高密度脂蛋白樣肽磷脂支架（“hpps”）納米顆粒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了高密度脂蛋白樣肽磷脂支架(“HPPS”)納米顆粒。本發明提供了一種非天然存在的高密度脂蛋白樣肽?磷脂支架(“HPPS”)納米顆粒。更具體地，本發明提供了一種非天然存在的肽?脂質納米支架，包括：(a)至少一種磷脂；(b)至少一種不飽和脂質，優選不飽和固醇酯，進一步優選不飽和膽固醇酯，進一步優選膽固醇油酸酯；以及(c)至少一種肽，所述肽包括能夠形成至少一個兩親性α?螺旋的氨基酸序列；其中使成分a)、b)和c)結合以形成肽?磷脂納米支架。本發明還提供了一種包括HPPS納米顆粒的藥物劑型以及制備HPPS納米顆粒的方法。
【專利說明】高密度脂蛋白樣肽磷脂支架（"HPPS"）納米顆粒
[00011 本申請是申請日為2008年12月12日，申請號為200880126584.X，發明名稱為"高密 度脂蛋白樣肽磷脂支架（"HPPS"）納米顆粒"的發明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及一種基于肽穩定化超小納米顆粒的藥物遞送系統，該藥物遞送系統允 許用于檢測和治療(處理)癌癥和其他疾病的活性劑的靶向遞送。所述活性劑可以位于納米 平臺的核心或表面，而細胞表面受體配體附著于所述納米平臺的表面。
【背景技術】
[0003] 納米平臺
[0004] 納米平臺是納米級(納米尺度)結構，該結構被設計為一般平臺以形成不同組的多 功能診斷和治療裝置。這樣的納米級裝置通常具有小于l〇〇nm的尺寸，由此大小與其他生物 實體相當。它們小于人類細胞(人類細胞的直徑為10,000到20,00011111)和細胞器，并且大小 類似于較大的生物大分子，如酶和受體。血紅素(血紅蛋白）的直徑，例如為大約5nm，而圍繞 細胞的脂質雙層為大約6nm厚。小于50nm的納米級裝置可以容易地進入大多數細胞，而那些 小于20nm的納米級裝置可以運送出血管（NIH/NCI Cancer Nanotechnology.NZH Publication No 04-5489(2004))。結果，納米裝置可以經常以不改變那些分子的行為和生 物化學性質的方式在細胞表面上和細胞內部與生物分子容易地相互作用。因此，納米裝置 提供了通過其觀察和操縱基礎生物途徑和過程的完整地獨特優勢。迄今為止報道的大多數 多功能納米平臺由合成的納米結構制成，如樹枝狀高分子(樹形化合物）（球狀，支化聚合 物）（Quintana，A.et al.Journal of the American Chemical Society.2003 125(26): 7860-5)、聚合（Xu, H ·，Aylott，J.W.&Kopelman，R.Analyst.2002 Nov;127(ll): 147卜7， Pan,D. ,Turner, J. L.&ffooley,K. L. Chemical Communications，2400-2401 (2003))和陶瓷 (Kasili,Ρ.Μ.,Journal of the American Chemical Society.2004 126(9):2799-806, Ruoslahti，E· Cancer Cell · 2002;2(2):97-8)納米顆粒、全氣化碳乳劑(Anderson，S·A. et al.，Magnetic Resonance in Medicine.2000Sep;44(3) :433-9)和交聯脂質體（Hood, J.D.et al.,Science.2002；296(5577):2404-7,Li,L.et al., International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics.2004 15；58(4):1215-27)〇
[0005] 在這些合成納米平臺設計中的一個常見問題是生物相容性問題，其與短期和長期 毒性密切相關。天然納米結構可以為該生物相容性問題提供一種解決方案。然而，由天然存 在的納米結構制成的納米平臺是稀少的。
[0006] 對于理想的納米平臺的一些特征如下：1)均一的尺寸分布(<100nm);2)較大的有 效載荷;3)對于高結合親和力的多效價;4)經由模塊性和多功能性的平臺技術;5)穩定和長 期的循環時間；以及6)生物相容的、生物可降解的和無毒的。雖然一些現有的合成納米平臺 符合這些標準中的一些，但是這些納米平臺設計中的一個常見問題是生物相容性問題，其 與短期和長期毒性密切相關。天然納米結構可以為生物相容性問題提供一種解決方案。然 而，由天然存在的納米結構制成的納米平臺是少見的。在一個實例中，來自5工豆花葉病毒和 獸棚病毒的空RNA病毒膠囊用作潛在的納米裝置(Raja K.S.et al.，Biomacromolecules 2003;4(3):472-6)。前提是裝配入功能性病毒膠囊的60個拷貝的外殼蛋白提供了寬范圍的 化學功能性，其可以用于將歸巢(尋革E，homing)分子-如單克隆抗體或癌細胞-特異性受體 拮抗劑和報道分子-如磁共振成像(MRI)對比劑(造影劑)附著至膠囊表面，并且用于將治療 劑加載到膠囊內。不幸的是，即使人體對植物來源的病毒具有相當的容忍性;與這些納米裝 置相關的免疫結果還是不期望的。
[0007] 在另一實例中，脂蛋白納米平臺用于活性劑的靶向遞送(PCT申請公開號W0 2006/ 073419(【公開日】：2006年7月13日））。
[0008] 靶向遞送
[0009] 雖然特定病理的結果在整個受折磨的人的身體中經常是明顯的，但是通常，潛在 的病理學可以僅影響單一器官或組織。然而，少見的是，藥物或其它治療將僅靶向患病的器 官或組織。更常見地，治療導致不期望的副作用，例如，由于遍及患者身體的廣泛的毒性作 用。期望的是選擇性靶向器官或組織，例如，用于與靶器官或組織相關的疾病的治療。還期 望的是選擇性靶向身體內相對正常組織的癌組織。
[0010] 大多數治療物質通過循環被遞送至靶器官或組織。襯在血管的內表面的內皮是在 靶器官或組織中循環治療物質所遇到的第一細胞類型。這些細胞提供了用于將治療選擇性 引導至器官或組織的靶標。
[0011] 內皮在不同組織中可以具有不同的形態和生物化學標記物。淋巴系統的血管，例 如，表達各種粘附蛋白，其用于指導淋巴細胞歸巢。例如，存在于淋巴結中的內皮細胞表達 作為用于L-選擇蛋白的配體的細胞表面標記物，而集合淋巴小結小靜脈中的內皮細胞表達 用于 〇4扮整聯蛋白的配體。這些配體涉及特定淋巴細胞歸巢到它們各自的淋巴器官。因此， 將藥物連接到L-選擇蛋白或連接到α 4β7整聯蛋白可以提供用于將所述藥物分別靶向到患病 的淋巴結或集合淋巴小結的方式，只要這些分子不結合到在顯著數量的其他器官或組織中 存在的類似配體。淋巴細胞循環的一些觀察表明存在器官和組織特異性內皮標記物。類似 地，特定類型的腫瘤細胞歸巢或轉移到特定器官或組織進一步表明存在器官和組織特異性 標記物。
[0012] 需要靶向遞送至特定組織，包括癌組織，以消除與非特異性遞送相關的不期望的 副作用。
[0013] 認識到對于特異性地靶向期望的組織的遞送載體的迫切需求，本申請的發明人開 發了一種基于獨特的肽穩定化超小納米顆粒的藥物遞送系統，其多功能性使其可用于各種 應用。

【發明內容】

[0014] 根據本發明的一個方面，提供了一種非天然存在的肽-脂質納米支架，其包括至少 一種磷脂、至少一種不飽和脂質（優選不飽和固醇酯、進一步優選不飽和膽固醇酯、進一步 優選膽固醇油酸酯)和至少一種肽，所述肽包括能夠形成至少一個兩親性螺旋的氨基酸 序列；其中使前述成分關聯以形成肽-磷脂納米支架。在特別的實施方式中，所述肽選自由 類別A、H、L和Μ兩親性α-螺旋、其片段、以及包括類別A、H、L和Μ兩親性α-螺旋的反向肽序列 的肽、或其片段組成的組。
[0015] 優選地，所述肽-脂質納米支架進一步包括至少一種歸巢分子。在一個方面，所述 歸巢分子可以共價連接至所述至少一種肽(優選地在氨基酸處，特別是賴氨酸，在兩親性α_ 螺旋的親水面與疏水面之間的過渡處或附近)和所述至少一種脂質之一。在另一方面，所 述肽-脂質納米支架包括至少一種活性劑。
[0016] 在一個方面，所述至少一種歸巢分子為至少一種活性細胞表面受體配體。
[0017]根據另外的方面，提供了一種包括本文描述的非天然存在的肽-脂質的藥物劑型 (配方）。
[0018] 根據另外的方面，提供了一種制備本文描述的非天然存在的肽-脂質納米支架的 方法，包括在適合于形成所述肽-脂質納米支架的條件下合并(組合，結合)其成分。
[0019] 根據另外的方面，提供了一種非天然存在的肽-脂質納米支架，包括至少一種磷 月旨、至少一種不飽和固醇酯（優選不飽和膽固醇酯、進一步優選膽固醇油酸酯）、至少一種 肽、至少一種歸巢分子和至少一種包括雙鏈RNA的活性劑;其中所述活性細胞表面受體配體 共價連接至所述至少一種肽，并且使前述成分關聯以形成肽-磷脂納米支架。在一個方面， 所述雙鏈RNA為siRNA。
【附圖說明】
[0020] 圖1本發明的基于肽-穩定化超小納米顆粒的藥物遞送系統的實施方式的示意圖。
[0021] 圖2用于并入HPPS納米顆粒中以用于診斷和/或治療應用的化合物。
[0022] 圖3用于制備EGFp-(DiR-BOA)-HPPS(類型1 EGFR-靶向的HPPS)的合成方案。
[0023] 圖4用于制備(DiR-BOA)HPPS(類型2 EGFR-靶向的HPPS)的合成方案。
[0024] 圖5未靶向的DiR-BOA加載的HPPS的FPLC、DLS和CD。
[0025] 圖6 EGFp(DIR-BOA)-HPPS的FPLC分布和TEM。
[0026] 圖7 DiR-BOA加載對HPPS大小的影響。A:制劑#1和#2的FPLC分布;B:從FPLC收集的 部分。C:HPPS大小與貨物有效載荷之間的關聯(R = 0.91)。
[0027]圖 8 (a) FPLC 分布和(b)與 4F 和-4F 形成的（D iR-BOA) HPPS的 TEM。
[0028] 圖9 EGFp(DiR-BOA)-HPPS的共聚焦成像研究。
[0029] 圖10通過流式細胞術的EGFp (D iR-BOA) -HPPS的時間-依賴性攝取。
[0030]圖 11 EGFp(DiR-B0A)HPPS 的抑制研究。
[0031]圖 12 EGFp(DiR-B0A)-HPPS的體內成像研究。
[0032] 圖13通過流式細胞術的EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS在A549與H520細胞中的時間依 賴性攝取。
[0033] 圖14在具有不同水平的EGFR表達的細胞系中EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS的時間-依 賴性攝取的流式細胞術研究。
[0034]圖 15 通過 EGFp 的 EGFp(DiR-B0A)HPPS 和 EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS 的攝取抑制的流 式細胞術研究。
[0035] 圖16通過MTT和流式細胞術研究的EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS的初步毒性研究。a) 通過MTT分析研究的細胞存活能力顯示在甚至6倍的HPPS對照處(在所有先前的體外研究中 使用的標準劑量)沒有毒性;b)通過流式細胞術研究的細胞存活能力顯示在6倍的HPPS對照 處沒有毒性;C)通過流式細胞術研究的HPPS細胞攝取顯示在2倍的HPPS對照處(標準劑量） 攝取飽和。
[0036]圖17具有EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS(i.v.)的MT1腫瘤異種移植物的體內成像。箭 頭指示腫瘤。
[0037]圖18在具有人類肺原發腫瘤異種移植物的小鼠中EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS的體 內成像，表明EGFR-靶向特異性。
[0038]圖19利用KB (葉酸受體陽性)和HT1080 (葉酸受體陰性)癌細胞中的葉酸受體-靶向 的HPPS的共聚焦成像研究。注意:綠色來自DiR-BOA熒光，而藍色來自DAPI核染色）。
[0039]圖20多成分熒光標記。HPPS顆粒的每種成分(肽、磷脂、核心貨物)可以用熒光標簽 標記用于詳細的顆粒表征和顆粒降解的評估。
[0040] 圖21(&)1(11六(11131?-81)和1^1^7細胞的31?-81受體含量的蛋白質印跡分析。
[0041 ] (b)(DiR-B0A)HPPS對于SR-B1受體的特異性。共聚焦圖像顯示（DiR-BOA)HPPS在 SR-B1陽性細胞（ldlA(mSR-Bl))中的強攝取，但是在SR-B1陰性細胞(LDLA7)中不存在。此 外，過量的HDL有效地抑制ldlA(mSR-Bl)細胞中的（DiR-BOA)HPPS攝取，但是對于LDLA7中 的攝取沒有影響。
[0042]圖 22 利用 FITC-脂質（DiR-BOA)HPPS 和 FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS 和 ldlA(mSR-Bl) 細胞的共聚焦成像研究。
[0043]圖 23 利用 FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS 和 ldlA(mSR-Bl)細胞的共聚焦成像研究。 [0044] 圖24流式細胞術研究用于評估SR-ΒΓ和SR-ΒΓ細胞系中（DiR-BOA)HPPS的攝取。 [0045]圖25流式細胞術研究用于評估SR-ΒΓ細胞系中（DiR-BOA)HPPS濃度-依賴性的攝 取。
[0046]圖26流式細胞術研究用于評估SR-ΒΓ細胞系中（DiR-BOA)HPPS攝取的HDL濃度-依 賴性的抑制。
[0047]圖27流式細胞術研究用于評估SR-ΒΓ和SR-ΒΓ細胞系中（DiR-BOA)HPPS的差異攝 取和SR-ΒΓ細胞系中（DiR-BOA)HPPS攝取被HDL的抑制。
[0048]圖 28 流式細胞術用于評估（-4F)(DiR-B0A)HPPS 與（4F)(DiR-B0A)HPPS 被 ldlA (mSR-Bl)細胞的攝取。
[0049]圖29在具有人類KB(SR-B1 + )腫瘤異種移植物的裸鼠上進行體內成像以研究-4F (DiR-BOA)HPPS 的定位。
[0050]圖 30(a)進行共聚焦研究以評估（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS 和（-4F)(DiR-B0A)HPPS 在A549和H520細胞中的差異攝取。
[00511圖30(b)A549和H520細胞的表面受體分布的蛋白質印跡分析。
[0052]圖 31 使用流式細胞術來評估(DiR-BOA)HPPS 和 EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)被 H520、 A549和EGFR-GFP-A549細胞的攝取。
[0053]圖32在轉染有EGFR-綠色熒光蛋白（GFP)的融合基因的LDLA7細胞中進行EGF-HPPS 研究。該實驗去除SR-B1可能對EGF-HPPS的細胞攝取具有的任何貢獻。在用（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS孵育3小時后，EGFR-GFP-LDLA7細胞呈現出細胞溶質內的DiR-BOA的強信號，表明 EGF-HPPS通過EGFR的急切攝取。對于EGFR的GFP信號在外質膜上被可視化。
[0054]圖 33 進行共聚焦研究以評估 HDL 對（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS 在 EGFR-GFP-LDLA7 細 胞中的攝取的作用。
[0055] 圖34用EGF(DiR-BOA)HPPS孵育的EGFR-GFP-A549和H520細胞的共聚焦成像。
[0056] 圖35進行共聚焦研究以評估HDL對(_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在A549和H520細胞中 的攝取的作用。
[0057]圖36在具有雙腫瘤(A549和H520)的裸鼠上進行體內成像以確定（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的靶向能力。
[0058] 圖37(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的體內確認。體內成像(A)和生物分布(B)顯示HPPS 的改善的遞送特異性和效能。C)HPPS匹配HDL的長循環時間（tl/2~HhhD^PPS熒光信號 (DiRBOA)在腫瘤組織中的積聚匹配腫瘤細胞熒光(轉染有紅色熒光蛋白）。
[0059] 圖38 KB腫瘤和H520腫瘤中（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS的細胞攝取。白色條代表每mg 組織的熒光單位，而黑色條代表每百萬個細胞的熒光單位。數據反映了來自兩個具有腫瘤 的小鼠的平均值。
【具體實施方式】
[0060] 圖1示出了本發明的實施方式。具體地，圖1示出了基于肽-穩定化超小納米顆粒的 藥物遞送系統，稱為"HPPS"（高密度脂蛋白樣肽-磷脂支架），其允許用于檢測和治療癌癥和 其它疾病的活性劑的靶向遞送。所述HPPS納米顆粒包括三種成分:1)特異性兩親大小-對照 肽（scPep)和磷脂，其形成超小納米載體(5至25nm)，2)疾病-特異性革巴向配體，其可以被直 接結合至納米載體上的scPep、結合至納米載體上的表面磷脂、或者疾病-特異性祀向配體 如蛋白質或其片段，其可以被并入所述納米載體中而無需結合至scPep或磷脂（圖1中未示 出），以及3)診斷或治療劑，加載在所述納米載體核心內或并入所述納米載體內使得它們被 顯示在納米載體的表面上。為了形成優選的球狀納米顆粒，不飽和固醇酯也被合并在其中。 多種革G向可以通過將一些革E1向配體，如腫瘤-歸巢分子(例如，葉酸），結合至暴露在肽的表 面上的可結合的氨基酸如賴氨酸殘基來實現。HPPS納米顆粒因此靶向癌癥和/或特定組織 的期望的細胞表面標記物處，即，在各種類型的癌細胞或組織中選擇性過度表達的分子。 在特定的實施方式中，HPPS納米顆粒提供了活性劑，包括但不限于，診斷劑、成像劑（顯像 劑，顯影劑)和/或治療劑的靶向遞送。
[0061] 這樣的試劑包括，但不限于，磁共振成像(MRI)劑、近紅外熒光(NIRF)探針和光動 力學治療(PDT)劑。
[0062]在特定的實施方式中，HPPS脂質核心內的膽固醇酯被親脂性藥劑代替。在另外的 實施方式中，活性劑連接至本發明的HPPS納米顆粒的表面。
[0063]因此，MRI /NIRF探針在靶細胞中的積聚提供了一種用于MRI /NIRF可檢測信號的擴 大的容易的機制并提供了結合MRI (高分辨率/解剖)和NIRF(高敏感性)的強度的機會，而經 由這些途徑將PDT劑選擇性地遞送至腫瘤也提供了檢測與治療之間的容易的過渡。最后， HPPS納米顆粒不期待是免疫原性的，并應當避免被網狀內皮系統識別，因此HPPS平臺提供 了一種與大多數合成納米裝置相關的常見問題，即生物相容性和毒性的解決方案。
[0064]術語"納米顆粒"、"納米平臺"和"納米支架"在本文中可互換地使用。
[0065]本發明提供了包括脂質如磷脂酰膽堿(如DMPC(優選1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿）、P〇PC(l-棕櫚酰-1-油酰基-磷脂酰膽堿)和EYPC(卵黃磷脂酰膽堿））、溶血磷脂 酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、和磷脂酰肌醇的HPPS納米顆粒。
[0066]天然存在的脂蛋白顆粒每個具有特有的脫輔基蛋白、以及一定百分比的蛋白、三 酰甘油、磷脂和膽固醇。VLDL顆粒可以包含約10%蛋白、約60%三酰甘油、約18%磷脂和約 15 %膽固醇。LDL顆粒可以包含約25 %蛋白、約10 %三酰甘油、約22%磷脂和約45 %膽固醇。 HDL顆粒可以包含約50%蛋白、約3%三酰甘油、約30%磷脂和約18%膽固醇。同樣地，本發 明的HPPS納米顆粒包含不同百分比的上述組分。HPPS納米顆粒還可以包含一個或多個三酰 甘油。HPPS納米顆粒可以另外包含固醇、固醇酯、或其組合。在另外的實施方式中，固醇或固 醇酯選自由膽固醇、膽固醇油酸酯和不飽和膽固醇-酯組成的組。
[0067]在特定的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含靶向在癌細胞中過度表達的受 體的細胞表面受體配體。在另外的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含作為對于心血 管斑塊中過度表達的受體的配體的細胞表面受體配體。
[0068]在另外的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含靶向特定組織上的受體的細胞 表面受體配體。
[0069]在一些實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含在HPPS納米顆粒的核心內的親脂 性化合物。
[0070] 在一些實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含(部分)位于HPPS納米顆粒的表面 上的活性劑，所述活性劑是包含親脂性和親水性成分的分子。
[0071] 在特定的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含作為診斷劑、成像劑或治療劑 的活性劑。優選地，所述成像或診斷劑為對比劑、放射性標記和/或熒光標記。
[0072]在一些實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含抗癌劑。這樣的活性劑可以為化 療劑、光動力學治療劑、硼中子俘獲治療劑或用于放射治療的放射性核。在實施方式中，所 述抗癌劑選自由烷基化劑(烷化劑）、蒽環類藥、抗生素、芳香酶抑制劑、雙磷酸鹽類、環加氧 酶抑制劑、雌激素受體調節劑、葉酸拮抗劑、無機砷酸鹽、微管抑制劑、修飾劑、亞硝基脲 (nitrosureas)、核苷類似物、破骨細胞抑制劑、含鉑化合物、類維生素 A、拓撲異構酶1抑制 劑、激酶抑制劑(諸如，但不限于酪氨酸激酶抑制劑）、抗血管生成劑、表皮生長因子抑制劑 和組蛋白脫乙酰基酶(脫乙酰基轉移酶)抑制劑組成的組。
[0073]在另外的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含選自由抗青光眼藥、抗凝劑、消 炎藥、平喘藥、抗生素、抗真菌藥或抗病毒藥組成的組中的治療劑。
[0074]在另外的實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含選自以下的組中的治療劑，所 述組包括，但不限于:止痛劑、麻醉劑、抗心絞痛劑、抗風濕劑、抗心律失常劑、平喘劑、抗菌 劑、抗-BPH劑、抗癌劑、抗膽堿劑、抗凝血劑、抗驚厥劑、抗抑郁劑、抗糖尿病劑、止瀉劑、抗癲 癇劑、抗真菌劑、抗痛風劑、抗驅蟲劑、抗組胺劑、抗高血壓劑、消炎劑、抗瘧劑、抗偏頭痛劑、 抗毒蕈堿劑、止惡心劑、抗腫瘤劑、抗肥胖劑、抗骨質疏松劑、抗帕金森病劑、抗原蟲劑、止癢 劑、抗精神病劑、退熱劑、止痙攣劑、抗甲狀腺劑、抗結核劑、止咳劑、抗潰瘍劑、抗尿失禁劑、 抗病毒劑、抗焦慮劑、食欲抑制劑、注意力缺陷障礙(ADD)和注意力缺陷過動癥(ADHD)藥、鈣 通道阻滯劑、心變力劑、β-阻滯劑、細胞粘附抑制劑、中樞神經系統興奮劑、認知增強劑、皮 質類固醇、C0X-2抑制劑、細胞因子受體活性調節劑、解充血劑、利尿劑、勃起功能異常改善 劑、必需脂肪酸、腸胃劑、遺傳物質、組胺受體詰抗劑、hormonolytics、安眠藥、降血糖劑、免 疫抑制劑、keratolyses、白三稀抑制劑、脂質-調節劑、大環內酯類、有絲分裂抑制劑、肌肉 松弛劑、麻醉藥拮抗劑、神經安定劑、尼古丁、硝酸鹽類、非必需脂肪酸、非固醇類平喘劑、營 養油、類鴉片鎮痛藥、副交感神經阻滯劑、鎮靜劑、性激素、興奮劑、類交感神經劑、鎮定劑、 血管擴張劑、維生素、以及它們的組合。
[0075] 本發明還提供了包括本發明的HPPS納米顆粒的藥物劑型。
[0076] 本發明進一步提供了制備HPPS納米顆粒的方法。
[0077] 脂蛋白顆粒
[0078] 脂蛋白顆粒為一類天然存在的納米結構。膽固醇和三酰甘油在體液中以脂蛋白顆 粒的形式被轉運。每個顆粒包括由更極性的脂質和蛋白的殼包圍的疏水性脂質的核心。這 些大分子的積聚體的蛋白成分具有兩個作用：它們溶解疏水性脂質并且包含細胞-靶向信 號。脂蛋白顆粒根據增加的密度被分為：乳糜微粒、乳糜微粒殘余物、極低密度脂蛋白 (VLDL)、中間-密度脂蛋白（IDL)、低-密度脂蛋白（LDL)、和高密度脂蛋白（HDL)(參見表1)。 因此，它們中的每個的大小不同，并且除了乳糜微粒和乳糜微粒殘余物，它們中的大多數具 有納米結構（〈l〇〇nm) 〇
[0079] 表1.脂蛋白的大小和類別
[0080]
[0081]低密度脂蛋白（LDL)顆粒
[0082] LDL是人血漿中膽固醇的主要載體，并經由LDLR(低密度脂蛋白受體)通過胞吞作 用將外源性膽固醇遞送到細胞。LDL顆粒是通常具有約22nm直徑的天然存在的納米結構。它 包含一些1500酯化膽固醇分子和甘油三酯的脂質核心。磷脂和未酯化的膽固醇的外殼包 圍該高度疏水的核心。所述外殼還包含被L D L R識別的單一拷貝的a ρ ο B -10 0 (分子量 550kDa)。
[0083]高密度脂蛋白（HDL)顆粒
[0084] 血漿HDL是作為大約一半脂質和一半蛋白質的較小的、球狀、致密的脂蛋白復合 體。脂質成分由磷脂、游離膽固醇、膽固醇酯、和甘油三酯組成。蛋白質成分包括apo A-Ι(分 子量，28，000道爾頓)和apo A-Π (分子量，17，000道爾頓）。其它較小但是重要的蛋白質為 apo E和apo C，包括apo C_I、apo C-II、和apo C-III。
[0085] HDL顆粒是異質的。它可以被分為較大、較小致密的HDL2或較小、更致密的HDL3。通 常，大多數血漿HDL在HDL3中被發現。HDL每個顆粒由4個載脂蛋白構成。HDL可以由apo A-I 和apo A-II構成或僅由apo A-I構成。HDL2主要僅是apo A-I，而HDL3由apo A-I和apo A-II 制成。比HDL2更少致密的HDL顆粒富含apo E。
[0086] HPPS納米顆粒
[0087]因此，本發明提供了可以由多種不同的肽支架制成的具有不同尺寸的一系列納米 平臺。下面描述適于生產HPPS納米顆粒的肽成分。
[0088] HPPS納米顆粒可以靶向多種受體。此外，在一些實施方式中，HPPS疏水核心和磷脂 單層均可以被修飾以攜帶診斷和/或治療劑的較大的有效載荷，使得它們成為特別多功能 的納米平臺。在一些實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒包含一個或多個歸巢分子。所述 HPPS納米顆粒還可以攜帶一種或多種活性劑的有效載荷。HPPS納米顆粒還可以包含細胞死 亡傳感器，使得HPPS納米顆粒可以同時進行診斷、處理以及治療反應監測功能。
[0089] 本發明提供了基于具有如下描述的特定性能的肽的非天然存在的納米平臺。術語 "非天然存在的"是指不是固有地存在于人體內的納米平臺。這樣的非天然存在的HPPS納米 顆粒可以包含一種或多種天然存在的脂蛋白顆粒的成分。例如，存在于天然存在的LDL和 HDL顆粒的核心中的膽固醇酯可以被活性劑替換。同樣地，如在天然存在的脂蛋白顆粒中發 現的核心可以保持完整，但是活性劑被連接于HPPS納米顆粒的表面。
[0090] 在一些實施方式中，對于HPPS納米顆粒用于靶向遞送存在幾個不同的優點。在一 些實施方式中，本發明的HPPS納米顆粒的一個優點是它們被預期與宿主免疫系統完全相 容，并且它們也是生物可降解的。它們還可以提供用于大量診斷或治療劑的積聚的回收系 統，所述診斷或治療劑用于利用受體介導的胞吞作用的靶向細胞。本發明的HPPS納米顆粒 不被預期是免疫原性的，并且應當逃避被網狀內皮系統(RES)識別。
[0091] 其它優點可以包括：1)本發明的HPPS納米顆粒與生理載體具有的相似之處在于它 們均具有理想的尺寸范圍，該尺寸范圍足夠大以避免腎清除率，但足夠小以減少網狀內皮 系統(RES)攝取，因此藥物/探針的血清半衰期可以通過并入這些納米顆粒中被延長;2)藥 物/探針停留在脂質核心空間提供了保護以免受血清酶和水;3)HPPS納米顆粒的陣列的可 利用性提供了具有5nm到80nm范圍的大小的一系列納米平臺。
[0092]優選地，本發明的非天然存在的HPPS納米顆粒的直徑是（以增加的優選性）：5nm到 50nm，5nm至丨J40nm; 5nm至丨J30nm，5nm至丨J25nm; 5nm至丨J20nm，以及 1 Onm至丨J15nm 〇 [0093] HPPS納米顆粒的起始物質還包含在例如所述顆粒的外層上的至少一種脂質。可用 在本發明的HPPS納米顆粒中的脂質包括，但不限于，兩親性脂質。可用在本發明中的磷脂包 括，但不限于，磷脂酰膽堿(優選DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿、P0PC(1-棕櫚 酰-1-油酰基-磷脂酰膽堿)和EYPC(卵黃磷脂酰膽堿））、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷 脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇以及它們的組合。
[0094]支架肽
[0095]用于形成所述HPPS納米顆粒的合適的支架肽包括能夠形成至少一個兩親性a-螺 旋的氨基酸序列。
[0096]在優選的實施方式中，所述兩親性a-螺旋或肽的長度（以增加的優選性)在6-30個 氨基酸、8-28個氨基酸、10-24個氨基酸、11-22個氨基酸、4-21個氨基酸、16-20個氨基酸和 18個氨基酸的范圍內。
[0097]用于檢測和表征具有假定的兩親性螺旋結構的蛋白結構域的方法陳述在 Segrest,J.P.et al.in PROTEINS:Structure,Function,and Genetics(1990)8:103-117 中，將其內容以引用方式并入本文。Segrest等人已經鑒定了七種不同類別的兩親性螺旋并 鑒定了與每個類別相關的肽/蛋白質。在七種不同的類別中，存在四個脂質-相關兩親性螺 旋類別(A、H、L和Μ)。其中，類別A，指定的載脂蛋白類別，具有用于形成基于磷脂的顆粒的最 佳性能。
[0098] 合適的支架肽可以選自由類別A、H、L和Μα-螺旋或其片段組成的組。合適的支架肽 還可以包括類別A、H、L和Μ兩親性α-螺旋的反向肽序列或其片段，因為形成兩親性α-螺旋的 性能通過所述肽序列內氨基酸殘基的相對位置確定。
[0099] 在一個實施方式中，所述支架肽具有包括脫輔基蛋白的連續氨基酸的氨基酸序 列，優先選自由apoB-100、apoB-48、apoC、apoE和apoA組成的組。
[0100] 本發明中所用的"氨基酸"，以及如在說明書和權利要求書中所用的術語，包括已 知天然存在的蛋白質氨基酸，其通過它們常見的的三字母縮寫和單字母縮寫被提及。通常 參見Synthetic Peptides:A User's Guide,G A Grant,editor,ff.H.Freeman&Co. ,New York, 1992,將其教導以引用方式并入本文，包括第11頁到第24頁陳述的正文和表。如上所 述，術語"氨基酸"還包括天然存在的蛋白質氨基酸的立體異構體和修飾物、非-蛋白質氨基 酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶促合成的氨基酸、衍生的氨基酸、設計為模擬氨基酸的構建物 或結構等。修飾的和不常見的氨基酸通常描述在Synthetic Peptides:A User's Guide, cited above；Hruby V J,Al-〇beidi F and Kazmierski ff:Biochem J 268:249-262, 1990;and Toniolo C:Int J Peptide Protein Res 35:287-300,1990中；將其全部教導以 引用方式并入本文。
[0101] "α螺旋"在本文中用來指蛋白質的二級結構中常見的基序。α_螺旋是卷曲的構象， 類似于彈簧，其中每個骨架Ν-Η基團向早期的氨基酸四個殘基的骨架C = 0基團貢獻氫鍵。典 型地，由天然存在的氨基酸形成的α-螺旋將是右旋的，但是左旋構象也是已知的。
[0102] "兩親的"是描述具有親水性和疏水性性能的化合物的術語。兩親性α-螺旋通常是 生物活性肽和蛋白質中通常遇到的二級結構基序，并指的是具有沿著螺旋的長軸定向的相 對的極性和非極性面的α_螺旋。
[0103] 具有許多apoA-ι的脂質結合性能的較小的兩親性螺旋肽的實例包括2F，具有兩個 苯丙氨酸氨基酸殘基的18-氨基酸肽序列（D-W-L-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-L-K-E-A-F) (Ananthaaramaiah et al JBC. 1985;260:10248-10255)。早期研究表明這個序列顯不出強 脂質結合并且能夠形成穩定的盤狀磷脂顆粒。隨后的研究繼續表明兩個另外的F殘基的并 入(總共4F;D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)，進一步提高所述肽的脂質結合性能 (Ananthaaramaiah et al.Arterioscler Thromb Vase Biol·2005;25:1325-1331)〇
[0104] 歸巢分子
[0105] 如本文所用的，術語"歸巢"或"選擇性歸巢"是指特定分子在給予受試者后相對特 異地結合至特定器官或組織中存在的分子。通常，選擇性歸巢的特征部分在于，檢測比對照 器官或組織至少兩倍更大的所述分子與器官或組織的選擇性結合。在一些實施方式中，選 擇性結合比對照器官或組織至少三倍或四倍更大。
[0106] 在腫瘤歸巢分子的情況中，這樣的分子結合到在特定的癌組織中選擇性過度表達 的受體。過度表達是指在腫瘤組織中的表達比正常組織多至少一倍和一倍半。在實施方式 中，與非腫瘤相比，腫瘤中的表達多至少五倍。
[0107] 在本發明的實施方式中，歸巢分子連接于靶向特定組織和腫瘤的本發明的HPPS納 米顆粒的肽。"歸巢分子"指的是可以促進本發明的組合物體外或體內靶向組織和/或受體 的任何材料或物質。所述靶向部分可以是合成的、半合成的、或天然存在的。所述靶向部分 可以為蛋白質、肽、寡核苷酸、或其它有機分子。在一個實施方式中，所述靶向部分可以為到 達細胞表面受體的內源性配體(或其部分）。所述靶向部分可以為抗體(該術語包括保持結 合區或高變區的抗體片段和單鏈抗體）。可以用作靶向部分的材料或物質包括，但不限于， 表2中列出的那些物質：
[0108] 表2
[0109]
[0110]
[0111] 腫瘤歸巢分子
[0112] 腫瘤歸巢分子選擇性地結合至腫瘤組織與相同類型的正常組織。這樣的分子通常 是在腫瘤組織中過度表達的細胞表面受體的配體。在腫瘤組織與正常組織中過度表達的細 胞表面受體包括，但不限于，在未分化甲狀腺癌、結腸直腸癌、頭和頸癌、卵巢癌、腎細胞癌、 以及乳腺和肺腫瘤中過度表達的表皮生長因子受體(EGFR);在乳頭狀甲狀腺癌中過度表達 的轉移抑素受體;在乳腺癌的重要亞類中過度表達的ErbB家族受體酪氨酸激酶;在乳腺癌 中過度表達的人類表皮生長因子受體_2(Her2/neu);在肉瘤樣腎癌中過度表達的酪氨酸激 酶受體(c-Kit);在食道腺癌中過度表達的HGF受體c-Met;在乳腺癌中過度表達的CXCR4和 CCR7，；在前列腺癌中過度表達的內皮素（內皮縮血管肽)-A受體;在大多數結腸直腸癌腫瘤 中過度表達的過氧化物酶體增生物活化的受體δ(ΡΡΑΙ?-δ);在卵巢癌中過度表達的TOGFR A;在各種肺癌中過度表達的BAG-I;在胰腺癌中過度表達的可溶的II型TGF0受體;葉酸；以 及整聯蛋白（如ανβ 3)。
[0113] 葉酸受體是具有對于維生素葉酸高親和性(Kd約10-9Μ)的糖基磷脂酰肌醇-錨定的 糖蛋白（Leamon，CP.et al.，Biochemical Journal.l993May l;291(Pt.3):855_60)。葉酸 受體已經被鑒定為腫瘤-標記物，其在上皮惡性腫瘤(如卵巢癌、結腸直腸癌和乳腺癌)上相 對于正常組織以提高的水平表達（Wang, S.et al·，Journal of Controlled Release. 1998Apr 30;53( 1-3) :39-48)。已經表明當葉酸經由其g-羧基部分共價連接至單 一分子或分子的集合時，其對于細胞表面受體的親和力仍然基本不變。在胞吞作用和囊泡 轉運后，許多物質被釋放到細胞胞質中。未連接的葉酸受體可以隨后再循環到細胞表面;因 此，每個葉酸受體可以將許多葉酸結合物帶入細胞中。
[0114] 器官或組織歸巢分子
[0115] 本發明提供了選擇性歸巢到多種器官或組織的分子的應用，所述器官或組織包括 肺、皮膚、血液、胰腺、視網膜、前列腺、卵巢、淋巴結、腎上腺、肝臟、乳腺、消化系統或腎臟組 織。例如，本發明提供了使用肺歸巢肽，如包含GFE基序的那些，包括肽CGFECVRQCPERC和 CGFELETC;皮膚歸巢肽如CVALCREACGEGC;胰腺歸巢肽如肽SWCEPGWCR;以及視網膜歸巢肽如 包含RDV基序的那些，包括肽CSCFRDVCC和CRDVVSVIC。
[0116] 本發明還提供了通過給予包括歸巢到具有或懷疑有病狀的受試者的選擇的器官 或組織的分子的HPPS，利用本發明的器官歸巢分子來診斷或治療肺、皮膚、胰腺、視網膜、前 列腺、卵巢、淋巴結、腎上腺、肝臟或腸的病狀的方法。例如，肺、皮膚、胰腺、視網膜、前列腺、 卵巢、淋巴結、腎上腺、肝臟或腸的病狀可以通過給予具有所述病狀的受試者包含連接到治 療劑的適當的器官歸巢分子的HPPS納米顆粒。類似地，通過給予受試者包含連接到可檢測 的藥劑的適當的器官歸巢分子的HPPS納米顆粒鑒定選擇的器官或組織或診斷選擇的器官 中的病狀的方法。
[0117] 本發明的HPPS納米顆粒可以與器官和組織歸巢分子一起使用以使部分靶向到選 擇的器官或組織。本發明中使用的歸巢分子包括歸巢到各種正常器官或組織的肽，所述器 官包括肺、皮膚、胰腺、視網膜、前列腺、卵巢、淋巴結、腎上腺、肝臟或腸，以及歸巢到具有 腫瘤的器官，包括具有肺腫瘤的肺和具有胰腺腫瘤的胰腺。例如，本發明包括使用肺歸巢 肽，包括肽CGFECVRQCPERC和CGFELETC，其每一個包含三肽GFE基序，以及肽GIGEVEVC。本發 明還包括使用皮膚歸巢肽如肽CVALCREACGEGC;胰腺歸巢肽，如肽SWCEPGWCR和視網膜歸巢 肽如肽CSCFRDVCC和CRDVVSVI C，其每一個包含三肽RDV基序。也提供了歸巢到前列腺、卵巢、 淋巴結、腎上腺、肝臟和腸的肽的實例(參見下面的表3)。在一個實施方式中，歸巢分子可以 為EGFR-特異性肽，如全長EGF蛋白（EGF)或其片段。
[0118] 為了方便，術語"肽"在本文中概括地用來指代肽、多肽、蛋白質和蛋白質的片段， 并且包括，例如，單鏈肽。本發明中使用的其它分子包括類肽、肽模擬物等。關于本發明的器 官或組織歸巢肽，肽模擬物，其包含化學修飾的肽、包含非天然存在的氨基酸的肽樣分子、 類肽等，具有肽模擬物來源地器官歸巢肽的結合活性（參見，例如，"Burger ' s Medicinal Chemistry and Drug Discovery"5th ed. ,vols. lto 3(ed.M.E.Wolff；ffiley Interscience 1995)，將其通過引用方式并入本文中）。肽模擬物相對于肽提供了多個優 點，包括肽模擬物在給予受試者時，例如在通過消化道期間是穩定的，因此，可用于口服給 藥。
[0119] 用于鑒定肽模擬物的方法在本領域中是熟知的，并且包括，例如，篩查包含潛在的 肽模擬物的文庫的數據庫。例如，Cambridge Structural Database包含多于300，000個具 有已知的晶體結構的化合物的收集物(Allen et al.，Acta Crystallogr.Section B，35: 2331 (1979))。該結構存放處在新的晶體結構被測定時持續更新，并且可以篩查具有合適的 形狀的化合物，例如，與器官或組織歸巢分子相同形狀的化合物，以及潛在的幾何和化學互 補于由器官或組織歸巢分子束縛的靶分子的化合物。當沒有歸巢肽或靶分子(其結合器官 或組織歸巢分子）的晶體結構可獲得時，可以利用，例如程序⑶NCORD(Rusinko et al.， J · Chem. Inf · Comput · Sci · 29 : 251 (1989))產生結構。另一數據庫，Avai lable Chemicals Directory(Molecular Design Limited, Informations Systems；San Leandro Calif.), 包含約100,000個商業上可獲得的化合物，并且還可以被檢索以鑒定器官或組織歸巢分子 的潛在肽模擬物。
[0120] 分子的選擇性歸巢到選擇的器官或組織可以是由于通過器官或組織中的細胞上 存在的特定細胞靶分子的分子如細胞表面蛋白的選擇性識別。歸巢的選擇性取決于在僅僅 一種或幾種不同的細胞類型上表達的特定靶分子，使得所述分子歸巢到僅僅一個或幾個器 官或組織。在這方面，大多數不同的細胞類型，特別是對于器官或組織獨特的細胞類型，可 以表達獨特的靶分子。
[0121]已經被鑒定為可用于歸巢到特定器官或組織的肽基序的實例包括表3中列出的那 止匕 -、〇
[0122]表3
[0123]
[0124] 本發明包括肺歸巢肽的應用，如CGFECVRQCPERC和CGFELETC，其分享GFE基序； CTLRDRNC;以及CIGEVEVC，其包含類似于CGFELETC中存在的ELE基序的EVE基序。
[0125] 優選地，本發明還可以使用皮膚歸巢肽如CVALCREACGEGC。本發明進一步提供了具 有胰腺歸巢肽如SWCEPGWCR的HPPS納米顆粒。視網膜歸巢肽如CSCFRDVCC和CRDVVSVIC也可 以與本發明的HPPS納米顆粒一起使用。前列腺歸巢肽如SMSIARL和VSFLEYR也可以與本發明 的HPPS納米顆粒一起使用。還提供了卵巢歸巢肽如RVGLVAR和EVRSRLS。本發明還可以使用 腎上腺歸巢肽如分享LPR基序的LMLPRAD和LPRYLLS，或分享基序LAGG的肽R(Y/F)LLAGG和 RYPLAGG。此外，淋巴結歸巢肽，如AGCSVTVCG可以與本發明一起使用。本發明還可以使用腸 歸巢肽如YSGKWGK和YSGKWGW。
[0126] 心血管斑塊歸巢分子
[0127] 動脈粥樣硬化斑塊已知過度表達一些受體，如CX3CL1。本發明因此包括對于在這 樣的斑塊上過度表達的受體的配體。
[0128] 感染的組織歸巢分子
[0129] 感染有各種感染性試劑如病毒、寄生蟲、和/或細菌(如，HIV、瘧疾…等）的組織通 常表達(或過度表達)細胞表面標記物/受體(如，蛋白質）。因此本發明的歸巢分子包括對于 在這樣的感染的組織上表達的所述細胞表面標記物/受體的配體。
[0130] 活性劑
[0131 ] 將活性劑修飾和包裝入LDL的方法由Krieger，M.在Methods Enzymol. (1986)128: 608-13中描述，在這方面將其內容以引用方式并入本文。類似的方法可以與本發明一起使 用。
[0132] 親脂性化合物
[0133] 各種活性劑可以經由本發明的HPPS納米顆粒遞送。在實施方式中，活性劑位于 HPPS納米顆粒的核心中，其通常是親脂的。親脂性化合物由此能夠經由本發明的HPPS納米 顆粒遞送。本發明的HPPS納米顆粒可以與固有地親脂的或可以通過化學修飾成為親脂的活 性劑一起使用，在下面更詳細地討論。
[0134] 術語"親脂性化合物"或"親脂性藥物"定義為處于其非離子化的形式時在脂質或 脂肪中比在水中更可溶的化合物或藥物。親脂性化合物的實例包括，但不限于，乙酰苯胺、 苯胺、氨基喹啉、二苯甲基化合物、苯并二氮草類、苯并咲喃、大麻酯(大麻素）、環肽、二苯丙 氮，草類、毛地黃糖苷、麥角生物堿類、類黃酮、咪唑、喹啉、大環內脂、萘、鴉片(或嗎啡喃）、噁 嗪、噁唑、苯烷基胺、哌啶、多環芳香烴、吡咯烷、吡咯烷酮、均二苯代乙烯（1，2_苯乙烯， 芪）、磺酰脲、砜、三唑、莨菪烷、以及長春花生物堿。
[0135] 多種測試可以用于確定親脂性。常見的測試方案是測量辛醇-水分配系數(Pow， κ?)，其是通過確定辛-1-醇與水之間的平衡分布來測量親脂性。親脂性藥物是那些優先分 配入辛醇成分中的藥物。
[0136] 可以被并入本發明的靶向的藥物遞送復合體的藥物活性親脂性藥物包括用于治 療癌癥和青光眼的藥物、免疫活性劑、抗腫瘤劑、抗膽堿能和類膽堿劑、抗蕈毒堿和蕈毒堿 劑、抗腎上腺素能藥和抗心律失常藥、抗高血壓劑、消炎藥、抗生素藥、抗真菌藥、類固醇類、 抗組胺藥、平喘藥、鎮靜劑、抗癲癇藥、麻醉劑、安眠藥、抗精神病劑、神經安定藥、抗抑郁劑、 抗焦慮藥、抗驚厥劑、神經元阻斷劑、抗麻醉劑、止痛劑、抗增生劑、抗病毒藥、激素類、和營 養劑。
[0137] 抗癌藥的實例包括，但不限于紫杉醇(紅豆杉醇）、二十二碳六烯酸(DHA)-紫杉醇 結合物、環磷酰胺、樺木酸、和阿霉素(參見，例如授予Strelchenok的美國專利第6，197，809 號)。
[0138] 抗青光眼藥的實例包括，但不限于，β-阻滯劑如噻嗎洛爾-堿、倍他索洛爾、阿替洛 爾、左布諾洛爾、腎上腺素、二新戊酰、oxono Ιο 1、乙酰唑胺-堿和醋甲唑胺。
[0139] 消炎藥的實例包括，但不限于，留族藥物如可的松和地塞米松以及非留族消炎藥 (NSAID)如吡羅昔康、吲哚美辛、萘普生、苯基丁氮酮、布洛芬和雙氯芬酸。平喘藥的實例包 括但不限于潑尼松龍和潑尼松(也參見美國專利第6，057，347號）。
[0140] 抗生素藥的實例包括但不限于氯霉素。抗真菌藥的實例包括但不限于制霉菌素、 兩性霉素 B、和咪康唑。抗病毒藥的實例包括但不限于Acyclovir?(Glaxo Wellcome，U.K.)。
[0141] 類固醇的實例包括但不限于睪丸激素、雌激素、和孕酮。抗過敏藥的實例包括但不 限于非尼拉敏衍生物。鎮靜劑的實例包括但不限于地西泮和異丙酚。
[0142] 通常不是親脂性的被遞送的化合物可以通過將它們融合或共價偶聯到一個或多 個親脂性分子以產生兩親化合物而用在本發明中。例如，這樣的親脂性分子優選地包含至 少一個長烴鏈(>C 1Q)，其或者通過順式-雙鍵彎曲或者通過至少一個側鏈支化。這樣的分子 包括，但不限于，膽固醇油酸酯、油酸酯、膽固醇月桂酸酯或植醇。也可以使用固醇和脂肪 酸。
[0143] 核酸，如siRNA，以及核酸和肽適體，可以通過復合核酸與陽離子脂質以形成親脂 性復合體來作為"親脂性"化合物遞送，所述復合體可以隨后被并入顆粒的核心，或相反與 本發明的磷脂結合。核酸還可以經由與脂質錨的共價鍵而被并入HPPS納米顆粒，如下指出 的。
[0144] 具有脂質錨的藥劑
[0145] 除了為親脂性的并且可以被加載入本發明的HPPS納米顆粒的核心的活性劑外，本 發明還包括可以加載到本發明的HPPS的表面上的活性劑。這樣的活性劑可以是具有脂質錨 的親水性的。本發明的HPPS納米顆粒也可以被修飾成包括親脂性螯合劑，這樣的親脂性螯 合劑是熟知的。例如，親脂性螯合劑，DTPA Bis(硬脂酰胺），可以利用標準技術被并入到 HPPS納米顆粒中。同樣地，1，1_雙十八烷基_3,3,3,3_四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(Dil)可 以被用作已知插入LDL磷脂單層的脂質-錨定的、基于羰花青的光學探針，并且可用在本發 明的HPPS納米顆粒中。
[0146] 類似地，近紅外（"NIR"）探針如三羰花青染料，其是NIR熒光團，可以被修飾以包括 允許這樣的探針被錨定到本發明的HPPS納米顆粒的脂質-螯合錨。可以使用任何這樣的脂 質-螯合錨，例如，膽固醇月桂酸酯部分可以被連接到NIR探針以將它們錨定到本發明的 HPPS納米顆粒。（Zheng et al.，Bioorg.&Med.Chem Lett.l2:1485-1488(2002)〇
[0147]如上說明的，膽固醇部分也可以用于錨定HPPS納米顆粒內的siRNA(和另外的適 體)和其它活性劑。已經確定，膽固醇-結合的siRNA可以在體內沉默基因表達，并且這些結 合物結合到LDL和HDL顆粒（Wolfrum，C.et al .Nature Biotech.published online 16 September 2007)。用于活性劑的合適的錨包括油酸酯(鹽)和不飽和的膽固醇酯部分。這樣 的錨可以利用本領域技術人員已知的合成方法共價連接至活性劑。在一個實施方式中，所 述錨可以經由酯鍵共價連接至活性劑。
[0148]成像/診斷劑
[0149]在一個實施方式中，活性劑可以是可檢測的試劑(藥劑），如放射性核素或成像劑， 其允許所選器官或組織的檢測或可視化。因此，本發明提供了包括肺、皮膚、血液、胰腺、視 網膜、前列腺、卵巢、淋巴結、腎上腺、肝臟或腸歸巢分子的HPPS納米顆粒。選擇的可檢測試 劑的類型將取決于應用。例如，為了受試者中肺的體內診斷性成像研究，肺歸巢分子可以被 連接到包含在給予受試者后對于受試者外部可檢測的試劑的HPPS納米顆粒。為了檢測這樣 的內部器官或組織，例如，前列腺，發射放射性核素如銦-113、銦-115或锝-99的γ射線可以 與連接到前列腺歸巢分子的HPPS納米顆粒結合，并且在給予受試者后，可以利用固體閃爍 檢測器被可視化。可替換地，對于受試者的外表面處或附近的器官或組織，例如，視網膜，可 以使用熒光素-標記的視網膜歸巢分子，使得視網膜的內皮結構可以利用檢眼鏡和適當的 光學系統被可視化。
[0150] 選擇性歸巢到器官或組織中的病理損害的分子類似地可以用在本發明的HPPS納 米顆粒中以遞送適當的可檢測試劑，使得損害的大小和分布可以被可視化。例如，當器官或 組織歸巢分子歸巢到正常器官或組織，但是不歸巢到器官或組織中的病理損害時，可以通 過鑒定器官或組織中的異常或非典型圖像，例如，損害區中可檢測試劑的缺乏，來檢測病理 損害的存在。
[0151] 可檢測的試劑還可以是方便體外檢測的試劑。例如，包含歸巢分子和酶的HPPS納 米顆粒(其在存在適當的底物時產生可見信號）可以檢測歸巢分子針對的器官或組織或細 胞的存在。可以包含例如堿性磷酸酶或熒光素酶等的這樣的HPPS納米顆粒可以用在如免疫 組織化學的方法中。這樣的HPPS納米顆粒還可以用于檢測例如，在靶分子的純化期間在樣 品中，結合了器官歸巢分子的靶分子的存在。
[0152] 另外的診斷劑包括對比劑、放射性標記和熒光標記。優選的對比劑為光學對比劑、 MRI對比劑、超聲對比劑、X-射線對比劑和放射性核素。
[0153] 治療劑
[0154] 治療劑可以為在選擇的器官或組織的部位處發揮其功能的任何生物學上有用的 試劑(藥劑），如先前提及的活性劑和親脂性化合物。例如，治療劑可以為小的有機分子，其 在由于連接的器官歸巢分子結合到靶細胞后，被細胞內在化，在那里它可以影響其功能。治 療劑可以為編碼涉及所選的器官或組織中，如希望的，刺激或抑制細胞存活、細胞增殖或細 胞死亡的蛋白質的核酸分子。例如，編碼蛋白質如Bcl_2(其抑制凋亡）的核酸分子可以用 于促進細胞存活，而編碼蛋白質如Bax(其刺激凋亡）的核酸分子可以用于促進靶細胞的細 胞死亡。
[0155] 刺激細胞死亡的特別有用的治療劑是蓖麻毒素，其，當連接到包含本發明的器官 歸巢分子的HPPS時，可以用于治療高增殖性障礙，如，癌癥。包含本發明的器官歸巢分子和 抗生素，如氨芐西林或抗病毒劑，如病毒唑的HPPS納米顆粒，例如，可以用于治療選擇的器 官或組織中的細菌或病毒感染。
[0156] 治療劑還可以抑制或促進生物分子的產生或活性，其表達或缺乏與病狀相關。因 此，蛋白酶抑制劑可以為這樣的治療劑，其在連接到包含器官歸巢分子的HPPS時，可以抑制 選擇的器官或組織，如胰腺處的蛋白酶活性。基因或其功能等價物如cDNA(其可以補充或恢 復選擇的器官或組織中的蛋白質的產生）也可以為用于改善病狀的嚴重性的治療劑。治療 劑還可以為反義核酸分子，其表達抑制有害蛋白質的產生，或者可以為編碼顯性陰性蛋白 質或其片段的核酸分子，其可以抑制有害蛋白質的活性。如上所述，核酸，以及核酸和肽適 體，可以通過復合核酸與陽離子脂質以形成親脂性復合體來作為"親脂性"化合物遞送，所 述復合體隨后可以被并入顆粒的核心，或相反與本發明的磷脂結合。膽固醇部分或其它脂 質錨還可以用于將這些和其它活性劑錨定在HPPS納米顆粒的核心內。
[0157] 光動力學治療(PDT)劑
[0158] PDT是涉及光和光敏劑的組合的有希望的癌癥治療。每個因素本身是無害的，但是 當組合在一起時，它們可以產生殺死腫瘤細胞的致死性活性氧物質（Dougherty，T.J. et al.Journal of the National Cancer Institute.90,889-905(1998))。單態氧(^02)是與 多種生物分子和集合反應的有力的、相當不加區別的氧化劑。通常公認是roT誘導的腫瘤 壞死的關鍵試劑（Niedre ,M. et al · Photochemistry&Photobiology · 75,382-391 (2002))。 的擴散范圍限于細胞介質內的大約45nm(Moan，J · Photochem. Photobiol · 53，549-553 (1991))。因此，02的主要產生的部位決定哪個亞細胞結構可以被到達和攻擊，換句話說，如 果光敏劑優先位于腫瘤細胞內，則PDT誘導的細胞損害是高度腫瘤特異性的。
[0159]優選的光動力學治療劑為卟啉、撲啉異構體、和擴展的卟啉。
[0160]在實施方式中，光動力學治療劑選自由叔丁基硅萘酞菁二油酸酯（SiNc-BOA)、叔 丁基硅酞菁二油酸酯（SiPc-BOA)、和焦脫鎂葉綠酸-膽固醇酯(Pyro-CE)組成的組。SiNc-B0A、SiPc_B0A、和Pyro-CE是產生用于光動力學治療的毒性氧物質的光敏劑化合物。
[0161] 用于熒光成像的近紅外(NIR)染料和TOT劑
[0162] NIR熒光成像（NIRF)是非放射性的、高度敏感的、和便宜的癌癥檢測模式 (ffeissleder,R.et al.Nature Medicine 9,123-128(2003),Frangioni,J.V.Current Opinion in Chemical Biology 7,626-634(2003))，其允許基于腫瘤和健康組織的焚光之 間的差異檢測腫瘤和健康組織的非侵入性區別。NIR染料目前作為用于癌癥檢測的NIRF探 針和作為用于通過PDT的癌癥治療的光敏劑吸引相當大的興趣。NIR染料的吸引力在于在 600nm到900nm之間的光譜窗口中的組織光學性能。對于這樣的波長，組織吸收系數較低；因 此光的傳播主要由散射事件控制，并且幾厘米的穿透深度是可達到的。因此，NIR染料的獨 特能力能夠使表面下的腫瘤，包括乳腺癌熒光成像和Η)Τ治療。
[0163] NIRF和TOT模式的目前的限制是它們由于將染料遞送至腫瘤的相對非特異性性質 而缺乏足夠的腫瘤與組織對比，其已經導致對于NIRF的假陰性和對于PDI的不足的腫瘤與 正常組織治療比率。因此，祀向"腫瘤標記"的試劑，即，在癌細胞中選擇性積聚的分子，是特 別有吸引力的。本發明提供了將NIRF/PDT試劑鎖定在核心內的腫瘤-靶向HPPS納米顆粒，使 得實現更高的探針/蛋白質摩爾比率和腫瘤特異性。
[0164] 磁共振成像劑
[0165] 現在已經確立MRI是目前可利用的各種診斷形式中優秀的方法，因為其通過體內 取樣水質子的量、流量、和環境提供了繪制軟組織中的結構和功能的有力方式。通過使用對 比劑可以增大固有的對比。靶向的MRI試劑，雖然概念上非常有吸引力，但是僅存在于一些 潛在有用的實例中。因為敏感性限制，目前有效的識別需要非常高容量的靶標，如血纖蛋 白，其以足夠的量存在以致可以用簡單靶向的Gd(釓)螯合劑看見，或者可以用與Gd簇、聚合 物或鐵顆粒連接的到達血流的靶標。這是目前非常有限的靶標集。此外，胞內MRI成像是特 別有挑戰性的，因為用于MRI檢測限所需的MRI劑的最小濃度大大高于（約ImM)胞外靶向閾 值（40μLν?)〇(Aime，S·et al.Journal of Magnetic Resonance Imaging.2002 16(4): 394-406, Nunn,A.D.et al.Quarterly Journal of Nuclear Medicine.1997 41(2):155-62)。一個值得注意的嘗試被Wiener et al·在1995年報道（Wiener ,E.C.et al · Investigative Radiology · 1997 Dec ,-32( 12): 748-54)。利用基于葉酸-結合的DTPA的 樹枝狀高分子，它們實現由與葉酸受體的存在相關的腫瘤細胞的攝取。注射后24h，它們還 獲得17 %的MRI對比增強。本發明提供了遞送MRI和NIRF/PDT劑的HPPS納米顆粒。
[0166] 在本發明的一些實施方式中，MRI對比劑為氧化鐵或鑭系元素的堿(鑭系元素堿， lanthanide base)，如,L(Gd3+)金屬。
[0167] 在神經系統中活躍的試劑
[0168] 在神經系統上活躍的藥物也可以經由本發明的HPPS納米顆粒被遞送。這樣的藥物 包括抗精神病藥、興奮劑、鎮靜劑、麻醉劑、鴉片劑、鎮定劑、抗抑郁劑、如MAO抑制劑、三環物 和四環物、選擇性血清素再攝取抑制劑和安非他酮。在神經系統中活躍的藥物還包括神經 肽。由于低代謝穩定性、被肝臟的高清除率和血腦屏障的存在，肽藥物的遞送通過它們到腦 的不良生物利用率被限制。本發明的HPPS納米顆粒能夠將這樣的藥物遞送至中樞神經系 統。
[0169] 藥物組合物
[0170] 當給予受試者時，本發明的納米平臺作為藥物組合物給予，所述藥物組合物包含， 例如，HPPS納米顆粒和藥用載體。藥用載體在本領域中是熟知的，并且包括，例如水溶液如 水或生理緩沖鹽水或其它溶劑或載體(媒介)如乙二醇、甘油、油如橄欖油或可注射的有機 酯類。
[0171]藥用載體可以包含生理上可接受的化合物，所述化合物起作用，從而例如穩定或 增加復合體的吸收。這樣的生理上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖 或右旋糖，抗氧化劑，如抗壞血酸或谷胱甘肽，螯合劑，低分子量蛋白或其它穩定劑或賦形 劑。本領域技術人員將已知藥用載體的選擇，包括其中任何生理上可接受的化合物，取決 于，例如給予藥物組合物的途徑。所述藥物組合物還可以包含這樣的HPPS納米顆粒，所述 HPPS納米顆粒進一步包括癌治療劑、或希望的其它活性劑，包括親脂性化合物、具有脂質錨 的試劑、成像/診斷劑、治療劑、光動力學治療（PDT)劑、用于熒光成像和PDT劑的近紅外 (NIR)染料、磁共振成像劑、以及在神經系統中活躍的試劑。
[0172] 如上所述，本發明的納米平臺可以在生理或藥用載體中提供，或可以以用于隨后 應用的凍干形式提供。組合物在打算用于腸胃外給予等時可選地是無菌的，但是在打算用 于一些局部應用時不需要總是無菌的。可以使用任何藥用載體，包括但不限于含水載體。用 于腸胃外注射的含水載體包括水、酒精/水溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質。腸胃 外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳化的林格氏或固定油。靜脈內 載體包括流體和營養補充劑、電解質補充劑(如基于林格氏右旋糖的那些)等等。也可以存 在防腐劑和其它添加劑，如，例如，抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等。
[0173] 本領域技術人員將已知包含本發明的HPPS納米顆粒的藥物組合物可以通過多種 途徑給予受試者，例如，口服或腸胃外，如靜脈內。所述藥物組合物可以通過注射或通過插 管給予。
[0174] 在進行如本文披露的診斷、成像或治療方法中，必須給予受試者治療有效量的本 發明的HPPS納米顆粒。"治療有效量"是產生期望的效果的HPPS納米顆粒的量。有效量將取 決于，例如活性劑和計劃的用途。例如，與用于治療目的(其中期望殺死細胞)給予的放射性 同位素標記的分子的量相比，對于成像可以需要較少量的放射性同位素標記的HPPS納米顆 粒。用于具體目的的特定HPPS納米顆粒的治療有效量可以利用本領域中熟知的方法來確 定。
[0175] 原則上，作為本發明的HPPS納米顆粒的部分的器官歸巢分子可以具有固有的生物 學性能，使得所述分子的給予提供直接的生物學效應。例如，器官歸巢分子可以充分地類似 于對于靶分子的天然存在的配體，以便所述器官歸巢分子模擬天然配體的活性。這樣的器 官歸巢分子可以用作具有天然配體的活性的治療劑。例如，當所述器官歸巢分子模擬結合 通過選擇的器官或組織表達的受體的生長因子的活性時，如模擬表皮生長因子的活性的皮 膚歸巢分子，所述器官歸巢分子的給予可以導致所述器官或組織的細胞增殖。本發明的器 官歸巢分子的這樣的固有的生物學活性可以通過使選擇的器官或組織的細胞與所述歸巢 分子接觸并檢驗細胞的生物學效應的證據，例如，細胞增殖或當固有活性是毒性作用時細 胞死亡來鑒定。
[0176] 此外，作為本發明的HPPS納米顆粒的部分的器官歸巢分子可以具有結合特定靶分 子的固有活性，使得相應的配體不能結合受體。已知，例如，各種類型的癌細胞轉移到特定 器官或組織，顯示癌細胞表達結合其轉移的器官中靶分子的配體。因此，例如，給予具有轉 移到肺的腫瘤的受試者肺歸巢分子可以提供防止潛在的轉移性癌細胞變成在肺中建立的 方式。然而，通常，本發明的器官歸巢分子特別用于將HPPS納米顆粒靶向選擇的器官或組 織。因此，本發明提供了通過給予具有病狀的受試者本發明的HPPS納米顆粒來治療選擇的 器官或組織中病狀的方法。
[0177] 肺的特定疾病，例如，可以通過給予受試者包括肺歸巢分子和治療劑的HPPS納米 顆粒來治療。因為肺歸巢分子可以定位于肺的毛細管和肺泡，與這些區域相關的疾病特別 適用于用包含肺歸巢分子的結合物治療。例如，細菌性肺炎通常起源于肺的肺泡和毛細管 (Rubin and Farber,Pathology 2nd ed.，（Lippincott Co. ,1994))。因此，具有肺歸巢分 子和合適的抗生素的HPPS納米顆粒可以給予受試者以經由本發明的HPPS納米顆粒來治療 肺炎。類似地，由于CFTR中的缺陷，囊性纖維化造成肺中的病理損害。因此，給予具有肺歸巢 分子和編碼CFTR的核酸分子的HPPS納米顆粒提供了作為體內基因治療處理方法的用于使 所述核酸分子到達肺的方式。
[0178] 本發明還提供了通過給予具有病狀的受試者包含皮膚歸巢分子和治療劑的HPPS 納米顆粒來治療皮膚的病狀的方法。例如，燒傷受害者可以被給予包含皮膚歸巢分子和表 皮生長因子或血小板衍生的生長因子的HPPS納米顆粒，使得所述生長因子被定位于皮膚， 在此處它可以加速表皮和下面的真皮的再生或修復。此外，通過給予受試者包含皮膚歸巢 分子和抗生素的HPPS納米顆粒，本發明的方法可以用于治療由細菌感染引起的皮膚病狀， 特別是在整個皮下組織和真皮擴散的感染或者定位在這些組織中的感染。
[0179] 本發明還提供了通過給予具有病狀的受試者包含胰腺歸巢分子和治療劑的HPPS 納米顆粒來治療胰腺的病狀的方法。尤其是，由于本發明的胰腺歸巢分子可以定位于外分 泌胰腺，因此與外分泌胰腺相關的病狀可以被治療，并且在一些情況中，可能會不利地影響 內分泌胰腺。本發明的方法還可以特別用于治療急性胰腺炎，其是由損害所述器官的分泌 的蛋白酶造成的外分泌胰腺的炎性狀況。包含胰腺歸巢分子和蛋白酶抑制劑的HPPS納米顆 粒可以用于抑制蛋白酶介導的組織破壞，由此減輕病狀的嚴重性。可用于這樣的HPPS納米 顆粒中的適當的蛋白酶抑制劑是抑制與胰腺炎相關的酶的那些抑制劑，包括，例如，胰島 素、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶和胰脂肪酶的抑制劑。本發明的方法還可以用于通 過給予受試者包含連接到歸巢到胰腺的分子的治療劑的HPPS納米顆粒來治療具有胰腺癌 的受試者，例如，導管腺癌。
[0180] 本發明的方法還可以用于通過給予具有病狀的受試者包含視網膜歸巢分子和治 療劑的HPPS納米顆粒來治療眼，尤其是視網膜的病狀。例如，增生性視網膜病與對于由于例 如糖尿病的視網膜局部缺血的應答的視網膜的心血管形成相關。因此，給予包含連接到刺 激凋亡的基因，例如Bax的視網膜歸巢分子的結合物可以用于治療增生性視網膜病。類似 地，本發明的方法可以用于利用如本文披露的適當的器官或組織歸巢分子來診斷或治療前 列腺、血液、卵巢、乳腺、淋巴結、腎上腺、肝臟、或腸病狀。
[0181] 本發明進一步提供了用于治療受到多種感染物如病毒、寄生蟲、和/或細菌（如 HIV、瘧疾…等)感染的組織的方法。與HPPS納米支架一起使用的歸巢分子將通常包括到達 感染組織中表達(或過度表達)的細胞表面標記物/受體(例如，蛋白質）的配體。
[0182] 本發明進一步提供了將親脂性化合物、診斷劑或藥物遞送到受試者、靶組織、或器 官的方法，包括以下步驟:制備HPPS的藥物劑型，所述劑型包括與脂質結合的親脂性藥物， 所述脂質的量為根據本發明的方法足以與所述親脂性藥物形成復合體的量；以及給予所述 靶組織治療有效量的藥物劑型。本發明的藥物劑型可以靜脈內、動脈內、鼻內給予，諸如通 過氣溶膠給予、霧化、吸入、或噴灑、氣管內、關節內、經口、經皮、皮下、直腸、或局部。
[0183] "有效的"或"治療有效的"量是指(在某種程度上)緩解患者中的疾病或狀況中的 一種或多種癥狀的量。此外，"治療有效量"是指將與疾病相關或是疾病成因的生理或生物 化學參數部分或完全返回到正常的量。此外，有效量可以為足以實現某個其它計劃的目的 的量，如放射性成像劑或其它診斷劑遞送到器官或組織。
[0184] 此外，本發明提供了一種鑒定選擇的器官或組織或診斷選擇的器官或組織中的病 狀的方法，包括以下步驟:制備包含適當的靶向部分和與脂質結合的診斷劑的HPPS的藥物 劑型，所述脂質的量足以根據本發明的方法與所述診斷劑形成顆粒，以及給予受試者到達 所述靶器官或組織的藥物劑型。
[0185] "診斷劑"是指可以與用于使患者的內部區域成像和/或診斷患者中疾病的存在或 缺乏的方法結合使用的任何試劑。示例性的診斷劑包括，例如，用于與患者的超聲成像、磁 共振成像或計算機斷層成像結合使用的放射性和熒光標簽以及對比劑。診斷劑還可以包 括用于促進患者中疾病或其它狀況的診斷的任何其它試劑，不管是否采用成像方法。
[0186] 本發明還提供了一種治療經受選自由以下組成的組中的障礙的受試者的方法:皮 膚癌、牛皮癬、痤瘡、濕疹、紅斑痤瘡、光化性角化病、脂溢性皮炎、和先天性角化障礙，其中 根據本發明的方法的任何組合物通過局部應用而給予需要這樣的治療的受試者。
[0187] 本發明的HPPS納米顆粒可以，如上所述，用于局部應用。因此，本發明進一步提供 了一種治療皮膚的一種或多種狀況的方法，所述狀況選自由干性皮膚、光損害皮膚、老年 斑、老化皮膚、增加的角質層柔軟性、皺紋、細紋、光化性斑點、皮膚變色、以及魚鱗癬組成的 組，所述方法包括將根據本發明的任何組合物施加至具有所述一種或多種狀況的皮膚，其 中要被遞送的所述化合物是用于治療這樣的狀況的已知化合物，以其用于治療這樣的狀況 的已知的量遞送。如本文中所用的，術語"局部應用"是指將本發明的組合物施加或涂布到 皮膚的表面上。
[0188] 要在本發明的局部組合物中遞送的化合物可以包括皮膚活性成分。這樣的皮膚活 性成分的非限制性實例包括維生素 B3化合物，如授予Oblong等人的1997年10月30日公開的 PCT申請W097/39733中描述的那些，將其全部內容以引用方式并入本文中；類黃酮化合物； 羥基酸如水楊酸;表皮脫落或脫皮劑如兩性離子表面活性劑;防曬油如2-乙基己基-P-甲氧 基肉桂酸酯、4，4 叔丁基甲氧基二苯甲酰甲烷、奧克立林、苯基苯并咪唑磺酸;防曬乳如氧 化鋅和二氧化鈦;消炎劑;抗氧化劑/自由基清除劑如生育酚及其酯;金屬螯合劑，尤其是鐵 螯合劑;類維生素 A如視黃醇、棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、及視黃醛;N-乙酰 基-L-半胱氨酸及其衍生物;羥基酸如乙醇酸;酮酸如丙酮酸;苯并呋喃衍生物;脫毛劑(如 巰基化合物）；皮膚光亮劑(如，熊果苷、曲酸、對苯二酚、抗壞血酸及衍生物如抗壞血酸磷酸 鹽，胎盤提取物等）；抗脂肪團劑(如咖啡因、茶堿）；濕潤劑;抗微生物劑;抗雄激素劑；以及 護膚劑。也可以使用上面提及的皮膚活性物的任何的混合物。這些活性成分的更詳細的描 述在授予Blank等人的美國專利第5,605,894號中發現。優選的皮膚活性成分包括羥基酸如 水楊酸、防曬油、抗氧化劑及其混合物。可以通過施加旨在置于皮膚上的潤膚液、乳劑、凝 膠、乳化液、噴霧、調理物、化妝品、唇膏、粉底、指甲油或類似物形式的本發明的組合物來 實施局部應用，用于一些美容、預防性、治療性或其它益處。
[0189] 用于制備本發明的HPPS納米顆粒的方法
[0190] 納米平臺核心負載
[0191] 本發明提供了制備本發明的HPPS納米顆粒的方法。用于將藥劑并入LDL和HDL顆粒 中的現有技術方法在授予Zheng等人的PCT申請公開號WO 2006/073419(【公開日】：2006年7月 13日；PCT申請號PCT/US2005/011289)中概述，將其內容以引用方式并入本文中。
[0192] 在優選的實施方式中，通過在有機溶劑如，例如甲苯、苯、二氯甲烷，以及優選地氯 仿中合并適當的磷脂與不飽和膽固醇酯，接著蒸發溶劑和真空干燥來制備HPPS納米顆粒。 在約40-60°C超聲處理后加入緩沖劑產生乳液。向乳液中加入如上所述的適當的支架肽導 致球狀HPPS納米顆粒的優先形成。如果期望HPPS納米顆粒的核心-負載，則要被加載到核心 中的藥劑最初與磷脂和油酸膽固醇酯合并，并且隨后是同樣的程序。
[0193] 細胞表面受體配體的連接
[0194] 在用活性劑加載HPPS納米顆粒的核心后，HPPS納米顆粒的表面可以被修飾以連接 細胞表面受體配體。可替換地，也可以在加載活性劑的同時并入所述細胞表面受體配體，在 一些實施方式中，所述細胞表面受體配體共價地結合至本發明的HPPS納米顆粒的支架肽。
[0195] 將細胞表面受體配體連接至本發明的HPPS納米顆粒可以經由標準技術發生。HPPS 納米顆粒的支架肽可以包含可結合的氨基酸殘基如賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等。 在一個實施方式中，存在賴氨酸殘基，并利用已知的化學被偶聯至所述細胞表面受體配體。 例如，配體葉酸可以通過針對緩沖劑，即NaH 2P〇4/H3B03緩沖劑透析HPPS納米顆粒，經由增加 的pH連接到具有包含賴氨酸的支架肽的HPPS納米顆粒。葉酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯然后在 室溫下與HPPS納米顆粒反應10小時。在反應完成后，對混合物進行離心以去除任何降解的 HPPS納米顆粒。在最后的步驟中，可以針對EDTA緩沖劑透析粗HPPS-FA以將pH調節至7.4。
[0196] 顯著地，細胞表面受體配體如葉酸和EGFR特異性肽結合至HPPS納米顆粒的支架肽 并不影響它們與磷脂結合并形成納米載體的能力。并且，優選地，葉酸和EGFR特異性肽與 支架肽的賴氨酸殘基的結合將歸巢分子放置在兩親性螺旋的親水面與疏水面之間的過 渡處或附近。
[0197] 在另一實施方式中，除了細胞表面受體配體共價連接至HPPS納米顆粒的支架肽 外，細胞表面受體配體還可以經由將這些細胞表面受體配體錨定到被并入HPPS納米顆粒的 磷脂單層的脂質被呈現在HPPS納米顆粒的表面上。在一個實施方式中，所述脂質錨可以為 1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[葉酸（聚乙二醇）-2000](DSPE-PEG(2000); Avanti)〇
[0198] 在另一實施方式中，所述HPPS納米顆粒可以通過SR-B1受體介導的途徑由細胞攝 取。HDL靶向SR-B1 (凈化劑受體類型1，還稱作HDL受體），并且不受理論的約束，認為HPPS模 擬HDL's SR-B1特異性。由于癌癥（如乳腺癌）的一些類型顯著過度表達SR-B1受體，因此 HPPS具有選擇性靶向惡性細胞的潛力。此外，HPPS納米顆粒可以用于以基于HDL的Gd-MRI探 針相同的方式使脆弱的斑塊成像（Fayad group，Mt.Sinai New York:Frias et al.J.Am.Chem.Soc.2004；126:16316-7；Frias et al.Nano Lett.2006；6:220-4)〇
[0199] 下面的實施例說明通過SR-BI-介導的途徑在體外和體內由細胞攝取HPPS納米顆 粒。沒有HPPS內在化的貨運的初步證據表明HPPS納米載體特別可用于癌癥診斷劑和治療劑 的直接細胞溶質遞送。
[0200] 下面的實施例更詳細地解釋本發明。給出了下面的制備和實施例以使得本領域的 技術人員更清楚地理解和實施本發明。然而，本發明并不限于示例的實施方式的范圍，所述 實施方式僅旨在作為本發明的單一方面的說明，并且功能上等效的方法在本發明的范圍 內。確實通過前面的描述和附圖，本發明的除了本文描述的那些外的各種修改對于本領域 技術人員來說變得顯而易見。這樣的修改旨在落入所附權利要求的范圍內。
[0201] 將本文引用的每一參考文獻的全部內容以引用方式明確地并入。
[0202]實施例
[0203] 實施例1
[0204] 起始原料的制備
[0205] 1)大小對照肽（scPep)
[0206] 利用商業上可獲得的Ν-α-Fmoc保護的氨基酸、Sieber酰胺樹脂作為固體載體，以 及使用HBTU/HOBt作為羧基活化劑，通過利用Fmoc固相肽合成（SPPS)方案(Novabiochem， Resource for peptide synthesis: //www.emdbiosciences. com/g.asp?f = NBC/ peptideres.htm)，在肽合成儀PS_3(Protein Technologies，Inc ·)上合成兩親性螺旋的一 些短肽類似物，如Ac-DWLKAFYDKVAEKLKEAF(〃2F〃）、AC-DWFKAFYDKVAEKFKEAF( "4F"，在本文 中也稱為〃+4F〃））、和Ac-FAEKFKEAVKDYFAKFWD(-4F)。在合成受保護的序列后，用N，N-二甲 基甲酰胺(DMF)中20 %的哌啶去除肽-樹脂的N末端Fmoc以暴露末端胺。隨后用在具有10% 乙酸酐的四氫呋喃中的10 %吡啶帽化NH2-肽-樹脂。用95 %三氟乙酸和5 %三異丙基硅烷進 一步處理Ac-肽-樹脂以去除肽序列上受保護的基團并劈開固體載體。在通過過濾去除劈開 的固體樹脂后，濾液被濃縮并通過加入無水醚沉淀以產生scPep。色氨酸(W)的熒光被用于 確定HPPS的scPep含量。本領域技術人員已知的其他方法，如氨基酸分析，可以用于確定 HPPS的肽含量。具有自由側鏈胺基團的賴氨酸(K)被用于結合靶向配體。
[0207] 2)作為對于EGFR的靶向配體的EGFR-特異性肽(EGFp)
[0208] 合成肽序列，Fmoc-YHWYGYTPQNVI。在最終的Fmoc去除后，具有N-末端NH2基團的肽 NH2-YHWYGYTPQNVI從固體載體被切開。三個等摩爾量的辛二酸二-(N-羥基琥珀酰亞胺酯） (Sigma Aldrich)隨后被結合至DMS0中的EGFp的N末端，以形成EGFp-NHS。
[0209] 3)結合至磷脂的EGFp(EGFp-脂質）
[0210] 首先在DIPEA存在的情況下，在無水二甲亞砜(DMS0)中，以1:5的摩爾比使EGFp與 辛二酸二(N-羥基琥珀酰亞胺酯）反應以產生EGFp-N-羥基琥珀酰亞胺酯(EGFp-NHS)。隨后 在DMS0中，產物EGFp-NHS與1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二 醇）-2000]胺(DSPE-PEG(2000)胺，來自Avanti)以1:2的摩爾比孵育。在室溫下伴隨溫和的 混合的6小時孵育后，用過量二乙醚沖洗樣品。用二乙醚沖洗沉淀物3次以上，以去除任何未 反應的DSPE-PEG (2000)胺。包含終產物的沉淀物被干燥并重新懸浮在甲醇中。
[0211] 4)適于并入用于診斷和/或治療應用的HPPS納米顆粒的化合物在圖2中闡述并包 括近紅外熒光(NIRF)成像探針DiR-B0A( 1，Γ -雙十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基吲哚三碳菁 碘二油酸酯）和DIR(1，Γ -雙十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基吲哚三碳菁碘化物）JiR-BOA和 DIR可以分別作為核心-負載和表面-加載的NIRF探針合成用于HPPS。這兩種染料具有類似 的吸收和發射波長激發（ex. 748nm,em. 782nm) 〇 [0212] 5)磷脂
[0213] 適合于HPPS制備的磷脂包括但不限于DMPC(1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽 堿）、P0PC(1-棕櫚酰基-1-油酰基-磷脂酰膽堿)和EYPC(卵黃磷脂酰膽堿）。所有磷脂均從 Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster,Alabama,USA)貝勾買。
[0214] 實施例2
[0215]用于HPPS納米顆粒制備的方法
[0216] HPPS是完全溶于含水緩沖劑，如tris鹽水（10mM tris-HCl，150mM NaCl，ImM EDTA，pH 7.5)中的大分子復合體。1^8鹽水緩沖劑在下面概述的所有試驗中被用作用于 HPPS的溶劑。
[0217] 1 )HPPS:將3μπιο1的DMPC和0.3μπιο1的膽固醇油酸酯溶解在試管中的0.5mL氯仿中。 用仏緩慢蒸發掉溶劑并通過高真空進一步干燥。隨后將lmL的緩沖劑（10mM Tris-HCl，pH 8.0，包含0.1M KC1，ImM EDTA)加入到干燥試管中并在50°C超聲處理1小時以形成乳液。將 scPep 0.8μηιο1加入到溶液中以形成HPPS顆粒。所述顆粒隨后通過快速蛋白質液體層析法 (FPLC)純化。FPLC方法將在下面描述。
[0218] 2)DiR-B0A 核心-加載的 HPPS((DiR-BOA)HPPS):將 3μπιο1 的 DMPC和0·3μπιο1 的膽固 醇油酸酯和〇. 25μπιο1的DiR-BOA溶解在試管中的0.5mL氯仿中。用Ν2緩慢蒸發而去除溶劑并 通過高真空進一步干燥。將lmL的緩沖劑（10mM Tris-HCl，pH 8.0,包含0.1M KCl，lmM EDTA)隨后加入到干燥的試管中并在50°C超聲處理1小時以形成乳液。將scPep 0.8μπι〇1加 入到溶液中以聚集(DiR-BOA) HPPS顆粒。所述顆粒隨后通過FPLC純化。
[0219] 3)DiR表面-標記的HPPS(DiR-HPPS):利用基于由Pitas等人[J.Cell Biol.1985, 100,103-117 ]描述的初始方法的修改的程序，用親脂性近紅外染料DiR(l，l'_雙十八烷基-3，3，3 '，3 ' -四甲基Π 引噪三碳菁鵬化物）（ex · 748nm，em. 782nm) (Molecular Probes，Inc ·， Eugene，0R)標記HPPS。簡單地說，通過將3mg(3 · 2μηιο1)的DiR溶解在lmL二甲亞砜(DMS0)中 來制備DiR的儲備溶液;將0. lmL的儲液加入到0.5mL的HPPS溶液(30μΜ)中以產生40DiR與1 顆粒的最終摩爾比率。在黑暗中在37°C孵育該混合物18小時后，DiR表面-標記的HPPS(DiR-HPPS)通過超速離心（49,000rpm，20小時，4°C，Beckman 50Ti旋轉器)進行分離，針對包含 0.01 %EDTA的鹽水透析，并且過濾滅菌(0.45ym，Water Millex HV單位）。通過檢查HPPS濃 度(基于320nm處色氨酸熒光的肽濃度）和DiR濃度(基于782nm處DiR熒光）來確定DiR-HPPS 上的DiR加載。
[0220] 4)作為對于（DiR-BOA)HPPS 的靶向配體的 EGFp 結合的 scPep，EGFp-(DiR-B0A)-HPPS(類型1 EGFR-靶向的HPPS):根據圖3中描述的方案來合成EGFp-結合的DiR-BOA核心-加載的HPPS ((DiR-B0A)HPPS)。簡單地說，在試管中將3μπιο 1的DMPC、0.2μπιο 1的膽固醇油酸 酯和0.40μπι〇1的DiR-BOA溶解在氯仿中。通過用犯緩慢蒸發來去除溶劑并通過高真空進一 步干燥。隨后將lmL的緩沖劑加入到干燥的試管中并在50°C超聲處理1小時以形成乳液。然 后將scPep加入到溶液中以聚集（DiR-BOA)HPPS顆粒。通過在4°C下，分別針對pH = 9.0、 10.0、10.9的0.說似!^04,0.11!1必03緩沖劑進行透析，該顆粒溶液的？!1逐步從8.0增加到 10.9。隨后將無水DMS0中的活性配體分子（1.8μπιο1)，如EGFp-NHS或FA-NHS加入到顆粒溶液 中，并且將反應混合物在室溫下置于振蕩器上。在6小時反應后，混合物隨后在4°C下以 500rpm進行離心以去除任何沉淀物，隨后在4°C下針對EDTA緩沖劑（0.3mM EDTA，0.9 % NaCl，pH 7.4)透析過夜。在透析過程中46??-(0丨1?-8(^)-即?3的?!1返回到7.4，并且除去未 反應的配體起始原料。重復該透析過程直到不存在分光光度上可檢測的游離配體。所述顆 粒然后通過FPLC (FPLC法將在下面描述)純化。
[0221] 5)作為對于（D iR-BOA) HPPS 的靶向配體的 EGFp-脂質，EGFp-脂質（D i R-BOA) HPPS (類型2 EGFR-靶向的HPPS):如圖4所示，制備EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS的過程類似于(DiR-B0A)HPPS的制備過程。僅有的差別是在納米顆粒配制中將0.18μπι 〇1 EGFp-脂質(EGF肽結合 的磷脂)加入到3μπιο1的DMPC中。
[0222] 6)作為對于（DiR-BOA)HPPS的靶向配體的葉酸結合的scPep，FA-(DiR-BOA)-HPPS (類型1 FR-靶向的HPPS):按照圖3中描述的方案來合成FA-(DiR-BOA) -HPPS (用葉酸-NHS替 換EGFp)。
[0223] 7)作為對于(DiR-BOA)HPPS的靶向配體的葉酸-脂質，FA-脂質(DiR-BOA)HPPS(類 型2 FR-靶向的HPPS):按照圖4中描述的方案來合成FA-脂質(DiR-B0A)_HPPS(用葉酸-脂質 替換EGFp-脂質）。
[0224] 8)作為對于（DiR-BOA)HPPS的靶向配體的全長EGF，（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS:全長 重組人類EGF從R&D Systems，Inc · (Minneapolis，Minnesota，USA)購買。如上所述，配制 HPPS，具有30%的作為1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000 ]馬來酰亞胺(DSPE-PEG( 2000)馬來酰亞胺）的磷脂含量。將EGF與Traut ' s試劑(2-亞氨 基硫烷-鹽酸鹽）（Sigma)在pH 9.0下一起孵育以將反應性巰基基團引入至EGF。然后在室溫 下，在lmL的反應容積中，使巰基-EGF(16nmol)與HPPS(DSPE-PEG(2000)馬來酰亞胺）（0.1μ mol)反應24小時。孵育期后，通過FPLC來純化EGF-HPPS。
[0225] 實施例3
[0226] 利用4F制備的HPPS納米顆粒的表征
[0227] 1.顆粒和有效載荷穩定性:顆粒和有效載荷穩定性對于所有的基于納米顆粒的藥 物遞送系統是重要的。常規的基于脂質的納米載體(如，脂質體和脂質乳液)在超小尺寸(〈 25nm)時不能維持穩定性。本發明的HPPS納米載體系統表現出顯著的穩定性。如表4所示，在 一個月期間，HPPS維持它們的尺寸和DiR-BOA有效載荷，如通過動態光散射(參見下文)和熒 光分光光度法所確定的。在4°C下儲存后，沒有觀察到有效載荷泄漏。可以注意到，下面表中 的百分比表明具有所示尺寸的納米顆粒的群體的比例。
[0228] 表4.顆粒穩定性
[0229]
[0230] 注意:該表示出了平均尺寸、百分比組成和DiR-BOA熒光強度
[0231] 當使用EGF肽、全長EGF、和FA作為靶向配體時，全部三個劑型(配方）的穩定性似乎 在一個月期間相當。
[0232] 2 .顆粒表征：四種方法已經用于表征HPPS納米載體：1)快速蛋白質液相層析 (FPLC)，2)動態光散射(DLS)(納米分級機），3)透射電子顯微術(TEM)以及4)圓二色性(CD)。 [0233] 方法
[0234] 電子顯微鏡研究。裝備有數字圖像獲取系統的現代Hitachi H-7000透射電子顯微 鏡用于確定HPPS納米顆粒的含水分散體的形態和大小。將5微升的HPPS納米顆粒懸浮液置 于碳-涂覆的200目銅網上并且使得放置5分鐘。用拭鏡紙除去過多的樣品，并且施加5yL的 2%飽和含水醋酸雙氧鈾并使得放置20秒。隨后用濾紙排出著色劑，并在采集數字圖像之前 對銅網進行風干。所有的電子顯微鏡設備從Electron Microscopy Sciences(Fort Washington，PA)購買。
[0235] 動態光散射。通過光散射光子相關光譜學（Zetasizer Nan〇-ZS90;Malvern Instruments，Malvern，UK)，利用在633nm處操作的4 · OmW He_Ne激光器和90°的檢測器角 度，測量HPPS顆粒的粒度分布。假定球形顆粒經歷布朗運動來模型化數據。
[0236]快速蛋白質液相層析。在顆粒形成后，通過凝膠過濾層析，利用具有Akta快速蛋白 質液相層析（FPLC)系統（Amersham Biosciences，Pittsburgh，PA)的Superdex 200柱（60X 16cm)來純化期望尺寸的HPPS顆粒。用Tris緩沖鹽水（10mM Tris-HCl，pH 7.5,包含0.15M NaCl，ImM EDTA)以lmL/分鐘的流速來洗提顆粒。洗提的顆粒的大小通過比較它們的保留時 間與具有已知直徑的蛋白質的保留時間來確定：甲狀腺球蛋白（17. Onm)、脫鐵鐵蛋白 (12.2nm)、過氧化氫酶（10.4nm)、牛血清白蛋白（7. lnm)、α-胰凝乳蛋白酶(4.2nm)、以及核 糖核酸酶A(3.8nm)〇
[0237] 圓二色性(CD)分光鏡檢查。利用Jasco J-815CD分光計來記錄HPPS顆粒的遠-UV ⑶光譜。在25 °C下，以lnm步長，從260到190nm記錄⑶光譜。在5個連續的掃描上收集數據并 取平均數。ScPep的α螺旋二級結構通過在222nm處橢圓率的變化來監測。
[0238] 圖5示出了利用4F制備的未靶向的DiR-BOA加載的HPPS的FPLC、DLS和CD。從FPLC (圖5A)，可以收集HPPS顆粒的不同群體，如圖5B中所示。FPLC部分的CD分析揭示scPep的強 結合(α_螺旋標志的存在）。對于較小的顆粒可以看出朝向α螺旋的更高含量的趨勢。圖6示 出了FPLC測量與ΤΕΜ-致。ΤΕΜ顯示在60分鐘洗提的顆粒。FPLC示出了具有狹窄分布的顆粒 的高產率。TEM證實HPPS顆粒具有單分散的球形形態。FPLC、TEM和DLS數據（未示出）表明 EGFp結合的HPPS顆粒的直徑在ll-14nm的范圍內。
[0239] 3.DiR-B0A加載和靶向配體對HPPS大小的影響：發現HPPS的大小可以通過它們的 DiR-BOA有效載荷來控制。這里是實例:如下所示，制備了 2個HPPS配方(劑型）。
[0241] 如圖7所示，從每個制劑收集FPLC分布的單個部分。具有較低的DIR-B0A加載(#1) 的配方產生較小的HPPS顆粒的更均勻的分布。配方#2具有較高的DiR-BOA有效載荷(通過收 集的部分的更強的藍色著色表明）和更不均勻的顆粒群體。這些HPPS顆粒的大小大于配方# 1的大小。這些發現表明HPPS顆粒的大小可以通過貨物(DIR-BOA)加載來控制/調節。
[0242] 考慮到在配制具有較高劑量的DiR-BOA的顆粒時，HPPS顆粒的大小增大，對于HPPS "最終產物"的大小的一些控制可以通過調節加入到配方中的核心成分(D i R-B0A&膽固醇 酯）的量來實現。因此，增加/減少劑量的核心成分將導致增大/減小的尺寸的HPPS顆粒。這 在圖7C中示出。強正相關系數在HPPS的大小與其DiRBOA有效載荷(R = 0.91)之間確定。
[0243] 當使用EGF肽和全長EGF作為用于HPPS的靶向配體時，形成的HPPS顆粒比用FA制備 的HPPS顆粒稍小(3-5nm)。所述肽和全長EGF似乎限制HPPS的大小。
[0244] 4.用4F和-4F形成的（DiR-BOA)HPPS的比較：
[0245] 利用3·0μπιο1 DMPC、0.2ymol膽固醇油酸酯、0.2ymol DiR-BOA、和2mg的4F或-4F， 如上所指出的，制備(DiR-BOA)HPPS納米顆粒。
[0246] 如圖8(a)所示，FPLC分布顯示出對于-4F(DiR-B0A)HPPS僅一個峰，而對于4F(DiR-B0A)HPPS有兩個峰。因此，4F和-4F均用于形成均勻的納米顆粒。
[0247] 如圖8 (b)所示，TEM成像揭示用-4F形成的（D i R-B0A) HPPS的球形比用4F形成的 (DiR-BOA)HPPS 更均勻。
[0248] 實施例4
[0249] HPPS的體外和體內評估
[0250]除非另外指明，否則在這些研究中所用的scPep為4F。
[0251]在下面提及HPPS的濃度的情況下，這些指的是由HPPS攜帶的DiR-BOA的濃度。為了 確定[DiR-ΒΟΑ]，繪制了DiR-B0A熒光與DiR-B0A濃度的標準曲線。用氯仿-甲醇(2:1，v: v)從 HPPS顆粒提取DiR-BOA。重復提取兩次，并收集氯仿層，然后用快速真空干燥。將殘留物重新 懸浮在lmL的氯仿-甲醇(2:1， v:v)中，并在熒光計上讀取熒光。根據熒光讀數，可以從標準 曲線確定HPPS顆粒中的DiR-BOA的濃度。
[0252] HPPS的濃度還可以基于肽濃度來確定。可以通過Bradford分析試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Inc .Hercules，CA)來確定HPPS的肽濃度。在這樣的計算中，假定每個HPPS顆 粒包含22個肽。
[0253] 對于體內試驗，tris鹽水是用于給予HPPS的緩沖劑。注射的體積通常為250-350μ L〇
[0254] 實驗動物和異位腫瘤的誘導。下面描述了各種腫瘤異種移植模型。這里我們介紹 了用于制備具有腫瘤異種移植物的小鼠的一般方法。成年雌性裸鼠（8-12周大)在整個研究 中被允許自由獲取食物和水。將癌細胞(通常在中3 X 106個)皮下接種到裸鼠的右側中。 將腫瘤接種后1到3周小鼠（具有約5mm的腫瘤尺寸)用于指定的研究。
[0255] A.EGFp(DiR-BOA)HPPS(類型 1 EGFR-靶向的 HPPS)的體外研究：
[0256] 利用共聚焦顯微鏡研究，在具有不同EGFR表達水平的癌細胞上(A549和MT1:高表 達，HepG 2:中等表達，H520 :低表達）檢測EGFp (DiR-B0A)HPPS的EGFR-靶向特異性。利用 Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡進行共聚焦研究。在具有10%胎牛血清(FBS)的 0.2mL 的 RPM1 1640 細胞培養介質中，A549、MT1 和 H520 細胞與 3μΜ 的 EGFp(DiR-BOA)HPPS(這 里和下面的體外和體內試驗中表達的濃度是DiR的濃度)孵育。如圖9所示，在5小時和24小 時孵育后，A549和MT1細胞呈現出具有高于H520細胞的EGFp(DiR-BOA)HPPS攝取，表明HPPS 的EGFR-靶向特異性。
[0257] 利用流式細胞術研究來進一步確認EGFp(DiR-BOA)HPPS的EGFR-特異性，在這些研 究中，細胞與EGFp(DiRBOA)HPPS孵育3到24小時，隨后在FV 500流式細胞儀上進行分析。圖 10表明在與Ι.ΙμΜ的EGFp(DiR-BOA)HPPS孵育后在MT-1與H520細胞中HPPS的較高攝取。圖11 示出了利用過量的EGFp(lOyM)作為競爭性抑制劑，MT-1細胞中HPPS的攝取減少。
[0258] B.EGFp(DiR-BOA)HPPS 的體內研究
[0259] 體內NIR熒光成像。EGFp(DiR-BOA)HPPS經由尾靜脈以250yLtris-鹽水中5.2nmol 的濃度被給予小鼠。在注射前、注射后1、5、和24小時進行體內熒光成像。用CRI Maestro?體 內成像系統獲得熒光圖像。用氯胺酮/乙酰丙嗪(50/5mg/kg i.p.)麻醉小鼠并將其俯臥放 置入1&^81：1'〇成像儀的避光室中。用深紅濾光鏡(61 = ，6111 = 750111]1長度穿過(730-950，10nm步中））和150msec的曝光時間來獲得熒光圖像。代表性圖像示于圖12中。到24小 時，MT1腫瘤內的熒光強度清楚地可見，表明HPPS被EGFR-表達的腫瘤的優先攝取。
[0260] 為了生物分布研究，收獲小鼠（EGFp(DiR-BOA)HPPS注射后24小時）的器官/組織 (MT-1腫瘤、肝臟、脾臟、心臟、肌肉、腎和腎上腺）、稱重并在PBS中勻化。隨后將勻漿與3倍過 量的CHC13 :Me0H(2:1)混合物合并，并渦旋2分鐘。隨后將溶液以3，000rpm離心2分鐘。利用 Horiba JobinYvon Fluoromax-4焚光分光光度計，測量各種樣品的焚光強度(ex.748nm; em.782nm)。熒光信號對于樣品重量被規格化，并且比率相對于肌肉和腫瘤組織表示（參見 圖⑵。
[0261] C.EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS(類型2 EGFR-靶向的HPPS)的體內研究：用Cytomics FC 500 Series Flow Cytometry System(Beckman Coulter,Inc.Mississauga,Ontario, Canada)進行一系列流式細胞術試驗，以評估EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS的EGFR-特異性。細 胞培養實驗在具有10 %胎牛血清(FBS)中的0.2mL的RPM1 1640細胞培養介質中進行。首先， 如圖13中所示，在與1. ΙμΜ的EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS孵育3小時后，A549細胞具有比H520 細胞更高的HPPS攝取。這些結果表明EGFp-脂質（D iR-B0A) HPPS在A549細胞中的EGFR-特異 性積聚。EGFR-特異性被進一步呈現在圖14中，表明在具有不同EGFR表達水平的細胞系中 HPPS的時間依賴性攝取。
[0262] EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS的EGFR-特異性的進一步證據示于圖15中。9倍過量的 EGFp的使用明顯地抑制表達高或中等水平EGFR的細胞中該類型2 EGFR-靶向的HPPS(右）的 攝取，其與從類型1 EGFR-靶向的HPPS(左)獲得的結果一致。
[0263] D.EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS的體外初步毒性研究：為了證實這些生物相容的納米 載體確實是無毒的，利用MTT和流式細胞術分析進行體外毒性研究。為了評估毒性，通過流 式細胞術在A549細胞中研究濃度依賴性HPPS攝取。細胞培養實驗在具有10%胎牛血清 (FBS)的0.2mL的RPM1 1640細胞培養介質中進行。由于在所有先前研究中使用的EGFp-脂質 (DiR-BOA)HPPS的標準藥物劑量是1. ΙμΜ，所以EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS的藥物-劑量依賴 性細胞內攝取通過增加藥物劑量來檢驗。如圖16c所示，2倍的標準劑量(2.2μΜ)導致攝取飽 和。因此，決定使用直到6倍劑量(6.6μΜ)用于毒性評價。如在圖16a (ΜΤΤ分析)和圖15b (流式 細胞術分析)中看到的，在MTT和流式細胞術試驗中沒有觀察到毒性。
[0264] E.EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS 的體內研究：為 了評價 EGFp-脂質（DiR-BOA)HPPS 的體 內表現，檢驗了幾個腫瘤模型。
[0265] 1) MT1腫瘤異種移植物：具有MT1腫瘤的雌性裸鼠在靜脈內注射1.8nmo 1 (25 0μ 1 tris-鹽水）的EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS(圖17)后的幾個時間點通過CRI Maestro?成像儀 進行檢驗。對于成像方法，參見體內EGFp (DIR-B0A) HPPS研究部分4B。觀察到在所述時間過 程期間，納米顆粒顯不出優先在MT1腫瘤異種移植物中積聚，在24_48h達到最大。在72h， HPPS開始從腫瘤區清除。
[0266] 2)人類肺原發腫瘤異種移植物:EGFp-脂質(DiR-BOA)HPPS(l ·8nmol)的體內表現 還在表達EGFR的原發腫瘤異種移植物中進行評價。如圖18所示，頂行示出了腎上的原發腫 瘤，而底行示出了胸部上的原發腫瘤。利用體內實時NIR熒光成像，清楚的是，HPPS顆粒在 注射后24小時期間在兩個原發腫瘤部位積聚。結果還通過成像切除的組織和腫瘤來證實。 來自體內的組織/腫瘤成像以類似于整個動物成像的方式進行。（熒光圖像在Maestro成像 儀上用深紅色濾光鏡（ex = 671-705nm，em = 750nm長度穿過(730-950，10nm步中）和150msec 的曝光時間獲得）。
[0267] F.FA(DiR-B0A)HPPS 的體外研究：為 了證實 FA(DiR_B0A)HPPS 的葉酸受體(FR)-靶 向，HPPS與表達FR的細胞(KB細胞，人類表皮樣癌細胞)和缺乏FR的細胞(HT-1080細胞，人類 纖維肉瘤細胞)孵育。在〇.2mL具有10%胎牛血清(FBS)的RPM1 1640細胞培養介質中進行細 胞培養實驗。共聚焦成像研究（圖19)表明，在與FA(DiR-B0A)HPPS(1100ng/mL)孵育4h后，在 整個KB細胞的細胞質看到強DiR-BOA熒光，表明FR靶向的HPPS納米顆粒的高攝取(頂行hFA (DiR-BOA)HPPS的FR-介導的攝取通過另外的對照實驗來確認。首先，當KB細胞與伴隨過量 FA的FA(DiR_B0A)HPPS孵育時，FA(DiR_B0A)HPPS的攝取被FA競爭性抑制（中行）。第二，HT-1080細胞(FR陰性）中顯著熒光的缺乏，表明FA(DiR-B0A)HPPS的急切攝取依賴于FR介導的 過程(底行）。共同地，這些結果提供了 FA(DiR_B0A)HPPS有效靶向FR的強大證據。
[0268] G ·與-4F形成的（DiR-B0A)HPPS( "(-4F) (DiR-B0A)HPPS"）的體外研究：HDL靶向并 結合至SR-B1 (凈化劑受體類型1，還稱作HDL受體）。認為，HPPS可以模擬HDL的SR-B1特異性， 并且HPPS的核心成分可以經由SR-B1受體-介導的途徑被細胞攝取。
[0269] (-4F)(DiR-B0A)HPPS納米顆粒如實施例3,部分4所述制備。兩個細胞系被用于證 實HPPS(DiRBOA)的核心材料通過SR-B1途徑由細胞攝取的假說:稱為ldlA(mSR-Bl)的SR-B1 +細胞系和稱為LDLA7的SR-B1-細胞系(Krieger，MIT)。羧基熒光素標記的磷脂(DSPE-PEG-CF)(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[聚（乙二醇)2000-N'_羧基熒光素])被用 于追蹤結合至SR-B1后HPPS的磷脂成分的命運(結局）。類似地，焚光素標記的4F肽被用于追 蹤肽成分的命運(圖20)。
[0270] DSPE-PEG-CF從Avanti Lipids購買。HPPS的熒光素標記如制造商的說明所建議的 進行。簡單地說，如上所述制備HPPS，并針對0.1M碳酸鈉緩沖劑(pH 9)透析。將FITC(Sigma) 以lmg/mL的濃度溶解在無水DMS0中。然后將FITC以1:1(FITC:HPPS肽）的摩爾比加入到 HPPS中。在緩和和持續地攪拌HPPS溶液的同時，非常緩慢地加入FITGHPPS-FITC溶液在黑 暗中被孵育，并且反應在4°C下持續8小時。在該反應期間后，HPPS針對Tris-緩沖鹽水進行 透析，并且未結合的FITC通過FPLC去除。
[0271] 同時，將近紅外熒光探針DIR-B0A核心-加載到具有膽固醇油酸酯的HPPS中，以追 蹤貨物的命運。HPPS貨物被SR-B1+細胞的特異性-攝取通過流式細胞儀，利用基于HDL的競 爭性抑制來量化。每個HPPS成分的亞細胞命運通過共聚焦成像來可視化。通過共聚焦顯微 鏡產生的三維圖像允許定位每個標記的成分的命運，不管它是在細胞的表面還是內部(亞 細胞區室）。
[0272] 圖21示出了（DiR-BOA)HPPS對于SR-B1受體的特異性。簡單地說，SR-B1陽性和陰性 細胞(分別為ldlA(mSR-Bl))和LDLA7)，每種20，000個，對于LDLA7在Hams F-12介質（1 %青 霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中被培養，并且對于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和 +300yg/mL G418中被培養。隨后這些細胞與(DiR-BOA)HPPS顆粒（1100ng/mL)孵育3小時。在 另外的抑制實驗中，細胞暴露于(DiR-BOA)HPPS和HDL(50摩爾過量的；400yg;2.2X10- 4M)。 在3小時孵育后，共聚焦圖像顯示(DiR-BOA)HPPS在SR-B1陽性細胞（ldlA(mSR-Bl))中的強 攝取，但是在SR-B1陰性細胞(LDLA7)中沒有顯示。此外，過量的HDL有效抑制(DiR-BOA)HPPS 在ldlA(mSR-Bl)細胞中的攝取。
[0273] 圖22示出了在結合至SR-B1后HPPS的每個成分的命運。類似地，20,000個細胞 (ldlA(mSR-Bl)在具有10%胎牛血清的RPM11640細胞培養介質中進行培養。FITC-脂質或 FITC- (-4F) (D i RB0A) HPPS (1100ng/mL)與所述細胞孵育 1 小時。
[0274] 其后，共聚焦成像被用于鑒定與ldlA(mSR-Bl)細胞孵育后FITC-脂質（DiR-BOA) HPPS和FITC-(-4F)(DiR-B0A)HPPS的每個成分的亞細胞定位。發現HPPS可以與SR-B1結合并 將DiR-BOA直接釋放到細胞溶質中，而大多數標記的-4F肽和磷脂停留在細胞的表面上。
[0275] 來自HPPS納米顆粒的DiR-BOA的釋放在圖23中進一步示出。在ldlA(mSR-Bl)與 (DiR-BOA)HPPS的3小時孵育后，來自DiR-BOA的熒光信號僅在未沖洗的細胞的細胞溶質內 可以觀察到。由于DiR-BOA在HPPS的小核心內經歷的自我-猝滅作用，因此在細胞外部，對 于DiR-BOA很少到沒有信號可以被看到。一旦(DiR-BOA)HPPS結合至SR-B1并在靶細胞中釋 放DiR-B0A，DiR_B0A信號的信號強度增加。所述細胞的非常大的胞內體積允許DIR-B0A分子 分散在整個細胞溶質中，并因此克服自我-猝滅作用。
[0276] 流式細胞術研究被用于評價(-4F)(DiR-B0A)HPPS在SR-ΒΓ和SR-ΒΓ細胞系中的攝 取。5X10 5個細胞/孔在12-孔板中被培養2-3天。使用具有10%FBS的RPMI 1640培養基作為 細胞培養基。細胞在各種條件下被處理5小時。FC500被用于測量細胞的熒光強度。
[0277] 為了研究-4F肽對顆粒攝取的影響，在SR-ΒΓ和SR-ΒΓ細胞系中，由DiR_B0A、DMPC 和-4F制備的HPPS與由DiR-BOA和DMPC制備的乳液進行比較。DiR-BOA的最終濃度為1， 100ng/mL 〇
[0278] 圖24示出了-4F對于(DiR-BOA)HPPS顆粒的有效細胞攝取的要求。將llOOng/mL的 (DiR-BOA)HPPS的溶液和DiR-BOA的無肽乳液暴露于ldlA(SR-Bl)和LDLA7細胞3小時。細胞 培養實驗對于LDLA7在Hams F-12介質（1%青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中進 行，并且對于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和+300yg/mL G418中進行。在孵育期后，細胞通過 流式細胞儀進行檢驗。SR-B1陽性細胞(ldlA(mSR-Bl))內在化比DiR-BOA乳液高得多的水平 的(DiR-BOA)HPPS(3 · 5x)。LDLA7 (SR-B1 陰性細胞)攝取最小量的(DiR-BOA)HPPS或乳液。
[0279] 圖25示出了 ldlA(mSR-Bl)細胞中-4F(DiR-B0A)HPPS的濃度-依賴性攝取。對于 ldlA(mSR-Bl)，細胞培養實驗在0.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中進行。SR-B1陽性細 胞（ldlA(mSR-Bl)與從13.8到1100ng/mL范圍的不同濃度的-4F(DiR-B0A)HPPS孵育3小時。 流式細胞術分析揭示-4F(DiR-B0A)HPPS的攝取與顆粒的孵育劑量成比例。增加量的-4F (DiR-BOA)HPPS 導致增加量的伴隨 ldlA(mSR-Bl)細胞的 DiR-BOA。ldlA(mSR-Bl)細胞中-4F (DiR-BOA)HPPS的飽和攝取發生在440ng/mL處。
[0280] HDL以劑量依賴方式抑制（-4F)(DiR-B0A)HPPS的攝取（圖26)。對于ldlA(mSR-Bl)， 細胞培養實驗在〇.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中進行。ldlA(mSR-Bl)細胞與HDL和 (-4F) (DiR-BOA)HPPS(摩爾比從0 :1 到50 :1 范圍；HDL濃度從9.0 X 10-7到2.2 X 10-4摩爾范 圍）孵育3小時。增加濃度的HDL抑制ldlA(mSR-Bl)細胞中（_4F)(DiR_B0A)HPPS攝取，具有增 加的效率。在50:1摩爾過量的HDL處觀察到(_4F)(DiR_B0A)HPPS細胞攝取的接近完全的抑 制。這些結果進一步證實(_4F)(DiR_B0A)HPPS的SR-B1介導的攝取。
[0281] 圖27進一步示出了（-4F)(DiR-B0A)HPPS在SR-ΒΓ細胞中的選擇性攝取，以及該攝 取被HDL的抑制。2X10 4個細胞/孔SR-ΒΓ和SR-ΒΓ細胞在8孔蓋玻片室中被培養2-3天。具有 10%FBS的RPMI 1640培養基被用作細胞培養基。在共聚焦研究前1天，所述細胞培養基被變 成沒有FBS的RPMI 1640培養基。細胞在各種條件下被處理5小時。
[0282] 掃描共聚焦顯微鏡也被用于評價細胞中（_4F)(DiR_B0A)HPPS的攝取（圖27)。細胞 培養實驗對于LDLA7在Hams F-12介質（1%青霉素/鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中進 行，并且對于ldlA(mSR-Bl)在Hams F-12和+300yg/mL G418中進行。簡單地，2.39yg/mL的（-4F) (DiR-BOA)HPPS 與 ldlA(mSR-Bl)和 LDLA7 細胞孵育 3 小時。孵育期后，在 ldlA(mSR-Bl)中 觀察到顯著的熒光信號，但在LDLA7中沒有觀察到。在類似的抑制研究中，HDL(50倍過量； 2.2 X 10-4M)與(-4F) (DiR-BOA)HPPS-起孵育。3小時孵育后，在ldlA(mSR-Bl)中沒有檢測到 熒光，表明HDL完全阻斷ldlA(mSR-Bl)中（-4F)(DiR-B0A)HPPS的攝取。在LDLA7細胞中沒有 檢測到熒光。
[0283] 圖28示出了ldlA(mSR-B 1)細胞中（4F和-4F) (DiR-B0A)HPPS攝取的效能。細胞培養 實驗對于ldlA(mSR-Bl)在0.2mL的Hams F-12和+300yg/mL G418中進行。14到220ng/mL的 (4F和-4F)(DiR-B0A)HPPS與ldlA(mSR-Bl)細胞孵育3小時。流式細胞術揭示HPPS的兩個劑 型均以劑量依賴的方式在ldlA(mSR-Bl)細胞中被攝取。（_4F)(DiR_B0A)HPPS顯示出比其4F 對應物稍高的細胞攝取。
[0284] 與-4F形成的（DiR-B0A)HPPS( "（-4F)(DiR-B0A)HPPS"）的體內研究：利用 Maestro系統的體內成像在具有人類KB(SR-BI + )腫瘤異種移植物的裸鼠上進行（圖29)。在_ 4F(DiR-B0A)HPPS(5.2nmol;350yL tris-鹽水)注射后直到72小時收集光學圖像。可以看到 DiR-BOA熒光信號在早到注射后8小時選擇性地定位在KB腫瘤異種移植物中。也示出了切除 的器官的熒光圖像。
[0285] I.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(全長EGF作為靶向配體）的體外研究：利用共聚焦顯微 鏡研究在具有不同EGFR表達水平(A549:高表達，H520 :低表達）的癌細胞上檢驗(_4F)EGF (DiR-BOA)HPPS的EGFR-靶向特異性。細胞培養實驗在0.2mL具有10%胎牛血清(FBS)的RPM1 1640細胞培養介質中進行。簡單地說，共聚焦研究在與Ι.ΟμΜ的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS(這 里表示的濃度和下面的體外和體內試驗中的濃度是DiR的濃度)孵育的A549和H520細胞上 進行。圖30(a)示出了 A549細胞具有高于H520細胞的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS攝取。然而，應 當注意，（_4F)(DiR_B0A)HPPS的攝取在A549中比在H520細胞中也明顯更高。對于A549和 H520進行多個表面受體蛋白的蛋白質印跡分析（圖30(b))。相對于H520細胞，EGFR在A549細 胞中過度表達。SR-B1表達在兩個細胞系之間是相當的，而葉酸受體水平與A549相比似乎在 H520中過度表達。
[0286] (-4F)(DiR-B0A)HPPS和（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(l·0μM)與H520、A549和EGFR-GFP-A549細胞孵育3小時。如前所述，細胞培養實驗在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的 RPM1 1640細胞培養介質中進行。流式細胞術數據表明（_4F)(DiR_B0A)HPPS在所有3種細胞 中相等地被攝取。HDL(400yg)也相等地抑制這些顆粒在這些細胞中的攝取(參見圖31)。（_ 4F)EGF(DiR-B0A)HPPS在A549和EGFR-GFP-A549中的攝取大大地超過H520的攝取。HDL的存 在減少但是不消除（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在三個細胞系中的攝取。（_4F)EGF(DiR_B0A) HPPS在A549和EGFR-GFP-A549細胞中的殘余攝取反映了在EGFR/SR-B1陽性細胞中該顆粒的 EGFR介導的攝取。
[0287] 為了確定什么角色SR-B1可以有助于EGF-HPPS的攝取，SR-B1陰性細胞、LDLA7被共 轉染有用于EGFR和綠色熒光蛋白（GFP)的基因。該實驗去除了SR-B1可以對于EGF-HPPS的細 胞攝取進行的任何貢獻。如前所述，細胞培養實驗在Hams F-12介質（1%青霉素/鏈霉素， 2mM L-谷氨酰胺和5%FBS)中進行。在與（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)孵育3小時后， EGFR-GFP-LDLA7細胞顯示出在細胞溶質內的DiR-BOA的強信號，而對于EGFR的GFP信號在外 質膜上被可視化（圖32)。進行共聚焦研究以評價HDL對（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS在EGFR-GFP-LDLA7細胞中攝取的作用（圖33)。如在GFP道中可以看到的，被成功轉染有EGFR和GFP 的LDLA7細胞構成性地表達熒光。在用(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(1.0yM)處理后，可以在細胞 內檢測到DiRBOA信號（DiR道）。當用（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS處理的期間加入過量的HDL (400yg)時，來自DiRBOA的熒光信號在整個處理的細胞中仍可看到。EGFR-GFP-LDLA7細胞中 (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS攝取的程度在有或沒有HDL競爭的情況下是類似的。因此，HDL對于 EGFR-GFP-LDLA7細胞中（-4F) EGF (DiR-B0A) HPPS的攝取沒有影響。這些發現表明EGFR-GFP-LDLA7細胞中（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的特異性EGFR介導的攝取。
[0288] EGFR-GFP-A549 和 H520 細胞與 1.0yM(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS 孵育 3 小時。細胞培養 實驗在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的RPM1 1640細胞培養介質中進行。3小時孵育期 后，共聚焦成像顯示EGFR-GFP-A549細胞中的強熒光（圖34)。過量HDL的存在稍微減少這些 細胞中的熒光信號。過量HDL和EGF的組合將EGFR-GFP-A549細胞中的熒光信號顯著減少到 類似于在單獨的細胞對照中看到的水平。沒有H520處理組呈現出DiR-BOA熒光。這表明H520 并不攝取任何（-4F) EGF (D iR-B0A) HPPS。
[0289] 在圖35中，（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(l .ΟμΜ)與A549和H520細胞孵育。細胞培養實 驗在具有10%胎牛血清(FBS)的0.2mL的RPM1 1640細胞培養介質中進行。在該孵育期期間 還加入HDL(400yg)以消除SR-B1對于攝取過程可能具有的任何貢獻。所述細胞在HPPS暴露 后1、3和6小時被監測。在HDL存在的情況下，A549表現出大大高于H529的（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS的攝取，然而，在HDL(插入物)缺乏時，A549和H520之間的熒光信號的差異顯著減 少。這些發現表明SR-B1有助于SR-B1/EGFR陽性細胞中（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS的攝取。
[0290] J.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(作為靶向配體的全長EGF)的體內研究：圖36示出了在 (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(在tris-鹽水中的5.2nmol)靜脈內注射后多個時間處具有A549和 H520腫瘤異種移植物的裸鼠的體內光學圖像。在注射后早期，熒光信號在整個動物中被看 到。到22小時，聚焦信號可以在A549和H520中被看到，而身體的其余部位中的熒光信號極大 地減少。該強熒光信號在整個研究期間保持在A549腫瘤中；然而，到3天，H520腫瘤中的信號 被清除。這些結果表明A5 49腫瘤中的EGFR有助于積聚和保持（-4F) EGF (D i R-BOA) HPP S，而 H520中的攝取是非特異性和短暫的。
[0291] 1(.〇腫瘤異種移植物中（-4?沾6?(0丨1?-8(^)冊?3的體內研究：圖374示出了在（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS(5.2nmol，tris-鹽水中）的i.v.注射后多個時間處具有KB腫瘤異種 移植物的裸鼠的體內光學圖像。僅腫瘤組織被DiR-BOA熒光增強，其在48h處達到最大。圖 37B中，（-4F) (DiR-BOA)HPPS(HPPS) (5 · 2nmol，tris-鹽水中）、（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS (EGF-HPPS) (5 · 2nmo 1，tri s-鹽水中）和EGF-HPPS+HDL(5 · 2nmo 1 和0 · 14μπιο 1，tri s-鹽水中） 顆粒的生物分布在具有KB異種移植物的小鼠中被評估。生物分布圖均顯示DiR-BOA在腫瘤 中的高攝取，超過除了肝臟的所有其他正常器官。EGF-HPPS的腫瘤攝取高于HPPS或EGF-HPPS+HDL 的攝取。在圖 37C 中，HPPS、（-4F)PEG(DiR-B0A)HPPS(PEG-HPPS)(PEG-HPPS 按照圖 3 中描述的方案合成（用1，2_二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）_ 2000 ] (DSPE-PEG(2000)代替EGFp)和EGF-HPPS的循環半衰期在正常裸鼠中進行確定。所有 動物接受tri s-鹽水中5.2nmo 1的各自的納米顆粒的靜脈內注射。在納米顆粒注射前和注射 后的多個時間收集血液樣品。DiR-BOA從血液樣品提取，并且其熒光在熒光計上進行確定。 循環半衰期被測定為大約14h，與迄今最佳設計的納米載體相當。最后，圖37D示出了具有已 經用紅色熒光蛋白穩定轉染的雙KB腫瘤異種移植物的小鼠。在注射EGF-HPPS (5.2nmo 1， tris-鹽水中）后，可以看到，DiR-BOA的熒光與紅色熒光蛋白的信號緊密重疊。這些結果表 明EGF-HPPS納米顆粒可以有效地靶向表達EGFR的腫瘤。
[0292] L.(-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的特異性EGFR介導的細胞攝取與非特異性組織積聚的 體內確認
[0293] 具有KB(EGFR+'ve)和H520(EGFR-'ve)腫瘤異種移植物的裸鼠被天然HDL(0.14y 111〇1，杜丨8-鹽水中）隨后緊接(-4卩迮6卩(0丨1?-8(^)冊?3(5.211111〇1，杜丨8-鹽水中）靜脈內共注 射。注射后48小時，殺死小鼠，并切除腫瘤。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗組織，然后將40mg 的每個組織用于"組織分析"。類似地，將150mg的每個組織用于"細胞分析"。
[0294] 組織分析。組織樣品在roS中被勻化，接著如先前在B部分中（"EGFp(DiR-B0A)HPPS 的體內研究"）描述的進行氯仿；甲醇提取。測量提取物的組織熒光并表示為每單位(mg)組 織的熒光。
[0295] 細胞分析。在勻化后，利用尼龍篩（孔徑大小70μπι)過濾樣品以去除碎片。隨后用 PBS沖洗過濾的樣品（釋放的細胞)兩次，并用紅血球裂解緩沖液(0.1 %碳酸氫鉀、0.8%氯 化銨、Ο. ImM EDTA)處理10分鐘以去除紅血球。利用倒置顯微鏡用血細胞計對細胞計數。其 后，用氯仿：甲醇提取細胞(如上所述）。測量細胞提取物的熒光并表示為每百萬個細胞的熒 光。
[0296] 在組織和細胞水平上（-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS攝取的比較在圖38中示出。當從組 織水平觀察時，KB和H520腫瘤異種移植物將(_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS積聚到相等的程度。相 反地，當在細胞水平檢查時，KB細胞比H520攝取更高程度(2x)的（_4F)EGF(DiR_B0A)HPPS。
[0297] (-4F)EGF(DiR-B0A)HPPS的組織積聚反映了由于增強的滲透性和保留機制的顆粒 的細胞外誘捕以及上皮細胞中顆粒的胞內攝取的復合。當分離細胞并去除來自胞外因素的 貢獻時，出現不同的結果。HPPS的EGFR介導的攝取的較清楚的圖片被顯示，此外，由于天然 HDL的共注射，SRBI對HPPS攝取的貢獻也被最小化。共同地，這些結果證實（-4F)EGF(DiR-BOA)HPPS納米顆粒的EGFR靶向特異性。
【主權項】
1. 一種非天然存在的肽-脂質納米支架，包括： a) 至少一種磷脂； b) 至少一種不飽和脂質，優選不飽和固醇酯，進一步優選不飽和膽固醇酯，進一步優選 膽固醇油酸酯；以及 c) 至少一種肽，所述肽包括能夠形成至少一個兩親性α-螺旋的氨基酸序列，其中，所述 至少一個兩親性α-螺旋或肽的長度在6到30個氨基酸之間； 其中，使成分a)、b)和c)結合以形成結合至革El細胞上的SR-Bl的肽-磷脂納米支架。2. 根據權利要求1所述的肽-脂質納米支架，進一步包括： d) 至少一種歸巢分子，并且 其中，使成分a)、b)、c)以及d)結合以形成所述肽-磷脂納米支架。3. 根據權利要求2所述的肽-脂質納米支架，其中，所述至少一種歸巢分子共價結合至 所述至少一種磷脂。4. 根據權利要求2所述的肽-脂質納米支架，其中，所述至少一種歸巢分子共價結合至 所述至少一種肽。5. 根據權利要求4所述的肽-脂質納米支架，其中，所述至少一種歸巢分子在所述兩親 性α-螺旋的親水面與疏水面之間的過渡處或附近在氨基酸處結合至所述肽。6. 根據權利要求5所述的肽-脂質納米支架，其中，結合至所述歸巢分子的所述肽的氨 基酸選自由賴氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸和絲氨酸組成的組，優選賴氨酸。7. -種藥物劑型，包括根據權利要求1-6中任一項所述的非天然存在的肽-脂質納米支 架。8. -種制備根據權利要求1所述的非天然存在的肽-脂質納米支架的方法，包括在適于 形成所述肽-脂質納米支架的條件下結合成分a)_e)。9. 一種非天然存在的肽-脂質納米支架，包括： a) 至少一種磷脂； b) 至少一種不飽和脂質，優選不飽和固醇酯，進一步優選不飽和膽固醇酯，進一步優選 膽固醇油酸酯； c) 至少一種肽，所述肽包括能夠形成至少一個兩親性α-螺旋的氨基酸序列，其中，所述 至少一個兩親性α-螺旋或肽的長度在6到30個氨基酸之間；以及 d) 至少一種活性劑，所述活性劑包括雙鏈RNA; 其中，使成分a)、b)、c)以及d)結合以形成所述肽-磷脂納米支架;并且其中，所述肽-磷 脂納米支架結合至祀細胞上的SR-Bl并且其中所述活性劑在所述納米顆粒結合至SR-Bl之 后被釋放到所述靶細胞的細胞溶質中。10. 根據權利要求1所述的肽-脂質納米支架在制備用于預防或治療與SR-Bl受體的表 達相關的疾病的藥物中的應用，所述肽-脂質納米支架進一步包括治療劑，并且其中所述疾 病是可用所述治療劑預防或治療的。
【文檔編號】A61K47/48GK105903029SQ201610245387
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2008年12月12日
【發明人】鄭崗, 張智紅, 艾安·科爾賓, 陳涓
【申請人】大學健康網絡