吐曼酸在制備治療或預防雌激素缺乏引起的阿爾茨海默病藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于吐曼酸的醫藥新用途技術領域，具體涉及一種吐曼酸在制備治療或預 防雌激素缺乏引起的阿爾茨海默病藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer'sDisease，AD)是常見的神經系統的退行性疾病，表現 為老年斑的沉積，進行性學習記憶能力喪失和智力減退。老年斑的主要成分是淀粉樣 多肽（beta-amyloid，A0 )。研究報道，女性患者血液中雌激素水平降低與AD臨床癥狀密切 相關。雌激素不僅具有調控生殖和機體發育的作用，還有降低興奮性氨基酸釋放、神經保護 和改善學習記憶等功能。流行病學顯示，AD是一種有性別傾向的疾病，老年女性的發病率 明顯高于老年男性，提示雌激素缺乏在AD發生發展過程中具有顯著意義。
[0003] 腦中廣泛存在雌激素受體（Estrogenreceptors，ER)，研究發現雌激素受體如 ERa、ERP等可以調節海馬的神經興奮性及基于海馬的學習記憶能力。同時，學習記憶損 害程度與膽堿能神經元的數量密切相關。因此，提高腦內乙酰膽堿的含量是治療AD的一個 非常好的策略。
[0004] 吐曼酸是一種三萜皂甙類物質，可以從草莓果、紫蘇的葉子和橄欖等中提取。研究 發現，吐曼酸能拮抗LPS-誘導的小膠質細胞的炎性反應。抑制平滑肌細胞的增殖和存活。 吐曼酸能抑制坐骨神經的病理性疼痛及高脂飲食誘導的高脂血癥及暴發性肝功能衰竭。
[0005] 雌激素替代療法己被肯定，但作為安全的長期用藥仍有爭議，如能增加陰道不規 則出血和增加乳腺癌的風險等等。我們采用卵巢切除小鼠，作為研究對象，以期闡明吐曼 酸、雌激素受體和神經功能在AD發病中的相互關系，明確吐曼酸對雌激素受體及對神經系 統中的作用，為臨床雌激素缺乏后引起的AD疾病的治療提供理論依據。

【發明內容】

[0006] 本發明解決的技術問題是提供了一種吐曼酸在制備治療或預防雌激素缺乏引起 的阿爾茨海默病藥物中的應用。
[0007] 本發明的技術方案為，吐曼酸在制備治療或預防雌激素缺乏引起的阿爾茨海默病 藥物中的應用，其中吐曼酸的分子式為C3(]H4S05，結構式為：
[0008] 進一步限定，所述的藥物是由吐曼酸和藥學上可接受的載體或賦形劑制成的。
[0009] 本發明所述的吐曼酸在制備治療或預防絕經期婦女合并阿爾茨海默病藥物中的 應用，其中吐曼酸的分子式為C3(]H4S05，結構式為：
[0010] 進一步限定，所述的藥物是由吐曼酸和藥學上可接受的載體或賦形劑制成的。
[0011] 本發明的吐曼酸可改善AD患者的認知功能障礙，提高腦內膽堿能神經元的數量， 對CNS具有神經保護作用，該保護作用可能通過ERa實現，該結果為吐曼酸作為治療絕經 期婦女合并AD的藥物選擇提供了實驗依據。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發明各組小鼠Meynert核團ChAT陽性神經元免疫組織化學檢測圖； 圖2是本發明各組小鼠海馬ERa和ER0蛋白表達的Westernblot檢測圖。
【具體實施方式】
[0013] 以下通過實施例對本發明的上述內容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本 發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容實現的技術均屬于本發 明的范圍。 實施例
[0014] 1材料與方法 1. 1造模和分組 卵巢切除癡呆模型小鼠造模：選用C57BL小鼠，3月齡，體重（30±2)g。以質量濃度為 1. 5%的戊巴比妥鈉（0. 25mL/100g)腹腔麻醉小鼠，消毒備皮恥骨以上的皮膚，沿正中切開 恥骨上方皮膚2cm，切開腹壁肌層并打開腹腔，分別分離暴露雙側粉紅色卵巢，結扎并摘除 雙側卵巢（ovariectomy，OVX)，依次縫合肌肉和皮膚，術后碘伏消毒。假手術組僅暴露卵巢。 術后第3天進行陰道細胞涂片，連續7天出現上皮角化細胞則證明卵巢切除成功。卵巢切除 癡呆模型是由于雌激素缺乏而引起的神經系統疾病，卵巢切除癡呆模型時間需要6-8周。
[0015] 吐曼酸為湖北巨勝科技有限公司產品，其分子式：C3(]H4S05，結構式：
[0016] 成年雌性小鼠隨機分成四組，即假手術組，0VX組，0VX+吐曼酸治療組和0VX+載 體假治療組。吐曼酸治療組以30mg/kg進行灌胃治療，每兩天一次，治療8周。8周后進行 Morris水迷宮測試小鼠的學習記憶能力。然后處死小鼠，分離海馬，測定相應的指標變化。
[0017] 1. 2Morris水迷宮測定實驗 Morris水迷宮視頻分析系統的水槽由直徑120cm、高55cm的圓形水池構成，黑色內壁， 水深41cm，水溫24±2°C，池壁平均分成4個象限，逃避平臺位于其中一個象限內，平臺低于 水面lcm。水池周圍參照物保持不變作為空間參照線索。動物運動軌跡由迷宮上方的攝像 系統采集。Morris水迷宮實驗程序包括：（1)定向航行實驗：實驗歷時5d，每天上、下午進 行。從一個象限開始依次將小鼠從各象限邊緣放入水中，記錄在60s內找到逃避平臺的時 間即為潛伏期。（2)空間探索實驗：撤除逃避平臺，任選一個入水點將小鼠放入水中，記錄 60s內小鼠穿越逃避平臺的次數。
[0018] 1. 3ELISA檢測的實驗步驟 將各組小鼠的海馬腦組織部位勻漿，勻漿液：5M的鹽酸胍(含50mM的Tris-HCL，pH=8. 0)勻漿后-70°C凍存待測。測定時，融化樣本，1. 5mL離心管中4°C，12000Xg，離心 30min，取上清50yL，按ELISA試劑盒說明書方法測定海馬A40水平。ELISA試劑盒購于 BioSource公司（BioSourceInternational，Inc.，Camarillo,California)。
[0019] (1)標準品的稀釋：按照說明書要求將鼠的AP1-40標準品稀釋成以下濃度： 500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62. 5pg/mL、31. 25pg/mL、15. 63pg/mL、7. 81pg/mL、0pg/mL〇
[0020] (2)加樣：設立空白對照孔、標準孔和待測樣本孔。空白對照孔加樣品稀釋液 100yL，其他孔加標準品或待測樣本各100yL，37°C，120min，棄液。
[0021] (3)加入A工作液 100yL，37°C，60min，#*。
[0022] (4)漂洗：加洗滌液350yL，漂洗3minX3次。
[0023] (5)加入8工作液10〇1^，37°(：，6〇111111。
[0024] (6)漂洗：加洗滌工作液350yL，3minX5次。
[0025] (7)顯色：加底物90yL，37°C避光孵育30min，反應液逐漸變為藍色。
[0026] (8)終止：加終止液50yL終止反應，此時反應液變為黃色。
[0027] (9)讀數：酶標儀在450nm波長測定各孔的光密度（0D值)。
[0028] (10)根據標準曲線和測得的0D值計算出A0 1-40濃度。
[0029] 1. 4免疫組織化學染色檢測膽堿乙酞轉移酶神經元： 小鼠麻醉后用質量濃度為4%的多聚甲醛灌注固定，取腦組織后固定，蔗糖梯度脫水、 包埋，在冰凍切片機上作連續冠狀切片，片厚20ym。各組小鼠的每只動物取Meynert基底 核的相似平面切片5張，加入兔抗小鼠ChAT-抗，4°C冰箱孵育24h，PBS清洗3次，加入抗 兔二抗，37°C孵育2h。每張切片隨機選擇5個視野，分別計數Meynert基底核視野內所有 ChAT陽性細胞數。
[0030] 1. 5 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,S0D)活力測定： SOD試劑盒購自上海碧云天公司，操作步驟如下： (1)NBT/酶工作液的配制：按照每個反應160yL(158yLS0D檢測緩沖液、1yLNBT 和1yL酶溶液)，4°C或冰浴保存。
[0031] (2)反應啟動工作液的配制：把試劑盒中的反應啟動液（40X)融解后混勻，每1yL 反應啟動液（40X)加入39yLSOD檢測緩沖液進行稀釋，4°C保存。（3)S0D標準品準備： 用試劑盒提供的稀釋液將S0D標準品稀釋至如下濃度：200U/mL，100U/mL，50U/mL，20U/mL， 10U/mL，5U/mL，2U/mL。在隨后的檢測中各取20yL，參考樣品進行檢測。在560nm測定吸光 度。S0D活力=(對照管0D值-測定管0D值)/對照管0D值X(反應液總體積/取樣量） /蛋白含量。
[0032] 1. 6 蛋白免疫印跡（Westernblot) 水合氯醛麻醉小鼠，斷頭并剝除腦膜暴露腦組織。在解剖顯微鏡鏡下仔細切取海馬組 織50mg。迅速將組織置于預冷的含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中（10mMHEPESpH=7. 5， 1.5mMMgCl2，10mMKCl，lmMEDTA，lmMDTT，質量濃度 10%glycerol，lmMPMSF，1X蛋白 酶抑制劑)。冰上勻漿放置30min。100°C水浴5min。冰上冷卻5min，4°C，12000Xg，離心 30min。取上清液，BCA法測濃度，分裝，-80°C中保存備用。經質量濃度為5%的濃縮膠和質 量濃度為10%的分離膠電泳，然后電轉至PVDF膜上，質量濃度為5%的脫脂奶粉封閉，分別 加入一抗(兔抗PKC-a(Millipore公司，美國)4°C孵育過夜，TBST漂洗10minX3次，加入 HRP標記二抗，室溫孵育2h。TBST漂洗10minX3次。ECL發光，顯影、定影，以a-tubulin (Millipore公司，美國）作為內參進行灰度定量分析。
[0033] 1.7統計學處理 實驗數據用均數土標準差(:i: 土s)表示，用SPSS13. 0統計軟件進行統計分析，組間比 較用t檢驗。逃避潛伏期用完全隨機設計的方差分析和重復測量數據的多因素方差分析； 空間探索試驗用完全隨機設計的方差分析。尸< 〇. 05為差異具有統計學意義。
[0034] 2 結果 2. 1吐曼酸對卵巢切除癡呆模型小鼠學習記憶能力的影響 研究結果顯示：卵巢切除組與假手術組比較，小鼠的逃避潛伏期明顯延長，跨越平臺次 數明顯減少，尸< 〇. 05,表明卵巢切除后，雌激素缺乏癡呆模型造模成功。末次藥物治療后， 對小鼠進行Morris水迷宮試驗，來檢測小鼠空間學習記憶能力的改變。結果顯示：在剛開 始的訓練中，小鼠主要沿著水迷宮邊緣游動尋找平臺，表現為搜索平臺的隨機性和無目的 性。隨著訓練的增加，卵巢切除組的小鼠仍保持此搜索策略，而吐曼酸治療組動物搜索平臺 的行為具有傾向性