Sepulturin A在制備心肌保護藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化合物SepulturinA的新用途，具體涉及SepulturinA在制備心肌 保護藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] ElihiiBautista等人首次分離純化出化合物SepulturinA，并將成果發表在 著名天然產物雜志JournalofNaturalProduct上（HydroxyclerodanesfromSalvia shannoni，J.Nat.Prod.，2013, 76,1970-1975)。
[0003] 目前尚未有該化合物關于心肌保護活性報道。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于提供一種SepulturinA的醫藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術方案實現的：
[0006] SepulturinA在制備心肌保護藥物中的應用，所述SepulturinA化學結構式如 下，
[0007]

【具體實施方式】
[0008] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容。
[0009] 實施例I:SepulturinA的分離制備及結構確證
[0010] SepulturinA的制備方法同文獻報道的制備方法（Hydroxyclerodanesfrom Salviashannoni，J.Nat.Prod.，2013, 76,1970-1975)。
[0011] 結構確證：無色結晶，恪點252-254°C，分子式為CmH22O7，不飽和度為10。核磁共 振氫譜數據SH(ppm，DMS0-d6,500MHz) :H-1 (3. 27,d，J= 3. 5)，H-2(3. 51，m)，H-3(2. 33， ddd，J= 15. 0,5. 0,1. 5)，H-3(l. 81，ddd，J= 15. 5,12. 5,2. 5)，H-4(2. 59,dd，J= 12. 5， 5. 0)，H-6(l. 27,ddd，J= 11. 0,3. 0,1. 0)，H-6(l. 59,m)，H-7(2. 06,m)，H-7(l. 60,m)， H-8(2. 57,m)，88,dd，J= 16. 0,7. 5)，04,m)，H-12(5. 61，dd，J= 8. 5， I. 5)，H-14 (6. 30,m)，H-15 (7. 37,t，J=I. 5)，H-16 (7. 29,m)，H-19 (4. 10,d，J= 8. 5)， H-19(4.16，dd，J= 8.5,2.0)，H-20(1.19，s);核磁共振碳譜數據Sc(ppm，DMS0-d6，150Hz): 56. 0 (CH，1-C)，58. 7 (CH，2-C)，19. 6 (CH2, 3-C)，35. 8 (CH，4-C)，47.I(C，5-C)，21.I(CH2， 6-C)，16. 3 (CH2, 7-C)，43. 3 (CH，8-C)，41. 6 (C，9-C)，73. 3 (C，10-C)，34. 9 (CH2, 11-C)， 71. 7(CH，12-C)，126. 2(C，13-C)，108. 5(CH，14-C)，144. 4(CH，15-C)，138.6 (CH，16-C)， 173. 0 (C，17-C)，175. 4 (C，18-C)，70. 3 (CH2,19-C)，26. 6 (CH3, 20-C)。結構確證數據與文獻報 道一致，因此可以確定本發明制備的化合物即為文獻報道的SepulturinA。
[0012] 實施例2:SepulturinA的藥理作用試驗
[0013] -、材料和儀器
[0014] 新生1~3天SD大鼠乳鼠（SPF級），雌雄不拘，由廣西醫科大學實驗動物中心提 供（試驗動物生產許可證：SCXK桂2009-0002)。S印ulturinA(純度彡98%)為自制。胎 牛血清購于HyClone公司，DMEM培養基購于GIBCO公司，二甲基亞砜（DMSO)、0. 25 %胰酶 (含EDTA)購于Solarbio公司，5-溴脫氧尿苷（5-Brdu)、四甲基偶氮唑鹽（MTT)購于美國 Sigma公司，LDH測試盒購于南京建成生物工程研究所，NOS試劑盒（分型）南京建成生物 工程研究所，ATP酶試劑盒（南京建成生物工程研究所），cTnl酶聯免疫吸附測試試劑盒、 CK-MB酶聯免疫吸附測試試劑盒購于武漢優爾生。
[0015]CO2培養箱（ThermoForma)，CKX41 相差顯微鏡（OLUMPUS),Model450 自動酶標儀 (美國Bio-Rad公司），96孔板（JET)，722sp可見分光光度計（上海棱光技術有限公司）， 可調式微量移液器（ThermoForma)，單人單面超凈工作臺（蘇州凈化設備總廠），XD-101型 倒置生物顯微鏡（南京江南光電），DW-40L262 (低溫保存箱）、DW-86L628立式超低溫保存 箱（Haier特種電器有限公司），手提式壓力蒸汽滅菌器、立式蒸汽滅菌器（廣州華南醫藥器 械有限公司），JA2003微量天平（上海第二天平儀器廠），541?型低溫高速離心機（德國 Eppendorf)，LQP-B-4顆粒制冰機（上海安亭）。
[0016] 二、試驗方法
[0017] 1、心肌細胞的原代培養
[0018] 具體步驟：（1)超凈工作臺中，將乳鼠放置于250mL燒杯中，噴以75%酒精進行皮 膚消毒。（2)左手捏住鼠背部，右手持無菌眼科剪在胸骨正中偏左平劍突刺入胸腔，抬起剪 刀頭端，向前挑起剪一縱向切口，再平劍突往左右剪開約2cm，左手捏住背部皮膚擠壓胸部， 就可以見跳動的心臟，換無菌彎鑷將心臟取出，置于冷的PBS溶液培養皿中。用無菌眼科剪 和鑷除去心房、結締組織及細胞膜后將心臟放入IOmL西林瓶中，用冷PBS溶液反復沖洗三 遍，洗凈殘血。（3)用無菌彎剪剪碎心臟（約1~2mm大小），加入冷PBS溶液，并沖洗無菌 彎鑷，用吸管將小組織塊懸液轉移至離心管中，冷PBS再清洗兩遍。（4)第一、二次消化：按 預溫好的胰酶與組織塊以2:1的比例緩慢沿離心管壁緩慢加入，室溫下以無菌吸管反復輕 柔吹打幫助消化，觀察組織塊出現絲狀物，上清變渾濁，根據濁度停止消化，吸出第一、二次 消化的上清液，棄去。（5)繼續消化，步驟同（4)，直至小組織炔基本消化完全為止。收集細 胞懸液。（6)將所有細胞懸液過200目細胞篩，加入含10 %胎牛血清的DMEM培養液終止消 化，冷PBS洗滌，1000 rpm離心2次，每次8min，棄去上清。（7)臺盼蘭計數：（6)所得沉淀中 加入適量DMEM培養基，制成細胞懸液，取0. 4%臺盼蘭染液10yL與細胞懸液90yL混勻， 室溫放置2~3min，將清潔的細胞計數板放置在倒置顯微鏡臺上，在蓋玻片邊緣滴1~2滴 已染色好的細胞懸液，鏡檢可見圓形分散的細胞分布在各處，活細胞整體完整，透明而不著 色，而不健康細胞會著色，計數時除去，計數四大方格的細胞數。壓線的細胞只記左線和上 線者，細胞團按一個細胞計數，按以下公式計算懸液的細胞數。細胞數/mL=四大方格細胞 數總數/4X10000X稀釋倍數（8)按3XIO5~5X10 5細胞密度接種到培養瓶中，放入95 % 02, 5%CO2培養箱中差速貼壁約2h。差速貼壁后的細胞懸液接種至培養板中，前48h加入終 濃度為100ymol/L的5-Brdu，以抑制非心肌細胞的生長，置于培養箱中繼續培養。每24h 進行換液。
[0019] 2、過氧化氫誘導心肌細胞氧化應激損傷模型的建立
[0020] 選取培養3~4天、生長良好、搏動規律的心肌細胞，吸棄孔內舊培養基，換新培養 基，同時加入終濃度為600ymol/L的H2O2，重置于0)2培養箱中，常規培養24h，建立H202誘 發心肌細胞氧化應激損傷模型。
[0021] 3、實驗分組及給藥
[0022] S印ulturinA給藥設低、中、高三個劑量組，濃度分別為0? 6、6和60ymol/L;陽 性藥物維拉帕米（Verapamil)組的終濃度為25ymol/L。選擇生長良好、搏動規律的細胞， 隨機分為：正常（control);模型（Model);陽性藥物組；溶媒對照組（DMSO)!Sepulturin A低、中、高劑量，共7組，每組設6個復孔。各組均于造模前12h吸去孔內舊培養液，換成 Hanks液以使各組細胞同步生長（即平衡），各給藥組在造模前加入相應藥物預孵2h。除正 常組外，平衡后的各組細胞均按上方法加入建立心肌細胞H2O2損傷模型。造模結束后吸取 各組細胞培養上清液，-20°C冰箱保存待測生化指標。各組心肌細胞則按常規方法加入適量 0. 125%胰蛋白酶消化，4°C、800rpm離心10min，棄去上清，以生理鹽水制成2X106~3X106 細胞懸液，_80°C冰箱保存備用。
[0023] 4、MTT法測定心肌細胞存活力
[0024] 用96孔板培養的各組心肌細胞于造模后加入10yLMTT繼續培養4h，傾去培養 液，加入DMSO150yL，平板震蕩器震蕩5min，使結晶物充分溶解。以Hanks液培養調零，用 酶標儀以570/630nm雙波長測定去除本底光吸收值后的吸光度（0D值），重復3次。
[0025]5、心肌細胞培養液中LDH活力的測定
[0026] 實驗原理：乳酸脫氫酶（LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2, 4-二硝基苯肼 反應生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。樣品前處 理，按照下表進行。依照試劑盒要求將輔酶I、堿性溶液適當稀釋。
[0027]
[0028] 計算心肌細胞培養液中LDH活力：LDH活力（U/L) = (ODu-ODc)/ (ODs-ODb)XCsXNX1000。N為培養液的稀釋倍數。
[0029] 6、統計分析
[0030] 數據采用平均值土標準差（i±S)表示，應用SPSS13.0統計軟件分析處理數據， 計量資料組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。
[0031] 三、結果及結論
[0032] 1、過氧化氫損傷前后心肌細胞活力
[0033] 正常組的細胞存活率按100%計，試驗結果顯示=H2O2應激損傷后心肌細胞存活率 較正常組心肌細胞下降（P〈〇.05);DMS0溶媒組與模型組相比較，DMSO對心肌細胞存活率無 影響（P>0.05);而S印ulturinA各給藥組均能使心肌細胞存活率明顯增加（P〈0.01)。結 果見表I(*P〈〇. Olvs正常組，#P〈0.0 lvs模型組，▲PM).05vs模型組）。
[0034] 2、心肌細胞過氧化氫損傷培養液中LDH的活性
[0035] 與正常組比，模型組LDH含量明顯增高（P〈0. 01);與模型組比較，溶媒組的LDH含 量無顯著性差異（P>〇.05)，而S印ulturinA低、中、高劑量組、陽性藥物組的LDH活性明顯 降低（P〈〇.01)。結果見表2(*P〈0.0 lvs正常組，#P〈0.0 lvs模型組，▲PM).05vs模型組）。
[0036] 提示S印ulturinA可以進一步研究開發成心肌細胞保護的藥物。
[0037] 表1SepulturinA對H2O2應激損傷后心肌細胞存活率的影響（X土s, n=6)
[0038]

【主權項】
1.SepulturinA在制備心肌保護藥物中的應用，所述SepulturinA化學結構式如下，
【專利摘要】本發明公開了Sepulturin？A在制備心肌保護藥物中的應用，屬于藥物領域。研究發現SepulturinA能使H2O2應激損傷后的心肌細胞存活率明顯增加，可以進一步研究開發成制備心肌保護的藥物。
【IPC分類】A61P9/00, A61K31/365
【公開號】CN105078968
【申請號】CN201510590295
【發明人】潘光賢
【申請人】潘光賢
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月16日