人源抗菌肽ll-37在制備治療或預防血栓性疾病藥物中的應用
【技術領域】 本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及人源抗菌肽LL-37在制備治療血栓性疾病的 藥物及在制備預防血栓、抗凝血、降血稠類功能性食品中的新醫藥用途。
【背景技術】
[0002] 隨著人們生活水平的不斷提高，高膽固醇、高血脂癥、動脈粥樣硬化及其引發的心 腦血管血栓栓塞性疾病的發病率逐年增加。血栓性疾病是由血栓引起的血管腔狹窄與閉 塞，使主要臟器發生缺血和梗塞而引發機能障礙的各種疾病，屬于心腦血管疾病。機體的正 常止凝血，主要依賴于完整的血管壁結構和功能、有效的血小板質量和數量、正常的血漿凝 血因子活性。血栓形成的原因，簡單地說是隨著人年齡的增長，體內纖溶系統功能逐漸降 低，血液中凝血與抗凝血功能失去平衡而出現異常凝血，即血栓。
[0003] 血栓性疾病的發病率、致死率和致殘率非常高。它是嚴重危害人類健康的疾病之 一，也是世界各國醫藥學家研宄的熱點。目前臨床上用于血栓預防和治療的藥物主要分為3 類，抗血小板的藥物、抗凝血的藥物和溶解血栓的藥物。從天然來源中尋找新的活性成分， 并進而研制新的藥物也是當今攻克臨床頑疾的重要途徑，本發明揭示了人源抗菌肽LL-37 具有抗血栓作用，以期為尋找新的抗血栓疾病的原料提供科學依據。
[0004] LL-37屬于人源抗菌肽，廣泛存在于人體骨髓、淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、 消化道及生殖器的上皮細胞中。LL-37的前體蛋白是hCAP-18,該前體蛋白包含一個信號肽 區域、一個Cathelin保守區及一個由37氨基酸所組成的抗菌活性區。一旦hCAP-18從激 活的細胞中分泌后，將通過絲氨酸蛋白酶-3或其他蛋白水解酶的作用剪切信號肽，釋放出 有活性的LL-37。之所以被稱為LL-37,是由于該活性多肽包含37個氨基酸殘基，其N末端 的前兩個氨基酸殘基為亮氨酸（Leucine)。研宄表明，LL-37具有廣譜抗微生物的活性，不 僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強的殺菌活性，同時對許多 臨床耐藥細菌同樣具有作用。它是脊椎動物自然免疫的關鍵因子，發揮著重要的抗微生物 感染和病原體入侵效應，是連接自然免疫和特異性免疫的橋梁。此外，LL-37還具有許多其 他重要的生物學活性，如對包括中性粒細胞和單核細胞等在內的多種免疫細胞具有化學趨 化作用，誘導肥大細胞脫顆粒和釋放組織胺，還能調節巨噬細胞的轉錄、促進血管新生、愈 合傷口、在癌細胞中的上調表達，調節單核細胞分泌IL-8和IL-I β，調控DCs和巨噬細胞的 分化誘導變異細胞凋亡等。因此，LL-37-直是國際上的研宄熱點。以LL-37為原料進行 食品、藥品開發則蘊含著巨大的應用前景。
[0005] 本發明研宄的人源抗菌肽LL-37在預防和/或治療血栓性疾病中的應用，經文獻 檢索，未見與本發明相同的公開報道。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供人源抗菌肽LL-37在預防和/或治療血栓性疾病中的應 用。
[0007] 本發明具體技術方案如下： 人源抗菌肽LL-37及其修飾肽在制備預防和/或治療血栓性疾病藥物及在制備預防血 栓、抗凝血、降血稠類功能性食品中的應用，所述人源抗菌肽LL-37氨基酸序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0008] Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys He Gly Lys Glu Phe Lys Arg He Val Gln Arg He Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val Pro Arg Thr Glu Ser (SEQ ID NO ：1)〇
[0009] 人源抗菌肽LL-37的分子量為4493Da。
[0010] 可采用現有技術領域常規方法對源抗菌肽LL-37進行修飾得到修飾肽。
[0011] 對于蛋白質和肽類藥物，在多數情況下，機體內的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見 的直鏈肽的兩端進行逐步的切割分解，使直鏈肽被降解。多肽修飾是改變肽鏈主鏈結構和 側鏈基團的重要手段，已有大量文獻表明經過修飾后的多肽藥物可以顯著降低免疫原性、 減少毒副作用、增加水溶性、延長體內作用時間、改變其生物分布狀況等等，明顯改善藥物 的療效。
[0012] 多肽類藥物常用修飾方法包括主鏈末端的修飾、中間殘基的修飾、環化、氨基酸替 換、糖基化修飾及PEG修飾等。
[0013] PEG修飾可以通過增加多肽分子的相對分子量和空間位阻，提高其對多肽水解酶 的穩定性，減少腎小球的濾過作用。PEG化原理是將PEG末端羥基轉化成高反應活性基團， 與蛋白質的巰基、氨基、羧基或是羥基進行偶聯反應，生成PEG-蛋白質偶聯物。目前，PEG修 飾蛋白質和多肽主要是氨基修飾（包括N端氨基的酰化修飾、賴氨酸側鏈氨基的酰化修飾、 N端氨基的烷基化修飾）、羧基修飾、巰基修飾等。其中一類是定點修飾，包括N末端修飾和 半胱氨酸殘基修飾。N末端修飾通常是通過PEG-醛類修飾劑與一定量的還原劑如氰基硼 氫化鈉進行的還原烷化過程；而半胱氨酸殘基修飾是利用修飾劑與蛋白質分子的游離巰基 發生反應進行。另一類修飾反應是在蛋白質賴氨酸的ε氨基上進行的修飾，反應是隨機修 飾，反應迅速，修飾率高。
[0014] 本發明所述修飾肽是在人源抗菌肽LL-37的N端、C端或中間殘基上連接化學基 團、氨基酸、多肽、蛋白質或PEG。優選修飾肽使用PEG與人源抗菌肽LL-37氨基酸序列中的 巰基、氨基、羧基或羥基發生化學偶聯。更優選PEG的相對分子量范圍為：5kDa-50kDa。
[0015] 上述人源抗菌肽LL-37在制備預防和/或治療血栓性疾病藥物中的應用，所述血 栓性疾病是包括急性冠狀動脈綜合征、心肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞等的一系列 疾病。
[0016] 上述制備預防和/或治療為目的的治療血栓性疾病的藥物含有人源抗菌肽LL-37 及其修飾肽以及藥學上可以接受的載體。藥物劑型可為丸劑、散劑、片劑、膏劑、粉劑、針劑、 水劑、顆粒劑、注射劑或膠囊。將人源抗菌肽LL-37作為活性成分與藥物學上可接受的載 體作為賦形劑相結合，按照常規方法制成口服給藥的內服劑型或非口服給藥的注射劑；即 可制備成為治療冠心病、心絞痛、腦血栓或肺栓塞等疾病的丸劑、散劑、片劑、膏劑、粉劑、針 劑、水劑、顆粒劑、注射劑等各種劑型的藥物。
[0017] 上述預防血栓、抗凝血、降血稠類功能性食品含有人源抗菌肽LL-37及其修飾肽 以及食品學上可接受的賦形劑。所述功能性食品為粉劑、片劑、口服液或膠囊。將人源抗菌 肽LL-37作為活性成分與食品學上可接受的賦形劑相結合，按照常規方法制成粉劑、片劑、 口服液或膠囊等預防性保健食品或食品添加劑。
[0018] 人源抗菌肽LL-37可采用化學合成的方法制備得到，本發明使用的人源抗菌肽 LL-37委托寧波康貝生化有限公司合成得到。
[0019] 本發明所述的人源抗菌肽LL-37的PEG修飾肽可采用常規方法制備。例如， ① 優選平均分子量為5kDa的單甲氧基聚乙二醇（MPEG)用三氯化物（Tresyl Chloride)活化變為所需的修飾劑TMPEG ; ② 用PBS緩沖液將多肽的濃度調整為100ug/ml，然后將調整好濃度的多肽與過量的 活化的聚合物TMPEG在室溫條件下（25°C -40°C )，pH 7-9,共價反應2小時（優選溫度為 37〇C )； ③ 向反應體系中加入過量的甘氨酸再在同樣的溫度條件下孵育2小時，以反應除去剩 余的TMPEG ; ④ 反應結束后，將整個反應體系保存在4°C條件下備用； ⑤ 純化時，先將樣品用PBS緩沖液按1:10的條件稀釋，然后將整個反應混合物進行凝 膠滲透層析，所選條件為PBS洗脫的Super 〇se-12HR 10/30柱，以每分鐘0. 3ml的速度用 PBS洗脫。
[0020] 藥理藥效實驗證實，本發明所述人源抗菌肽LL-37能抑制血小板聚集，顯著延長 APTT、PT時間，具有抗血栓形成活性，能夠用于制備預防和/或治療血栓性疾病的藥物；還 可應用于制備預防血栓、抗凝血、降血稠類功能性食品的原料。
[0021] 本發明具有如下優點：
[0023] 人源抗菌肽LL-37作為存在于人體中的抗菌肽，具有有效抗凝血、抗血栓活性較 好等優點。因此，以人源抗菌肽LL-37為主要活性成分可廣泛用于預防和/或治療人類血 栓性疾病，相容性好，生物利用度高，且不易引發抗原抗體反應。
【附圖說明】
[0022] 圖1表示所述人源抗菌肽LL-37對人血小板聚集的抑制作用。
[0023] 圖2表示所述人源抗菌肽LL-37在大鼠動靜脈旁路模型實驗中的抗血栓形成作 用。
[0024] 圖3為人源抗菌肽LL-37的出血風險評估（圖3A對出血時間進行考察，圖3B對 出血體積進行考察）。
【具體實施方式】
[0025] 下面用實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但本發明的內容并不局限于 此。
[0026] 在本發明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理 解的含義。
[0027] 下面結合具體實施例并參照數據進一步詳細描述本發明。應理解，這些實施例只 是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限