的疏 水化合物溶于水溶性有機溶劑中，然后將溶有含羧基的疏水化合物的有機溶液在超聲作用 下緩慢加入聚合物溶液中，之后將上述混合液置于透析袋中，磁力攪拌下在去離子水中透 析去除有機溶劑，即可得到自組裝納米止血劑。5. 根據權利要求4所述自組裝納米止血劑的制備方法，其特征是:所述強極性溶劑選自 去離子水、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺。6. 根據權利要求4所述自組裝納米止血劑的制備方法，其特征是:所述水溶性有機溶劑 選自丙酮、乙腈、乙醇、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、醋酸。7. 根據權利要求4所述自組裝納米止血劑的制備方法，其特征是:所述聚合物溶液的濃 度在lmg/mL至IOOmg/mL之間，所述含羧基的疏水化合物的有機溶液的濃度在lmg/mL至 100mg/mL之間。8. 權利要求1到3任一項所述自組裝納米止血劑的應用，其特征是:將所述納米止血劑 外用于組織局部，或將納米止血劑用于靜脈注射。9. 根據權利要求8所述自組裝納米止血劑的應用，其特征是:所述外用包括噴灑、涂抹 或外敷。
【文檔編號】A61K31/421GK105943497SQ201610316487
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】張建祥, 成娟, 張相軍, 周興
【申請人】中國人民解放軍第三軍醫大學