一種層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及納米硒制備技術領域，具體涉及一種層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復 合物及其應用。
【背景技術】
[0002] 微管（MTs)，作為真核細胞細胞骨架的主要組成成分，參與了廣泛的細胞進程。微 管在多種細胞功能中具有重要作用，因此被作為抗腫瘤藥物比如紫杉烷類和長春花堿的胞 內靶向。這些微管結合劑能夠擾亂有絲分裂紡錘體的正常形成，隨之誘導細胞凋亡。紫杉 烷類（泰素帝和紫杉醇）代表了一類重要的靶向微管的抗腫瘤藥物，它可對肺癌、卵巢癌、 乳腺癌和白血病進行體內體外治療。然而，紫杉烷藥物首次作用后再次化療無反應或失敗， 促使內在或獲得性腫瘤細胞耐藥性嚴重制約著紫杉烷的臨床應用。許多關于紫杉烷耐藥細 胞的耐藥機制已經被提出，但只有兩種是被臨床認可的：ABC家族蛋白如P-糖蛋白（P-gp) 的過表達和微管蛋白-同型表達的改變。
[0003] 腫瘤細胞的多藥耐藥性（MDR)仍然存在于化療中，從而導致化療療效降低。作為 多耐藥蛋白I(MDRl)或者ATP結合域家族成員（ABCBl)，P-gp是一種良好的ABC轉運蛋白， 可增加胞內抗腫瘤藥物的外排從而降低其化療效果。在許多腫瘤細胞如乳腺癌和肺腺癌細 胞中，均發現P-gp的過量表達，從而導致MDR產生。逆轉P-gp介導的MDR主要包括化學抑 制劑介導的P-gp功能抑制以及RNA干擾介導的P-gp表達抑制。
[0004] 靶向微管藥物結合至β微管蛋白亞基上，從而有利于微管的組裝。已有報道，人 類中至少存在七種不同的β微管蛋白同型，它們的組成改變或突變會產生紫杉烷耐藥性。 研究也表明III型β微管蛋白mRNA和蛋白質在紫杉醇耐藥的乳腺癌患者中是明顯上調 的。然而，III型β微管蛋白可能會導致微管的動態不穩定，從而削弱紫杉醇對微管的穩 定作用，或者可能影響紫杉醇與β微管蛋白的結合。因此，越來越多研究傾向于III型β 微管蛋白，它可作為檢測癌癥病人對化療藥物臨床反應的預測性生物標記。
[0005] 硒（Se)是人類和動物體內存在的一種重要的微量必需元素。流行病學研究、臨床 前調查和臨床干預試驗支持硒化合物可被用于癌癥治療的觀點。例如，隨著納米技術的應 用，納米硒（SeNPs)在過去數十年中引起越來越多的關注，它表現出優良的抗腫瘤活性及 低細胞毒性。然而，納米硒的細胞吸收效果并不理想，這嚴重限制著它的臨床應用。
[0006] 為了克服P-糖蛋白和III型β微管蛋白介導的耐藥性，抗癌策略急需開發。

【發明內容】

[0007] 本發明所要解決的技術問題是，為了克服現有技術中的上述不足，提供一種層狀 雙金屬氫氧化物/硒納米復合物。
[0008] 本發明所要解決的上述技術問題通過以下技術方案予以實現：
[0009] -種層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物，通過如下方法制備得到：將硒鹽溶液 滴加至層狀雙金屬氫氧化物LDH水合溶液中，攪拌，然后加入還原劑，持續攪拌至反應液成 深紅色，生成物離心、洗滌、干燥后得層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物SeOLDH。
[0010] 優選地，所述的硒鹽為Na2SeO3,所述的層狀雙金屬氫氧化物為鎂鋁層狀雙金屬氫 氧化物MgAl-LDH，所述的還原劑為L-半胱氨酸。
[0011] 優選地，所述的硒鹽溶液與LDH水合溶液的體積比為1:1~3 ;硒鹽溶液中硒鹽的 濃度為1~2M，LDH水合溶液的濃度為0. 02~0. 05M。
[0012] 最優選地，硒鹽溶液與LDH水合溶液的體積比為1:2 ;硒鹽溶液中硒鹽的濃度為 1M，LDH水合溶液的濃度為0. 025M。
[0013] 優選地，所述的層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物還負載有siRNA，其負載方法 為：將SeOLDH與siRNA溶于PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液中，室溫下孵育30~90min，得SeO LDH-siRNA ;所述SeOLDH與siRNA的質量比為1~16:1。
[0014] 更優選地，所述的 siRNA 選自 PsiRNA、TsiRNA 和 / 或 MocksiRNA ;得 SeO LDH-PsiRNA、SeOLDH-TsiRNA 或 SeOLDH-MocksiRNA。
[0015] 所述siRNA的序列為：
[0016] PsiRNA :5'-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUTT-3' ；
[0017] TsiRNA :5,-UCUCUUCAGGCCUGACAAUTT-3,；
[0018] MocksiRNA :5, -CCUACGCCACCAAUUUCGU-3,。
[0019] 最優選地，所述的 siRNA 選自 PsiRNA 和 TsiRNA，得 SeOLDH-pooled siRNAs，其中 PsiRNA和TsiRNA的摩爾比為1:1。
[0020] 上述層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物在制備抗癌藥物中的應用。
[0021] 上述層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物作為抗癌藥物或基因的傳送體系或載 體的應用，
[0022] 上述層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物作為微管穩定劑、P-糖蛋白調控劑、 β -tubulin III 調控劑、PI3K/AKT/mT0R 信號通路抑制劑、MAPK/ERK 抑制劑或 caspase-3 激活劑的應用。
[0023] 有益效果：（1)亞硒酸鹽首先嵌插于LDHs的夾層并經還原形成SeOLDH納米，然 后通過帶正電的SeOLDH和帶負電的siRNAs間的靜電作用力復合多種siNRAs，可以作為 傳送體系，促進siRNA和藥物的有序釋放，同時增加胞內藥物的濃度從而恢復耐藥細胞對 紫杉醇的敏感性；（2)本發明所述的SeOLDH能夠與siRNA形成穩定的納米級粒子，并保 護siRNA免受降解；SeOLDH具有良好的輸送siRNA進入細胞的能力；（3)本發明還發現， SeOLDH可以作為一種微管穩定劑，能夠阻遏細胞周期于G2期，擾亂正常有絲分裂紡錘體 的形成，誘導細胞凋亡從而抑制細胞增殖；⑷當SeOLDH復合不同siRNA傳送體系后，SeO LDH/siRNA，特別是SeOLDH-pooled siRNAs，表現出高效的基因沉默效應，能夠下調P-gp和 β-tubulin III 的表達；（5)此外，SeOLDH-pooled siRNAs 能夠通過改變 Bcl-2/Bax 的表 達、激活caspase-3及調控PI3K/AKT/mT0R和MAPK/ERK途徑誘導細胞凋亡。
【附圖說明】
[0024] 圖1為層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物SeOLDH的透射電鏡（TEM)圖。
[0025] 圖2為SeOLDH基因負載試驗圖；其中A為LDH/siRNA凝膠電泳圖；B為SeOLDH/ siRNA凝膠電泳圖；C為SeOLDH-siRNA和LDH-siRNA的siRNA的釋放速率曲線圖。
[0026] 圖3為細胞中siRNA吸收效率圖；其中A為MCF-7細胞中siRNA吸收效率圖，B為 MCF-7/ADR細胞中siRNA吸收效率圖。
[0027] 圖4為微管紅色熒光探針檢測微管蛋白聚集圖。
[0028] 圖5為本發明層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物對P-gp和β -tubulin III的 影響圖；其中A為P-gp在MCF-7/ADR和MCF-7細胞中的表達水平圖，B為β -tubulin III 在MCF-7/ADR和MCF-7細胞中的表達水平圖，C為轉染本發明層狀雙金屬氫氧化物/硒納 米復合物后，P-gp和β-tubulin III在MCF-7/ADR細胞中的表達水平圖。
[0029] 圖6為SeOLDH-pooled siRNAs對細胞凋亡相關蛋白的影響圖；其中A為轉染SeO LDH-pooled siRNAs后對MCF-7/ADR細胞內磷酸化的AKT和ERK表達影響圖；B為轉染SeO LDH-pooled siRNAs 后對 MCF-7/ADR 細胞內 Bcl-2、Bax 和 caspase-3 表達影響圖。
【具體實施方式】
[0030] 以下結合具體實施例來進一步解釋本發明，但實施例對本發明不做任何形式的限 定。
[0031] 實施例1層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物SeOLDH的制備
[0032] 將Mg(N03)2(3mmol)和Al (NO3)3(Immol)溶角軍于IOmL去離子水中，并快速加入至Ij 40mL NaOH溶液（6mmol)中；混合物于室溫下攪拌10min，并離心（5min，4500min》收集所 得泥漿；用40mL去離子水分別洗滌兩次，離心后重懸于50mL去離子水中；將所得不均勻的 懸浮液轉移到反應釜中，l〇〇°C加熱16h，即可制得透明、均勻的層狀雙金屬氫氧化物納米溶 膠；溶膠中含有將近4mg/mL均勻分散的MgAl-LDH納米粒子；
[0033] 將一定量的似236〇3溶液（lmL，1M)滴加至MgAl-LDH納米粒子的水合溶液（2mL， 0.025M)中，并持續攪拌30min ;接著，將L-半胱氨酸（L-Cys)加入混合液中，持續攪拌直至 反應液成深紅色；生成物經離心洗滌，即得SeOLDH納米溶膠，納米溶膠經高速離心（30min， 1000 Omin1)并于60°C烘箱中進行干燥，得到紅色固體粉末。粒子在透射電鏡（TEM，加速電 壓80kV)下進行觀察拍攝，如圖1所示，SeOLDH的平均粒徑為116nm。
[0034] 實施例2層狀雙金屬氫氧化物/硒納米復合物SeOLDH-siRNA的制備
[0035] 將IOOnM siRNA和不同質量的SeOLDH于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7. 4)中，在室 溫（25°C )下孵育30min，即得不同質量比的SeOLDH-siRNA，其中SeOLDH與siRNA的質量比 分別為 1:1，2:1，4:1，8:1 和 16:1 ;
[0036] 所述的 siRNA 選自 PsiRNA、TsiRNA 或 MocksiRNA ;得 SeOLDH-PsiRNA、SeO LDH-TsiRNA 或 SeOLDH-MocksiRNA。
[0037] 所述的 siRNA 選自 PsiRNA 和 TsiRNA 的混合，得 SeOLDH-pooled siRNAs，其中 PsiRNA和TsiRNA的摩爾比為1:1。
[0038] 對比例I LDH-siRNA的制備
[0039] 將IOOnM siRNA和不同質量的MgAl-LDH混于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH = 7. 4)中， 在室溫（25°C )下孵育30min，即得不同質量比的LDH-siRNA，其中MgAl-LDH與siRNA的質 量比分別為 1:1，2:1，4:1，8:1 和 16:1。
[0040] 實施例3 SeOLDH基因負載試驗
[0041] 瓊脂糖凝膠電泳用來檢測SeOLDH和MgAl-LDH結合siRNA的能力。不