用于制備載有一種或多種制藥學感興趣物質的紅細胞的方法和由此得到的紅細胞的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于制備載有一種或多種活性成分的紅細胞的方法、由此得到的 裝載紅細胞和包括所述裝載紅細胞的藥物組合物。
[0002] 本發明還涉及包括所述紅細胞的藥物組合物及其治療性應用，特別是在治療共濟 失調毛細血管擴張中的應用。
【背景技術】
[0003] 血紅細胞，也被稱為紅細胞，是一種能夠攜帶并釋放到循環中和/或將活性成分 有效地靶向靶位點的現有技術中的藥物載體。使用紅細胞作為藥物載體的優點主要在于活 性成分可以在循環中保持數天或數周的時間，且無論如何比通常情況下使用口服或靜脈注 射或者由脂質體或其他藥物載體介導的緩釋系統可以保持更長的時間。此外，一旦這些載 體已經完成了其攜帶活性成分的任務，它們將被通過用于消除肝臟和脾臟中的天然紅細胞 的生理通路從循環中去除。
[0004] 已經提出了多種方法以將活性成分或造影劑封裝在人類或哺乳動物的血紅細胞 中以實現生物醫學和臨床用途。
[0005] 特別地，專利EP0882448首次描述了將藥物以足以獲得所期望藥理效應的濃度封 裝在紅細胞中的方法。在上述現有專利中描述的方法包含一系列可概括為如下的操作步 驟：
[0006] -將紅細胞溶脹的第一步，
[0007] -使經過溶脹的紅細胞裂解以將所述紅細胞膜上的孔打開足夠大從而使感興趣的 活性成分跨越到細胞內空間的第二步，
[0008] -對經過裂解的紅細胞進行濃縮步驟，
[0009] -封裝步驟，其中紅細胞開始與活性成分接觸，隨后對紅細胞進行關閉/再封閉以 達到將活性成分捕獲在血紅細胞中的目的。
[0010] 剛剛描述的方法有可能獲得載有活性成分且適于用作藥物載體的紅細胞。目前， 對于該領域的專家來說，涉及將藥物封裝在在紅血細胞中的最有效的方法是上述方法。
[0011] 然而，在使用這種方法時，觀察到在上述專利（EP0882448)中所定義的操作條件 中對經過裂解的紅細胞進行濃縮的步驟中，這些經過裂解的紅細胞受到機械應力，該機械 應力可能使接下來對裝載紅細胞進行重建相當困難。
[0012] 在用于將活性成分封裝在紅細胞中的各種已知的技術中，在專利EP1773452-B1 中所述的方法提供了工藝參數的修正，如改變裂解液的流速和調節其滲透壓，以便當患者 的滲透脆弱性（或球狀滲透阻力）變化時獲得活性成分的封裝的再現性。
[0013] 本發明的范圍是進一步提高EP0882448中所述的方法取得的已經令人滿意的結 果以獲得一種用于將制藥學感興趣物質封裝在紅細胞中的改進方法。

【發明內容】

[0014] 本發明涉及一種用于制備載有一種或多種制藥學感興趣物質的紅細胞的方法，該 方法與已知的現有技術中所描述的相同的方法相比，在幾個方面有所提高。
[0015] 特別地，該方法包括一系列操作步驟，其以在細胞裂解步驟前進行紅細胞的濃縮 步驟為特征，裂解步驟必須使藥物活性分子被封裝在紅細胞中。更確切地說，該裂解步驟是 在與包括待封裝的物質的溶液接觸的步驟中進行。
[0016] 本發明的方法提供了使用適當的低滲溶液使起始紅細胞經過兩個相繼的細胞溶 脹步驟而不裂解；實際上，這些步驟取代了根據現有技術的相同方法的溶脹步驟和裂解步 驟。
[0017] 因此，本發明的目的是一種用于制備載有一種或多種制藥學感興趣物質（如活性 成分）的紅細胞的方法，包括以下步驟：
[0018]a)用第一低滲溶液使紅細胞溶脹，
[0019] b)用比所述第一低滲溶液更低滲的第二低滲溶液使步驟a)得到的紅細胞進一步 溶脹，而沒有達到裂解，
[0020] C)濃縮步驟b)得到的紅細胞；
[0021] d)將由此經過濃縮的紅細胞與包括一種或多種制藥學有興趣物質的裂解液接觸， 和隨后
[0022] e)加入封閉以獲得載有所述制藥學感興趣物質的紅血細胞群。
[0023]有利地是，該方法可以包括步驟（a)和步驟（b)之間的中間步驟（a2)，其中在加入 所述第二低滲溶液之前，去除至少部分所述第一低滲溶液。
[0024] 本發明的另一方面是通過上述方法可獲得的載有一種或多種活性成分的紅細胞 群和包括如上所定義的裝載紅細胞群的藥物組合物。
[0025] 本發明的另一方面是包括通過上述方法獲得的載有一種或多種活性成分的紅細 胞的藥物組合物，以及所述紅細胞和組合物在治療疾病（如共濟失調毛細血管擴張）中的 應用。
[0026] 本發明是基于令人驚訝的發現，即將活性成分封裝在僅經受溶脹和濃縮步驟而無 需事先誘導溶血的紅細胞中是可能的。的確，用相同的含有感興趣物質的溶液進行濃縮后 可有效地打開孔（溶血）。新的方法比先前的方法更有效，并產生與天然紅細胞（未經過該 方法）非常類似的最終產品（包含至少一種藥物活性物質的紅細胞）。
[0027] 本發明的優點
[0028] 在新方法中所引入操作變化較好的保留了血紅細胞的細胞質膜，又達到了更高的 濃度，從而提供了更高的封裝效率。
[0029] 在本發明的方法中，與已知的現有技術中所描述的方法相比，感興趣的物質的封 裝有更好的產量，允許更大數量的治療性活性物質的封裝。特別地，該方法的發明人已經 證明，為了取得被包封的活性成分的相同水平，在本發明的方法中可以使用比目前采用的 EP0882448中所描述的標準方法中起始活性成分的量顯著低的量。特別地，如同樣在實驗 部分中所描述的，為了以相同量經過處理的血紅細胞封裝高達約11毫克的例如地塞米松 磷酸鈉，用現有技術的方法需要約500毫克的起始藥物，而用本文中所描述的方法只需要 62. 5暈克。
[0030] 此外，該方法已被證明在將感興趣物質與其起始量成比例的量封裝在血紅細胞中 是可重復的且可靠的：這些特性允許不同劑量的臨床使用，使給藥相稱于不同臨床需要的 劑量成為可能，只需改變該方法過程中加入的活性成分的量。
[0031] 增加的封裝效率被證明不僅與具有低分子量的活性分子（例如，如示例1中所示 的地塞米松磷酸鈉）有關，而且還與具有高分子量的分子有關。如示例5中所報道，具有分 子量大約110kDa(55kDa的酵母己糖激酶的二聚體-HK)或大約60kDa(胸苷磷酸化酶）的 蛋白質已被有效地封裝。
[0032]由于修改順序的操作步驟，在與通過本發明的方法獲得的裝載紅細胞群相關的生 理參數也獲得了顯著的改善。特別地，如在示例中所示，使用在本文中所描述的方法裝載 的紅細胞具有與那些未經處理的紅細胞完全可比的參數，如平均細胞體積和細胞活性（代 謝）。總體而言，實驗數據表明，與現有技術相比，新方法能夠更好地保留起始紅細胞的細胞 大小和細胞含量，從而能夠獲得從生理學角度看與未經處理的紅細胞群顯著更相似的裝載 紅細胞群。
[0033] 根據本法明或以現有技術（EP0882448)的類似方法對裝載的紅細胞群進行的對 比實驗已經表明，例如血紅細胞的平均細胞體積（MCV)分別為約86毫微微升（本發明）和 約71暈微微升（現有技術），而未經處理紅細胞的MCV值在80和97暈微微升之間。另外， 經發現在經過本文中的方法和在現有技術中所描述的方法處理的血紅細胞中所測量的平 均紅細胞血紅蛋白（MCH)的量分別大約為21. 2皮克（更接近正常量）和14皮克（現有技 術），未經處理紅細胞的值通常在27. 6和33. 3之間變化。
[0034] 以該方法裝載的紅細胞和未經處理紅細胞之間較好的重疊也通過觀察到的增加 的細胞活性（代謝）而被確認。特別地，如下面更加詳細地描述，根據本發明進行處理的紅 細胞的活性在增加代謝能力和減少衰老標記物存在方面均顯著較好。如下面更加詳細地討 論，與更強的細胞活性（更多代謝和更少衰老標記物）相關的數據允許我們聲明，在本文中 所描述的方法事實上能夠產生相比于用現有技術獲得的紅細胞具有更長半衰期的裝載紅 細胞群。由此斷定依據本發明的紅細胞群允許封裝的物質的運輸和/或它們的釋放持續比 根據在現有技術中所描述的方法裝載的紅細胞所允許的更長的時間。
[0035] 由于所述的技術方式，本發明還克服了在EP1773452-B1所述方法的缺陷并獲得 活性物質的可重現封裝，而不需要針對各個個體患者修正方法參數，因為該方法是獨立于 患者的血紅細胞的不同滲透脆性（如示例7中所表明）和初始血細胞比容（如示例8中所 表明）。
[0036] 本發明的紅細胞的上述有利的性質，特別是在紅細胞中封裝的最高量藥物和它們 更長的半衰期使所述紅細胞在治療不同的疾病（如共濟失調毛細血管擴張）中是有效的。
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