免疫原性增強的多糖-蛋白質綴合物及其快速高產的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及免疫原性增強的多糖-蛋白質綴合物以及獲得所述多糖-蛋白質綴合 物的快速高產的綴合方法。更特別地，本發明提供了使用用于產生增強免疫原性的優化多 糖鏈長度來開發的多糖蛋白質綴合物疫苗。本發明還涉及用于使多糖與載體蛋白質綴合的 具有提高的產率和更高的免疫原性的還原胺化快速方法。
【背景技術】
[0002] 疫苗接種(免疫接種)是引發免疫應答的方式。疫苗接種的方法包括向活的實體施 用疫苗，這繼而激活人體的自然免疫系統。疫苗包含小劑量的抗原，其為減弱的病原體或死 病原體(例如細菌或病毒或病原體結構的一部分)的制備物，其在施用后刺激抗體產生或針 對病原體的細胞免疫。
[0003] 在免疫學上，可將抗原分類為T細胞依賴性(TD)抗原或T-細胞非依賴性(TI)抗原。 蛋白質和肽通常是TD抗原并且需要來自輔助T淋巴細胞的刺激以便引發免疫應答，并且由 于記憶B和T淋巴細胞的形成而誘導持久的免疫應答。與此相反，TI抗原刺激B細胞增殖和分 化成分泌抗體的效應細胞，無需T細胞的幫助并且不形成記憶B和T淋巴細胞。大多數這些T 細胞依賴性抗原是刺激產生低親和力抗體的微生物多糖。
[0004] 在革蘭氏陰性菌中，在細菌莢膜中存在的多糖是顯示出差的免疫原性的重要毒力 因子。綴合物疫苗是微生物多糖（polysaccharide，PS)抗原與載體蛋白質（carrier protein，CP)偶聯的產物，從而將T細胞非依賴性免疫應答轉變成T細胞依賴性免疫應答。使 用綴合物疫苗來免疫嬰兒和兒童以抵抗包含莢膜多糖的細菌引起的侵入性疾病。抗原性莢 膜多糖與載體蛋白質的偶聯產生高度免疫原性的綴合物。
[0005] 碳水化合物-蛋白質綴合物在基礎研究中被廣泛使用并且作為多種細菌疫苗中的 免疫原。已經付出了巨大的努力來開發用于構建這些綴合物的簡單且可靠的方法。雖然通 過還原胺化進行直接偶聯是有有吸引力的方法，但其同樣具有許多缺點。通過還原胺化的 現有綴合方法是耗時且低產率的方法，同時如此得到的綴合物顯示出較低的免疫原性。
[0006] 多糖-蛋白質綴合物的免疫學性能是長度依賴的，可能需要優化多個表位也是一 個公認的事實(Costantino等，1999)。還已知較小多糖片段的選擇性末端基團活化方法以 一致的再現性產生了很好地限定了綴合物疫苗。較大尺寸的多糖分子可具有空間上隱藏的 表位，然而較小的片段在綴合后將具有暴露于免疫系統的最大表位。
[0007]已經開發了用于制備較小的多糖片段的數種方法，包括多糖的解聚。在現有技術 中已充分地描述了多糖的解聚。例如，Laferriere等，2011年的文章 "Experimental design to optimize an Haemophilus influenzae typeb conjugate vaccine made with hydrazide-derivatized tetanus toxoid"對其進行了詳細的描述一個主要的缺點是該 方法花費很長的時間（32小時以上），并具有約15%的綴合物產率。Anderson等，1986年也描 述了使用較小尺寸的多糖用于與白喉類毒素綴合，并發現由20個重復單元的Hib-PRP制成 的綴合物比由8個重復單元制成的那些具有更強的免疫原性。他們的方法也花費很長的時 間，即超過5天。
[0008]本發明通過提供用于使多糖與載體蛋白質綴合的具有提尚的廣率和更尚的免疫 原性的還原胺化的快速方法克服了現有技術的缺點。本發明的方法需要較短的綴合時間。 本發明還提供了通過向免疫系統更好地暴露抗原表位的免疫原性增強的小尺寸多糖。
[0009] 發明目的
[0010] 因此，本發明的主要目的是提供免疫原性增強的多糖-蛋白質綴合物。
[0011] 本發明的另一個目的是提供用于多糖片段化的化學方法。
[0012] 本發明的另一個目的是提供用于流感嗜血桿菌（Haemophilus inf luenzae)b型 (Hib)的免疫原性增強的較低分子量(Lower Molecular Weight，LMff)多糖蛋白質綴合物疫 苗。
[0013] 本發明的另一個目的是提供用于腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清 組A和C(MenA和MenC)的免疫原性增強的較高分子量(Higher Molecular Weight，HMW)多糖 蛋白質綴合物疫苗。
[0014] 本發明的另一個目的是提供獲得具有較短綴合時間和更高綴合物產率的多糖-蛋 白質綴合物的快速方法。

【發明內容】

[0015] 因此，本發明提供了免疫原性增強的多糖-蛋白綴合物和獲得所述多糖-蛋白質綴 合物及其疫苗的快速高產率綴合方法。
[0016] 本發明提供了優化分子量的多糖-蛋白質綴合物，其中多糖被片段化成分子量在 100±40kD的范圍內，更優選地具有約100kD的平均分子量。
[0017] 本發明還提供了制備Hib多糖-蛋白質綴合物的優化的低分子量多糖，其中多糖片 段被片段化為分子量在12±6kD的范圍內，更優選地具有約10kd的平均分子量。
[0018] 本發明還公開了用于將Hib莢膜多糖（即PRP(聚核糖基-核糖醇-磷酸））化學分解 為12±6kD的尺寸的具有較低多分散性且具有可再現性結果的方法。
[0019] 本發明還公開了用于將天然莢膜多糖(例如但不限于MenA和MenC)化學分解為100 ±40kD的尺寸的方法，其示出了可再現結果的低多分散性。
[0020] 在一個優選的實施方案中，本發明提供了多糖的化學降解，其中將所述多糖樣品 與偏高碘酸鈉（sodium-metaperiodate)放在一起保持預定的時間并在凝膠過濾柱上直接 脫鹽。
[0021] 純化所述的多糖樣品并對純化的多糖進行分析測定用以評估物理化學性質，包括 PS含量、唾液酸含量、磷含量、蛋白質雜質、核酸雜質、內毒素、同一"性以及水分含量。分析純 化的多糖的總含量并通過產生醛基進行衍生化。
[0022] 本發明還提供了多糖-蛋白質綴合物，其中可在較小的多糖片段上進行選擇性的 末端基團活化。對于Hib多糖和腦膜炎球菌血清組，典型的多糖被氧化劑(例如偏高碘酸鹽/ 酯(metaperiodate))分別片段化為約10kD和100kD的較小質量，并使用還原胺化化學將其 與衍生化的載體蛋白質綴合。
[0023] 載體蛋白質是破傷風類毒素、CRM197或其他合適的載體蛋白質，其被激活并分析 蛋白質含量和活化度(degree of activation)。在催化試劑的存在下，使用一水合肼作為 接頭將肼基團與載體蛋白質連接。所述催化試劑的非限制性實例是HXX1-乙基-3-(3-二甲 氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽）。
[0024] 綴合步驟包括衍生化的多糖與衍生化的載體蛋白質（例如破傷風類毒素）的綴合。 進一步純化多糖-蛋白質綴合物并分析蛋白質含量與多糖含量之比、游離多糖、尺寸分布和 效力。
[0025] 本發明還進行了對多糖-蛋白質綴合物的物理化學分析的分析。在實驗的每個階 段，即，對于初始多糖樣品、活化的糖、載體蛋白質、批量綴合物(bulk con jugate)和最終的 疫苗進行該分析。
[0026] 對于Hib，用所產生的綴合物對大鼠進行免疫，對于MenA/MenC對小鼠進行免疫，并 且對血清抗體進行滴定以評估免疫潛力。對于Hib和MenA/MenC，通過間接的IgG-ELISA確定 抗體效價(titer )，并且MenA和MenC綴合物的血清殺菌測定等于或高于用參考疫苗獲得的 那些。因此該方法成本效益好且耗時較少。
[0027] 本發明最重要的成果是使用優化分子量的各多糖在遠遠更短的時間和更好的綴 合產率下使所產生的綴合物獲得更好的免疫原性。
[0028] 附圖簡述
[0029]圖1描繪了還原胺化方法的示意圖。
[0030]圖2描繪了使用如通過RI檢測器所監測到的在TSK 4000-5000PWXL柱上獲得的解 聚且活化的Hib PRP的高效液相色譜系統(SEC-HPLC)圖譜的尺寸排阻色譜。
[0031] 圖3a和3b描繪了如通過RI檢測器所監測到的在TSK 4000-5000PWXL柱上活化的 MenA和MenC多糖的SEC-HPLC洗脫圖譜。
[0032] 圖4描繪了通過UV檢測器所監測到的在TSK 4000-5000PWXL柱上Hib PRP-TT綴合 物在SEC-HPLC圖譜中的位移。
[0033]圖5描繪了PRP-TT綴合物的SDS-PAGE分析。樣品泳道含有以下：泳道1 -蛋白質分子 量標準，泳道2-低分子量的PRP-TT綴合物，泳道3-高分子量的PRP-TT綴合物，以及泳道4-天 然TT。
[0034] 圖6描繪了通過UV檢測器監測到的TSK 4000-5000PWXL柱上MenA-TT綴合物和 MenC-TT綴合物的SEC-HPLC圖譜的位移，與游離的破傷風類毒素進行了比較。
[0035]圖7描繪了在抑制ELISA中，MenC-TT綴合物的抗體抑制百分比的圖示。
[0036]圖8描繪了在第0、28和42天3次給藥后，通過ELISA測定大鼠中的Hib綴合物免疫原 性來確定血清IgG效價。在第0、28、42、49和70天以不同的劑量水平以及用不同尺寸的!1化 PS來評估抗體效價。
[0037] 圖9描繪了通過ELISA測定小鼠中的腦膜炎球菌血清組A綴合物免疫原性來確定血 清抗MenA IgG效價。
[0038] 圖10描繪了通過ELISA測定小鼠中的腦膜炎球菌血清組C綴合物免疫原性來確定 血清抗MenC IgG效價。
[0039] 圖11描繪了通過血清殺菌測定小鼠中的腦膜炎球菌血清組C綴合物的免疫原性來 確定抗MenC血清功能性抗體效價。
[0040] 具有舉例說明和實施例的發明詳述
[0041] 大多數蛋白含有來自C末端官能團和天冬氨酸以及谷氨酸側鏈的大量羧酸基團。 這些基團易于被親核化合物修飾以產生穩定的酰亞胺產物。而親核官能團易于與醛基反 應，但其不會自發地與羧酸鹽/酯或羧酸基團反應。首先必須用其他化合物活化羧酸基團以 使其對親核試劑發生反應。在本發明中，在水溶液中用水溶性交聯劑處理所述蛋白質以使 羧基與胺綴合。所述交聯劑的一個非限制性實例是碳二亞胺H