緩釋氯己定無定形磷酸鈣納米顆粒的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種負載氯己定的無定形磷酸鈣納米顆粒及其制備方法，特別涉及一 種可用于保護牙本質I型膠原，促進其再礦化的負載氯己定無定形磷酸鈣納米顆粒的制備 方法。
【背景技術】
[0002] 粘接酸蝕牙本質或累及牙本質的齲壞均存在暴露的膠原纖維被基質金屬蛋白酶 (MMPs)破壞的問題，這將導致粘接界面和牙本質的破壞。研究者們不斷試圖通過仿生礦化 手段促進暴露的膠原纖維再礦化，使足夠小的羥基磷灰石晶體替換膠原纖維網纖維內外的 水分，避免膠原纖維的暴露和酶解。無定形磷酸鈣是羥基磷灰石形成過程中的一種無定形 中間相，存在于牙本質形成的初始階段。通過這一中間相的轉變，生物體可以克服經典晶體 成核需要的能壘，從而更為高效地合成羥基磷灰石。研究表明，無定形磷酸鈣及其復合材料 無細胞毒性，生物活性良好、細胞黏附性高，能夠促進細胞增殖、提高堿性磷酸酶活性并促 進骨橋蛋白的合成，目前廣泛應用于生物醫學領域，包括用于骨科材料、組織工程支架、釋 藥載體等。然而膠原纖維再礦化過程緩慢，礦化過程中膠原纖維容易被持續作用的MMPs破 壞，使再礦化過程缺乏模板而失敗。氯己定是最常被研究的MMPs抑制劑，可以有效防止膠 原纖維降解，只是目前研究大多使用氯己定溶液，無法長期有效發揮作用。
[0003] 為此，本發明擬將上述兩種問題結合，通過制備負載氯己定的無定形磷酸鈣納米 顆粒，期望實現氯己定的緩釋，從而實現牙本質再礦化過程中長期有效保護膠原纖維，提高 再礦化的時效性。所用設備簡單，方法易行。

【發明內容】

[0004] 本發明提供一種負載氯己定無定形磷酸鈣納米顆粒的制備方法，產物尺寸小，外 形為較規則的球形，長效釋放氯己定和鈣磷離子，并能隨PH降低加快釋放鈣磷離子的速 度，可能應用于口腔直接粘接修復材料領域。
[0005] 牙本質膠原纖維仿生礦化過程中，膠原纖維易受到MMPs酶的降解，導致膠原纖維 仿生礦化失敗。氯己定可以抑制MMPs酶的活性，從而保護膠原纖維。本發明通過研制負載 氯己定的無定形磷酸鈣納米顆粒，提高牙本質仿生礦化的時效性。
[0006] 本發明的方法特點是可以在仿生礦化過程中，利用氯己定保護膠原纖維，使膠原 纖維仿生礦化得以順利進行。
[0007] 本發明的緩釋氯己定無定形磷酸鈣納米顆粒（也稱無定形磷酸鈣納米球）。本發 明以可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽作為鈣磷源，包覆醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己定，以聚丙 烯酸作為穩定劑，以非離子表面活性劑囊泡為模板制得所述無定形磷酸鈣納米顆粒。具體 的，本發明的方法包括下述步驟：
[0008] 1)制備含氯已定的非離子表面活性劑囊泡懸浮液；
[0009] 2)在攪拌下，在步驟1)制備的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液體系中加入可溶 性鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液，反應得到無定形磷酸鈣納米顆粒的懸浮液；
[0010] 3)在所述步驟2)得到的磷酸鈣納米顆粒的懸浮液中加入不同濃度穩定劑，攪拌 均勻，然后離心得到沉淀，將沉淀洗滌、真空干燥得到無定形磷酸鈣納米顆粒。
[0011] 本發明原理首先通過調整制備過程中氯己定溶液的濃度，得到不同載藥量的負載 氯己定無定形磷酸鈣納米顆粒，以期實現氯己定在膠原纖維再礦化過程中的持續保護作 用。其次，超聲形成的納米尺寸非離子表面活性劑囊泡能夠作為模板，輔助磷酸鈣包覆氯己 定，之后去除模板，得到納米顆粒。
[0012] 所述步驟1)中，所述含氯已定的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液中，所述氯己定 的質量百分濃度為2-20% ;可根據所需載藥量進行調整。
[0013] 所述步驟1)中，制備非離子表面活性劑囊泡的懸浮液的方法包括制備含有非離 子表面活性劑（如SpanSO或TweenSO)、氯已定（不同濃度的醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己 定）和聚乙二醇的溶液，超聲得到納米尺寸非離子表面活性劑囊泡的懸浮液；所述非離子 表面活性劑為SpanSO或TweenSO ;所述氯已定為醋酸氯己定或葡萄糖酸氯己定。所述氯己 定與Span80或Tween80的重量比不限。
[0014] 所述步驟1)中，所述超聲步驟的條件為20-25°C，30-50KHz超聲10-30分鐘；所述 超聲步驟的條件優選20-25°C，40KHz超聲30分鐘。所述含有非離子表面活性劑，氯已定和 聚乙二醇的溶液中，非離子表面活性劑的濃度為0. 10-0. 20g/mL，優選0. 20g/mL，聚乙二醇 的濃度大于〇. 01g/mL，優選0. 01g/mL。所述含有非離子表面活性劑、氯已定和聚乙二醇的 溶液以緩沖溶液為溶劑配制，所述緩沖溶液為Tris-HCl緩沖溶液；所述緩沖溶液優選為pH 為 8. 0、0· 5mol/L 的 Tris-HCI 緩沖液。
[0015] 所述步驟2)中，所述鈣鹽溶液和磷酸鹽溶液的添加，鈣、磷元素摩爾比為1~2,優 選 1. 3 :1。
[0016] 在本發明的一個技術方案中，所述鈣鹽為可溶性鈣鹽，如氯化鈣、碳酸氫鈣；所述 磷酸鹽為可溶性磷酸鹽優選為磷酸氫二鈉。所述鈣鹽溶液的濃度為0. 〇5mol/L以上，優選 為0· 13mol/L ;所述磷酸鹽溶液的濃度為0· 05mol/L以上，優選為0· lmol/L。
[0017] 所述步驟2)中，所述反應的溫度為20-25°C，所述洗滌劑為乙醇、三氯甲烷，優選 乙醇。
[0018] 所述步驟3)中，所述穩定劑為聚丙烯酸、Mg2+，優選聚丙烯酸。
[0019] 所述步驟3)中，所述穩定劑的添加量為濃度大于500 μ g/mL，優選500 μ g/mL。
[0020] 所述步驟3)中，離心速率為500-3000轉/分，優選3000轉/分，離心時間為1-5 分鐘，優選5分鐘。
[0021] 本發明具有以下積極意義：
[0022] 1.本發明首次利用納米技術利用無定形磷酸鈣包載氯己定，可以使膠原纖維再礦 化過程中得到保護，提高牙本質膠原纖維再礦化的效率。利用模板法制備出尺寸可控、外形 規則的納米球。調整穩定劑的類型和濃度，提高固體狀態下無定形磷酸鈣的穩定性，便于應 用于口腔直接粘接修復材料中。
[0023] 2.本發明通過調整氯己定濃度，得到一系列不同載藥量的納米球。
[0024] 3.本發明制備方法簡單易行，適合大規模制備生產，制備工藝簡單。
[0025] 4.本發明制備方法制備的納米球外觀形態完整均勻，呈典型球形，粒徑約為 20-100nm，尺寸可控具有較好流動性，便于進入膠原纖維網內外。
[0026] 本發明屬于國家自然科學基金資助項目（51103001)和北京市科委基金 (Z4016)中的一部分，所獲得的結果將應用于口腔創新品種臨床前研究特別是 新型口腔修復材料的生產及臨床應用。
【附圖說明】
[0027] 圖1表示實施例1中制備的負載氯己定無定形磷酸鈣納米球掃描電鏡下形貌
[0028] 圖2表示實施例1中負載氯己定無定形磷酸鈣制備200h后傅里葉紅外光譜分析
[0029] 圖3表示實施例2負載氯己定無定形磷酸鈣制備200h后X線衍射分析
[0030] 圖4表示實施例3負載氯己定無定形磷酸鈣制備200h后X線衍射分析
[0031] 圖5表示實施例3負載氯己定無定形磷酸鈣制備200h后透射電鏡下形貌
【具體實施方式】
[0032] 根據本發明，提供一種緩釋氯已定的無定形磷酸鈣納米球的制備方法，具體的，本 發明的方法包括下述步驟：
[0033] 1)制備含氯已定的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液；
[0034] 2)在攪拌下，在步驟1)制備的非離子表面活性劑囊泡的懸浮液體系中加入鈣鹽 溶液和磷酸鹽溶液，反應得到無定形磷酸鈣納米顆粒的懸浮液；
[0035] 3)在所述步驟2)得到的磷酸鈣納米顆粒的懸浮液中加入穩定劑，攪拌均勻，然后 離心得到沉淀，將沉淀洗滌、干燥得到無定形磷酸鈣納米顆粒。
[0036] 本發明所采用的技術方案是：將非離子表面活性劑和聚乙二醇在氯己定水溶液中 以一定比例混合，超聲得到穩定的納米尺寸囊泡。按一定范圍的鈣磷比加入可溶性鈣鹽和 可溶性磷酸鹽，此時磷酸鈣以囊泡為模板形成納米顆粒。使用聚丙烯酸（PAA)作為穩定劑， 可使無定形磷酸鈣較長時間內不向羥基磷灰石晶體轉化。最