瘙癢的抑制的制作方法
【專利說明】瘦癢的抑制
[0001 ]本發明提供用于抑制或治療痊癢的方法和組合物。
[0002] 痊癢、醫學上稱作痊癢癥，已經被定義為"引起對搔抓的欲望或反射的令人不愉快 的皮膚感覺"。具有嚴重痊癢的患者通常發現因相關的不適感和屯、理素亂例如抑郁或睡眠 剝奪而難W過正常的生活。痊癢還可W是虛弱性病癥，其附帶眾多的皮膚、全身和神經系統 障礙。
[0003] 推定痊癢的發生是為了防止動物受到小的粘性威脅，例如昆蟲和植物尖刺，它們 無法通過與感覺痛相關的回縮響應被有效地除去。密切的發展相關性因痊癢與疼痛神經元 之間的重疊而是顯而易見的：兩者均通過無髓銷的C-型神經纖維(傷害性感受器）的游離神 經末梢介導。存在眾多能夠刺激運些神經的介體，例如生物胺類、生物堿類、蛋白酶和膚類。 傷害性感受器通過其周圍軸突檢測介體并且將信號傳送至脊髓，W便在腦中產生例如痊癢 知覺。對于臨床醫師，痊癢與疼痛之間的重疊意味著:可W導致神經性疼痛的相同神經性疾 病也可W導致神經性痊癢。然而，存在差異。大部分有效地針對疼痛的治療對痊癢無效。值 得注意的是，一些止痛藥如阿片樣疼痛緩解劑(例如嗎啡)甚至導致或惡化痊癢。
[0004] 近期的研究已經開始將痊癢線路的特征與疼痛分開描述。已經提出：痊癢的特征 在于被傷害性感受器亞組傳遞，稱作"癢覺感受器(pruriceptors)"或痊癢-特異性神經纖 維，其位于真皮表皮接合處和表皮內。認為一些特異性地在背根神經節(DRG)或=叉神經中 的感覺神經元中表達的G-蛋白偶聯受體(GPCRs)在痊癢獨特性感覺中起到必不可少的作 用。運組受體近期被鑒定為痊癢獨特性的（即它們不牽設疼痛線路），并且提供了針對抑制 痊癢的潛在治療祀標。
[000引根據2000年進行的全球疾病負擔(Global Burden Of Disease)(GBD)研究，4%的 人群(約2.8億）患有與痊癢相關的病癥。目前的抗組胺藥和皮質類固醇藥可W緩解一些類 型的急性痊癢和小百分比的慢性痊癢類型。然而，它們無法治療因腎病和肝病、癌癥和皮膚 病例如特應性皮炎導致的大部分慢性痊癢病例。此外，抗組胺藥僅能夠對抗組胺依賴性痊 癢(通常由過敏性刺激引起）。然而，非組胺依賴性痊癢占據痊癢病例的大部分。
[0006] 嚴重的搔抓可W損傷皮膚，使得它傾向于感染，其中嚴重的牽設免疫損傷宿主(其 中痊癢可能是病癥或藥物反應繼發的）。此外，因痊癢而損傷和感染的皮膚通常加劇了 "痊 癢-抓曉-痊癢循環"（運種痊癢循環需要抓曉且抓曉進一步加劇了痊癢）。由臨床醫師推薦 的緩解痊癢的其它技術包括:光療法;穿戴松弛的棉布衣服;頻繁地在溫水中短暫沐浴和維 持30%-40%濕度水平的清涼環境。然而，運些預防措施始終不能維持。因此，本領域中需 要用于抑制或治療痊癢的新藥劑。
[0007] 本發明解決了運種需求，其解決了上述舉出的問題的一種或多種。
[000引發明概述
[0009] 本發明通過提供用于抑制或治療受試者(例如患者)的痊癢的融合蛋白、解決了上 述舉出問題的一種或多種，所述融合蛋白包含：
[0010] (i)非細胞毒性蛋白酶，該蛋白酶能夠裂解痊癢-特異性DR巧申經元或癢覺感受器 中的SNARE(可溶性N-乙基馬來酷亞胺敏感性因子附著蛋白受體)蛋白；
[0011] (ii)能夠結合至痊癢-特異性DR巧巾經元或癢覺感受器上的結合位點的祀向部分 (TM),所述結合位點能夠經歷胞吞作用而被并入痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器內的 內體，且其中所述痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器表達所述SNARE蛋白；和 [001引（iii)能夠使來自內體內的蛋白酶易位、通過內體膜并且進入痊癢-特異性DRG神 經元或癢覺感受器的胞質溶膠的易位結構域；
[0013] 條件是該多膚不是梭菌神經毒素(全毒素)分子。
[0014] 第一個方面還包括用于抑制或治療痊癢的相應方法，該方法包括對患者施用治療 有效量的本發明的多膚。
[001引發明詳述
[0016] 本發明的多膚不是天然存在的梭菌神經毒素分子(也稱作梭菌全毒素）。梭菌全毒 素是已知對人最致命性的神經毒素之一，且因此作為治療分子具有明顯的限制。此外，在抑 制痊癢的情況下，梭菌全毒素與不期望的祀點脫離(off-site targeting)相關，即祀向非 痊癢途經的神經細胞的細胞。
[0017] 在應用中，本發明的多膚結合于痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器上的受體。 易位成分影響蛋白酶成分轉運入痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的胞質溶膠。最終， 一旦到達內部，則蛋白酶通過裂解痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器胞質溶膠中存在的 SNARE蛋白而抑制痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的細胞外融合過程。因此，通過使痊 癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的細胞外融合器失活，本發明的多膚抑制神經遞質從其 中分泌。因此，本發明的多膚降低了從痊癢-特異性DR巧申經元或癢覺感受器傳送至脊髓的 神經遞質水平，且由此能夠抑制或治療痊癢。在一個實施方案中，神經遞質是乙酷膽堿。在 一個優選的實施方案中，神經遞質是谷氨酸鹽。在另一個優選的實施方案中，神經遞質是促 胃液素釋放蛋白（GRP)。
[0018] 本發明的多膚類提供超過其它治療劑的顯著優勢，因為它們具有抑制從特異性祀 細胞即痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器中分泌的潛能。相反，其它提出的治療劑尋求 通過嘗試使用介導運種效應的受體括抗劑減輕痊癢。然而，本發明提供特異性阻斷神經遞 質從其產生部位分泌的手段。
[0019] 本發明的主要祀細胞是痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器。DRG細胞通過脊柱 沿脊椎定位，并且是GPCRs例如化即巧1、化甜rA3或化即rCl 1的表達位點，它們已被鑒定為 痊癢-特異性受體。
[0020] 本發明的融合蛋白在與相應的"游離"TM(即分離的TM本身）比較時一般顯示針對 祀細胞減少的結合親和力(在至多10至100-倍的范圍）。然而，盡管存在運種觀察結果，但是 本發明的融合蛋白令人驚奇地顯示出良好的效能。運可W歸因于兩種主要的特征。首先，非 細胞毒性蛋白酶成分是催化性的-因此，少量運類分子的治療作用在祀細胞內得W快速地 擴增。其次，存在于祀細胞上的受體僅需要作為治療劑進入的入口起作用，且不一定需要被 刺激至達到配體-受體介導的藥理學響應所需的水平。因此，可W W低于用于其它類型治療 分子的劑量施用本發明的融合蛋白，其它類型的治療分子典型地W高微克至毫克(甚至達 到數百毫克）用量施用。相比之下，本發明的融合蛋白可W W低得多的劑量施用，典型地至 少低10-倍，且更典型地低100-倍。 巧〇引]非細胞毒性蛋白酶
[0022] 本發明TSI多膚類的生物活性成分是非細胞毒性蛋白酶。因此，一旦被遞送入祀細 胞的胞質溶膠，則非細胞毒性蛋白酶成分影響期望祀細胞內的SNARE裂解。因為SNARE蛋白 是哺乳動物細胞內的分泌過程的必要成分，故其蛋白水解失活抑制/阻止從所述細胞分泌。
[0023] 非細胞毒性蛋白酶是不殺傷細胞的離散類分子;而它們通過抑制非蛋白質合成的 細胞過程起作用。非細胞毒性蛋白酶由各種高級生物體(例如植物和動物)產生-運類高級 生物體的實例是己西全蝸(Brazilian scorpion)。此外，非細胞毒性蛋白酶由各種微生物、 特別是細菌例如梭菌屬(Clostridi皿sp.)和奈瑟球菌屬(Neisseria sp.)產生。
[0024] 梭菌神經毒素代表主要的一組非細胞毒性毒素分子，并且包含通過二硫鍵連接的 兩個多膚鏈。兩個鏈稱作具有約l〇〇W)a分子量的重鏈化-鏈)和具有約SOkDa分子量的輕鏈 a-鏈）。輕鏈具有蛋白酶功能并且展示出對牽設細胞外過程的囊泡或質膜相關SNARE蛋白 (例如突觸融合蛋白、SNAP和突觸泡蛋白（或VAMP))的高底物特異性。運些底物是細胞分泌 器的必需成分。
[0025] 顯然大部分來自淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeas)種類的奈瑟球菌屬產生功能類似 的非細胞毒性毒素分子。運類非細胞毒性蛋白酶的實例是IgA蛋白酶(參見W099/58571)。類 似的IgA蛋白酶由鏈球菌屬（streptococci)例如肺炎鏈球菌（Sheptococ州S pneumoniae) 產生。
[0026] 因此，在一個實施方案中，本發明的非細胞毒性蛋白酶可W是梭菌神經毒素蛋白 酶或IgA蛋白酶(例如參見WO 99/032272)。非細胞毒性蛋白酶的另一個實例是蝸毒液蛋白 酶，例如來自己西全蝸己西錯蝸（T i tyus S erru 1 atus)的毒液的那些或蛋白酶an tar eas e (例如參見WO 2011/022357)。 巧027] 祀向部分(TM)
[0028] 現在轉導本發明的祀向部分(TM)成分，運種成分是使本發明的多膚結合至痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的成分。TM優選是膚。
[0029] 在應用中，本發明的多膚結合至痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器。此后，該多 膚的易位成分影響蛋白酶成分轉運入痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的胞質溶膠。最 終，一旦到達內部，則蛋白酶通過裂解痊癢-特異性DR巧申經元或癢覺感受器胞質溶膠中存 在的SNARE蛋白來抑制痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的細胞外融合過程。因此，通過 使痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器的細胞外融合器失活，本發明的多膚抑制神經遞質 從其中分泌。因此，本發明的多膚減少痊癢-感覺信號通過脊髓傳送至腦，且由此能夠抑制 或治療痊癢。
[0030] TM結合痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器上的結合位點，由此提供所述多膚對 運一種類祀細胞超過其它細胞的選擇性。在運方面，本發明優選的TM實施方案包括抗體(例 如單克隆抗體、抗體片段例如化6少(36)'2少巾、5〇。巾等和抗體結構域膚類)和結合骨架，它 們結合如下鑒定的受體。因此，本發明的多膚類可W包括商購抗體或結合骨架，它們已經被 設計成實現與所述祀細胞或受體的特異性結合。或者，優選的TMs包括生物胺類、生物堿類、 蛋白酶、膚配體和神經膚類。
[0031] 本發明的TM結合至痊癢-特異性DR巧申經元或癢覺感受器。作為實例，本發明多膚 的TM結合痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器上的G-蛋白偶聯受體(GPCR)，其選自Mas-相 關G-蛋白受體（例如化甜巧1、化甜rA3或化甜rCll)。
[0032] 在一個實施方案中，TM選自牛腎上腺髓質膚（例如BAM8-22)、促黑激素膚（例如丫 2-M甜）、終止于RF/Y-G或RF/Y-酷胺中的神經膚(例如NPFF或NPAF)、包含化IG化-NH2的膚、 生物堿類(例如氯哇）、生物胺類(辣椒素、組胺、血清素、皮質抑素(cortistatin))W及其截 短物或膚類似物。
[0033] 在一個實施方案中，本發明多膚的TM結合至痊癢-特異性DRG神經元或癢覺感受器 上的受體，其選自化即巧1、化即rA3或化甜rCl 1。所有運些受體均在痊癢-特異性DRG神經元 或癢覺感受器上表達。
[0034] 在一個實施方案中，TM選自：BAMs-22、丫 2-M甜、肥。。、肥4。、5116化-畑2、氯哇、辣椒 素、組胺、血清素、皮質抑素及其截短物和膚類似物。
[003引在一個實施方案中，本發明多膚的TM結合至化即r受體，且優選化即巧、化即rA或 化甜rC。在一個實施方案中，本發明多膚結合至化甜Xl或化甜rA3或化即rCl 1。作為實例，適 合的TMs包括:BAMs-22、氯哇、丫 2-M甜、終止于RF/Y-G或RF/Y-酷胺中的神經膚類（例如NPFF 或NPAF)、辣椒素、組胺、血清素或皮質抑素。運些TMs優選結合Mr甜rs。
[0036] 在一個優選的實施方案中，TM結合化即巧受體，優選Mr即巧1;還優選TM是BAM8-22 或其截短物或膚類似物。 咖別易位結構域
[0038]本發明的易位成分能夠將非細胞毒性蛋白酶(或其片段)易位入祀細胞，使得蛋白 酶活性的功能表達發生在祀細胞的胞質溶膠內。所述易位成分優選能夠在低pH條件下在脂 質膜(例如內體膜）內形成離子可滲透的孔。易位成分可W得自微生物蛋白來源，例如細菌 或病毒蛋白來源。因此，在一個實施方案中，所述易位成分包含酶的易位結構域或由其組 成，例如細菌毒素。在另一個實施方案中，所述易位結構域包含病毒蛋白的易位結構域或由 其組成。在一個實施方案中，本發明的易位成分可W包含梭菌神經毒素 H-鏈或其片段或由 其組成，例如梭菌神經毒素的化結構域(或其易位成分）。 巧039] 多膚制備
[0040] 本發明的多膚類包含3種主要成分："生物活性"（即非細胞毒性蛋白酶）；TM;和易 位結構域。與制備運類融合蛋白相關的通用技術通常稱作再祀向毒素技術。作為示例，我們 參考:W094/21300 ;W096/33273 ;W098/07864 ;W000/10598 ;W001/21213 ;W006/059093; WOOO/ 62814;胖000/04926;胖093/15766;胖000/61192;和胖099/58571。將所有運些公開文本并入本 文參考。
[0041] 更具體地，可W使本發明的TM成分與本發明的蛋白酶成分或易位成分融合。所述