口腔用組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及對于引發口腔疾病的口腔生物膜的牙周病改善效果良好的口腔用組 合物。
【背景技術】
[0002] 牙周病是出現在牙周組織的疾病的總稱，狹義上指牙齦炎、牙周炎和咬合性外傷 之類的疾病。牙周病是主要由牙菌斑引起的口腔內感染癥。人的口腔內存在700種以上的細 菌，在健康的口腔內，牙齒表面附著有鏈球菌（Streptococcus)屬和放線菌（Actinomyces) 屬等初期附著菌。其中的內氏放線菌（Actinomyces naeslundii)被認為是出血性牙銀 炎致病菌，初期附著的內氏放線菌形成生物膜而生成牙菌斑，從而使牙齦發生炎癥。有報 道稱，放線菌導致的牙齦的炎癥是通過菌體膜上的核蛋白介以牙齦上皮細胞和巨噬細胞 的TLR2產生IL-8和TNF-a而導致的。如果牙齦發生炎癥，則形成牙周袋，并伴隨出血和 銀溝滲出液的滲出，形成作為牙周病病原性細菌已知的牙銀卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis)和伴放線放線桿菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋 體（Treponema denticola)等在牙周袋生存的環境。此外，內氏放線菌不僅附著于牙齒表 面，而且與大量的口腔內細菌共凝集，從而成為牙周病病原性細菌向牙菌斑附著的基礎。由 于這些原因，內氏放線菌使初期牙菌斑轉變為后期牙菌斑（牙周病生物膜），因此近年來作 為與牙周病發生相關的重要的細菌引發關注。
[0003] 以往的牙周病預防中，殺滅牙齦卟啉單胞菌等牙周病病原性細菌來抑制牙周病是 主流的想法，但牙周病病原性細菌與生物膜一起存在于牙周袋的深處，因此抗菌物質不易 滲透，大多無法獲得預期的效果。
[0004] 為了改善這一點，專利文獻1中揭示了通過將（A)N-酰基肌氨酸或其鹽和（B)異 硫氰酸芐酯混合且使（AV(B)的質量比為0.5~20,顯示口腔生物膜抗菌效果和牙齦炎改 善效果。然而，專利文獻1中，耐藥菌出現的危險性依然很高。
[0005] 牙周病因發生牙銀炎而加重，因此可通過預防牙銀炎而更有效地預防牙周病。因 此，抑制內氏放線菌的生物膜形成的原材料可期待有效的牙周病預防效果。
[0006] 本發明人等確認了內氏放線菌的生物膜形成因酸壓力而被促進，日本蕪菁和小松 菜等5種十字花科植物和冰葉日中花的提取物具有使內氏放線菌的酸誘導性生物膜形成 量下降50~90%的活性（專利文獻2)。
[0007] 本申請中，將確認了生物膜形成抑制活性的植物提取物中活性最高且容易獲得的 日本憲菁（日本憲菁，Brassica rapa var.nipposinica)作為候選原材料，進行了詳細的 活性評價并對其活性成分的性狀確定進行了詳細研宄。
[0008] 現有技術文獻
[0009] 專利文獻
[0010] 專利文獻1:日本專利特開號公報
[0011] 專利文獻2:日本專利特開號公報
[0012] 發明的概要
[0013] 發明所要解決的技術問題
[0014] 牙周病病原性細菌與生物膜一起存在于牙周袋的深處，一直以來使用以某種牙周 病病原性細菌為靶細菌的抗菌劑的牙周病抑制法中，口腔生物膜阻礙抗菌劑的滲透，難以 發揮所設想的牙周病抑制效果。此外，出現抗藥菌的危險性高，抗菌劑的使用不理想。因此， 與采用抗菌劑的牙周病病原性細菌的控制相比，進行初期牙周病病原性細菌的生物膜形成 的控制被認為是更安全且有效的牙周病預防法。
[0015] 解決技術問題所采用的技術方案
[0016] 本發明人等進行了認真研宄，發現日本蕪菁的提取物對由酸誘導的內氏放線菌的 生物膜形成具有抑制效果。提取溫度越低，該抑制效果越高。對日本蕪菁的活性成分進行 了分離，推測活性成分為分子量10kDa以上的成分，發現活性部分中所含的成分的80%以 上為蛋白質，從而完成了本發明。日本蕪菁提取物對內氏放線菌的增殖不產生影響，因此被 認為作用機理與抗菌作用不同。
[0017] 內氏放線菌是從牙齦炎和根面齲部位被發現的革蘭氏陽性桿菌，被認為是初期的 牙周病病原性細菌。由于與鏈球菌和牙周病病原性細菌共凝集，因此是向牙周病菌斑的菌 群迀移的關鍵細菌，認為內氏放線菌的控制可用于牙周病預防。本發明人等的研宄中，確認 生物膜形成因牙周病病原性細菌產生的丁酸等酸而增加。
[0018] 發明的效果
[0019] 本發明的包含日本蕪菁提取物的口腔用組合物顯著地抑制初期牙周病病原性細 菌的生物膜形成，所以可用作比抗菌劑更安全且有效的牙周病預防法。
[0020] 附圖的簡單說明
[0021] 圖1為基于提取溫度的不同的生物膜形成抑制活性的比較。
[0022] 圖2為基于提取溫度的不同的生物膜形成抑制活性的比較。
[0023] 圖3為日本蕪菁冷水提取物的在羥磷灰石上的生物膜形成抑制活性。
[0024] 圖4A為口腔內臨床分尚株的系統分析。
[0025] 圖4B為口腔內臨床分尚株的系統分析。
[0026] 圖5為日本蕪菁冷水提取物對臨床分離株的生物膜形成抑制活性。
[0027] 圖6為流動池中的日本蕪菁冷水提取物的生物膜形成抑制活性。
[0028] 圖7為采用共聚焦激光顯微鏡的生物膜觀察圖。
[0029] 圖8為日本蕪菁冷水提取物、日本蕪菁冷水提取物的采用透析處理的透析內液、 透析外液的生物膜形成抑制活性的比較。
[0030] 圖9為日本蕪菁冷水提取物透析內液的陰離子交換層析的結果。
[0031] 圖10為日本蕪菁冷水提取物透析內液的硫酸銨分離部分的生物膜形成抑制活 性。
[0032] 圖11為日本蕪菁冷水提取物透析內液的硫酸銨分離物的陰離子交換層析的結 果。
[0033] 圖12為摻入日本蕪菁冷水提取物的口香糖的生物膜形成抑制活性。
[0034] 實施發明的方式
[0035] 本申請的發明涉及包含日本蕪菁提取物的口腔用組合物。
[0036]另外，本申請的發明涉及所述日本蕪菁提取物為冷水提取物的口腔用組合物。 [0037] 此外，本申請的發明涉及包含日本蕪菁提取物的牙周病生物膜形成抑制劑。
[0038]另外，本申請的發明涉及所述日本蕪菁提取物為冷水提取物的酸誘導生物膜形成 抑制劑。
[0039] 此外，本申請的發明涉及由上述口腔用組合物形成的漱口劑、牙膏劑、吸入劑、含 片劑和食品。
[0040] 以下，通過實施例對本發明進行具體說明。本申請的發明并不局限于這些實施例。 實施例
[0041](實施例1)
[0042] 日本蕪菁提取物的制備方法：
[0043] 購入市售的日本蕪菁（茨城縣產），冷凍干燥，從而制備日本蕪菁干燥葉。將日 本蕪菁干燥葉細碎粉碎，以lg該粉碎的日本蕪菁干燥葉對應50ml去離子蒸餾水的比例在 70°C、室溫和4°C下進行2小時的提取。抽濾所得的提取液，以13000Xg ? 10分鐘離心，將 其上清冷凍干燥后的產物作為日本蕪菁提取物供于試驗。
[0044] (實施例2)
[0045] 生物膜形成試驗
[0046] (實施例 2_1)
[0047] 使用96孔微量滴定板的生物膜形成
[0048] 將內氏放線菌ATCC19039或放線菌臨床分離株用5ml的腦心浸液（BHI)液體培養 基在37°C的厭氧條件下培養一晚至穩定期，以llOOXg ? 10分鐘離心而集菌。以同樣的條 件用PBS離心清洗3次，將用PBS調至0. D. 66tol= 0. 3的產物作為供試菌懸浮液供于試驗 體系。
[0049] 生物膜形成用96孔微量滴定板進行。向各孔中添加100 y 1的0. 5%蔗糖添加2X 胰酪胨大豆肉湯（TSB)培養基、50 y 1試驗樣品、20 y 1的125mM丁酸、20 y 1供試菌懸浮液、 10 y 1的PBS，以37°C、5% C02的條件下進行16~20小時的培養。
[0050] (實施例 2-2)
[0051] 96孔微量滴定板上的生物膜形成量的定量
[0052] 將按照實施例2-1培養而得的培養上清傾析，用200 y 1的PBS清洗各孔后添加 100 y 1的0. 25%番紅溶液（日水制藥株式會社），靜置15分鐘而對生物膜染色。將番紅溶 液傾析后用去離子蒸餾水清洗2次，干燥后添加100 y 1的70%乙醇，振蕩30分鐘而溶出番 紅，用酶標儀測定492nm的吸光度，對生物膜量進行定量。
[0053] 通過上述的實施例，對從日本蕪菁以70°C、室溫、4°C的各條件下提取而得的各日 本蕪菁提取物的單位重量的比活性進行了評價，結果在4°C的條件下提取而得的冷水提取 物的比活性最高（圖1和圖2)。此外，日本蕪菁冷水提取物對內氏放線菌的增殖未顯示影 響。
[0054] 因此，以日本蕪菁冷水提取物作為放線菌生物膜抑制原材料的候選材料，對在人 口腔內是否有顯示活性的可能性進行進一步的研宄。