莢果蕨總三萜保護慢性酒精肝損傷的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及莢果蕨總三萜保護慢性酒精肝損傷的應 用。
【背景技術】
[0002] 目前，肝病已成為全世界普遍困擾人類健康的疾病之一。肝損傷是指肝臟受到外 界因素的入侵，從而導致的其結構和功能受損。根據造成肝臟損傷的原因不同，可將其大致 分為三種類型：藥物性肝炎、酒精性肝炎和病毒性肝炎。
[0003] 酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD)是指攝入酒精過量而引起的肝臟 損傷等一系列病變。中華醫學會肝臟學分會依據病變的程度對ALD制定了病理診斷標準， 按組織學一般分為5種類型：輕度酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維 化以及酒精性肝硬化。近年來，隨著人們生活水平和方式的不斷提高和改變，在亞洲甚至全 球，酒精性飲料的消耗日益增加，而肝臟是酒精在機體內代謝的主要組織器官，容易受到其 損傷。因此，酒精性肝病的發病率呈逐年上升趨勢，已成為繼病毒后導致肝損傷的第二大病 因，引起社會各界人士的關注。
[0004] 糖皮質激素、聯苯雙酯和秋水仙堿等藥物可用于治療輕微的肝損傷，因其副作用 較大而不在市場占據優勢。近年來更多的學者開始探索具護肝且安全高效的天然藥物用于 肝損傷的治療。一些天然類中草藥如：丹參、黃芩、山楂、茯苓、以及柴胡等已被證實具有保 護酒精性肝損傷的功效，其有效藥用成分可通過抑制和有效清除脂質過氧化產生的大量對 人體有害的自由基而起到護肝功效。因此，開發治療肝損傷的天然藥物已迫在眉睫。
[0005] 酒精性肝損傷的發病機制目前尚不明確，主要包括乙醇及其代謝產物乙醛對肝臟 的損傷機制、氧化應激機制、脂質過氧化的作用、內毒素、免疫和炎癥等作用，此外營養不 良、機體缺氧及病毒等眾多因素都會加重肝臟損傷。
[0006] 莢果蕨（Matteuccia struthiopteris (L. ) Todaro)又名莢果蕨貫眾、廣東菜、黃瓜 香，是球子蕨科（Onocleaceae)莢果蕨屬（MatteucciaTodaro)多年生草本植物。葉二型簇 生，營養葉是1~2回羽狀復葉，孢子葉羽片向外反卷呈莢果狀，在分類地位中屬于高等植 物中較低等的一類植物，可通過孢子和營養兩種方式進行繁殖。
[0007] 莢果蕨含多種藥用成分，如多糖、黃酮、留萜類等，是我國主要的五種貫眾之一，可 全株入藥，具有清熱解毒、殺蟲、抗氧化及保肝等多種功效。同時，它富含蛋白質、脂肪、碳 水化合物、粗纖維等多種營養成分，其營養價值極高；此外，莢果蕨株型美觀，秀麗典雅，觀 賞價值極高，是園林造景和室內觀賞的優良材料，它是集藥用、食用和觀賞三者為一體的蕨 類資源植物，在我國它主要分布在東北、華北、川陜及西藏等地，且多生長于山谷、河岸等濕 地。截至目前，有關莢果蕨化學成分及其藥理和機制研宄較少。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于提供莢果蕨總三萜保護慢性酒精肝損傷的應用，從莢果蕨中提 取的主要活性成分莢果蕨總三萜可用于制備保護慢性酒精肝損傷的藥物。
[0009] 本發明是通過以下技術方案來實現：
[0010] 本發明公開了莢果蕨總三萜在制備慢性酒精肝損傷的藥物和/或保健品中的應 用。
[0011] 所述的藥物和/或保健品為緩解肝臟受損程度的藥物和/或保健品。
[0012] 所述的藥物和/或保健品為延緩脾臟或胸腺退化的藥物和/或保健品。
[0013] 所述的藥物和/或保健品為延緩肝損傷免疫器官衰老和萎縮的藥物和/或保健 品。
[0014] 所述的藥物和/或保健品為降低血清中谷丙轉氨酶及谷草轉氨酶含量的藥物和/ 或保健品。
[0015] 所述的藥物和/或保健品為降低脂質過氧化產物水平的藥物和/或保健品。
[0016] 所述的藥物和/或保健品為升高肝臟組織SOD含量的藥物和/或保健品。
[0017] 所述的藥物和/或保健品為降低肝臟組織MDA含量的藥物和/或保健品
[0018] 與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
[0019] 本發明公開了莢果蕨總三萜保護慢性酒精肝損傷的應用，本發明采用劑量遞增的 飲酒方法造模，模擬人類慢性酒精誘導的肝臟損傷過程。GOT和GPT生化指標說明莢果蕨 總三萜在一定程度上能抑制G0T、GPT，且抑制作用與給藥劑量呈正相關。MDA和SOD生化指 標說明總三萜純化物有較強的體內抗氧化能力，其保肝機制可能是通過增強機體的抗氧化 能力并有效清除不利自由基從而達到有效緩解酒精對肝臟造成的損傷。莢果蕨總三萜純化 物中、高劑量能有效緩解肝臟內脂質過氧化、自由基攻擊等造成的氧化損傷，降低肝細胞腫 大、壞死和脂肪變性的程度，調節細胞恢復正常的代謝和生理功能，其效果在一定濃度范圍 內優于陽性對照藥聯苯雙酯，表明莢果蕨總三萜對慢性酒精性肝損傷有一定的保護作用。
[0020] 與現有口服解酒保肝藥相比，本發明的莢果蕨總三萜更安全、更有效、無毒副作 用，且作用機理多效應、多靶點、多功能。因此，莢果蕨總三萜在改善慢性酒精性肝損傷方面 具有可觀的開發和應用價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1為莢果蕨總三萜純化物對慢性酒精性肝損傷小鼠肝臟組織病理變化的影響 結果顯微照片；
[0022] 其中，A為正常對照組；B為模型組；C為聯苯雙酯組；D為莢果蕨總三萜低劑量組； E為莢果蕨總三萜中劑量組；F為莢果蕨總三萜高劑量組。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而 不是限定。
[0024] 一、實驗材料
[0025] 莢果蕨采自陜西省寧陜縣旬陽壩鎮，經陜西師范大學生命科學學院馬驥副教授 鑒定為球子蕨科（Onocleaceae)莢果蕨屬（MatteucciaTodaro)的莢果蕨（Matteuccia struthiopteris);雄性昆明種小鼠70只（體重18±2g)，由第四軍醫大學動物實驗中心提 供。
[0026] 實驗試劑：無水乙醇，二甲苯，氯化鈉，鹽酸購于天津市天力化學試劑有限公司； 多聚甲醛，蘇木精，切片石蠟，聯苯雙酯，中性樹膠，伊紅購于北京化學試劑公司；醫用谷丙 轉氨酶（GPT)，谷草轉氨酶（G0T)，丙二醛（MDA)，超氧化物歧化酶（SOD)購自南京建成生物 工程研宄所。
[0027] I. 1材料預處理莢果蕨根狀莖一清水洗凈一陰干一粉碎一過60目篩一石油釀脫 脂一瞭干一莢果蕨粉。
[0028] 1. 2總三萜純化物的制備
[0029] 以料液比為lg:30mL的比例，將經過預處理的莢果蕨粉加入60%的無水乙醇，在 超聲功率為300W，溫度為63°C下超聲39min，提取兩次，合并粗提液旋蒸揮去乙醇，冷凍干 燥成粉末得粗提物，其純度為28. 61 %。用蒸餾水將粗提物復溶并稀釋到一定濃度，經AB-8 大孔吸附樹脂純化，最佳吸附參數：上樣濃度I. 96mg/mL，上樣流速2. OmL/min，樣液pH = 5,最大上樣量達5BV ;最佳洗脫參數：60 %乙醇，洗脫速度2. OmL/min，洗脫體積4BV。在 最佳參數下純化，洗脫液冷凍干燥后得總三萜純化物并作為保肝藥理實驗材料，其純度達 82. 32%，精制倍數達2. 88。
[0030] 二、實驗方法
[0031] 1、酒精誘導的慢性小鼠肝損傷動物模型的建立小鼠的飼養
[0032] 將雄性昆明種小白鼠飼養在通風良好，溫度和濕度均適宜的實驗室內，自由取食 飲水，適應性喂養7天。
[0033] 將喂養一周后的小鼠稱重，除正常組和模型組為10只外，其余組各12只，隨機 分成6組，即正常對照組（空白組，Normal)，酒精誘導的肝損傷模型對照組（Model)，聯 苯雙酯陽性對照組（BP)，莢果蕨總三萜（MST)低劑量組（Lower)，莢果蕨總三萜中劑量組 (Middle)，莢果蕨總三萜高劑量組（High)。各組給藥方案如表1所示：
[0034] 表1小鼠分組與給藥劑量
[0036] 灌胃4周，在整個實驗過程中，先灌胃供試藥物，后灌胃酒精，分別于上午10點和 下午14點灌胃。酒精給予的方式采取遞增法灌胃即隨著小鼠體重的增長，酒精濃度隨之遞 增。實驗開始的第1-4天給予的酒精濃度是30%，5-9天是35%，10-15天是40%，16-20 天是45 %，21-25天是50 %，26-30天則為55 %。上午空白組灌胃0. 9 %生理鹽水，陽性組 給予聯苯雙酯，低、中、高劑量組給予相應濃度的莢果蕨總三萜純化物。下午14點除空白組 外，其余各組都灌胃不同濃度的酒精。
[0037] 末次給酒后，所有小鼠禁食不禁水14h后，乙醚麻醉處理，眼球取血置于I. 5mL的 PE管中，取血后斷頸處死，立即解剖取出肝臟、脾臟，用生理鹽水清洗后并稱重記錄。
[0038] 2、血清及肝組織勻漿的制備
[0039] 將采集的血液在3000r/min下低溫離心10min，分離上層血清保存于-20°C的冰 箱中備用。將肝臟用_4°C的生理鹽水沖洗干凈，每組小鼠隨機選取3塊肝臟，在肝小葉部 分剪取5 X 5mm大小的方塊，用4%的多聚甲醛固定液固定，用于石賭切片的制作。同時稱 取Ig肝臟，在低溫條件下加入適量生理鹽水并用勻漿機研磨，制成10%的肝臟勻漿液，在 3000r/min下低溫離心10min，分裝上清液放于-20°C冰箱備用。
[0040] 3、臟器指數測定
[0041] 小鼠斷頸處死后，取其肝臟、胸腺和脾臟，生理鹽水沖洗干凈并稱量濕重，計算各 臟器指數。計算公式如下：
[0042] 臟器指數（％ )=(臟器重量/小鼠體重）X 100%
[0043] 4、肝臟組織病理學石蠟切片的制作
[0044] 制作流程：固定（4%多聚甲醛）一脫水（乙醇梯度）一透明（二甲苯）一包埋 (軟蠟，硬蠟）一切片一脫蠟（二甲苯）一染色（H&E)-封片（中性樹脂）一鏡檢。
[0045] (1)透明：取出在福爾林固定液中固定了 12小時的小鼠肝臟組織塊，用 50% -100%的乙醇梯度洗滌，逐漸脫去組織中的水分，并用二甲苯透明。
[0046] (2)石蠟包埋：將已透明的肝臟組織塊按組別分別放于盛有已熬好的軟蠟的蠟杯 中，放于40°C保溫箱里，待石蠟完全浸入組織塊后，用硬蠟進行包埋。
[0047] (3)切片：將包埋好的蠟塊修好后，用切片機連續切片，其厚度為6μπι，附于用固 定液處理好的載玻片上進行貼片，40 °C恒溫烘干。
[0048] (