促進傷口愈合的方法
【專利說明】促進傷口愈合的方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年7月27日提交的SG專利申請201205614-9號的優先權權益， 將其內容以其整體引入于此以作參考用于所有目的。 發明領域
[0003] 本發明通常涉及生物化學領域。具體而言，本發明涉及可用于傷口治療的mi-RNA、 抗-miRNA和多肽。
[0004] 發明背景
[0005] 糖尿病為一組特征在于由受試者產生和/或使用胰島素的能力受損引起的血液 中高葡萄糖水平的疾病。當糖尿病沒有得到良好控制時，糖尿病可穩步惡化并引起并發癥 如失明、神經損傷、腎衰竭、心臟病和截肢。許多這些并發癥是由脈管系統損傷和不能愈合 傷口造成的。由糖尿病患者不能愈合傷口引起的慢性傷口是主要的全球性健康負擔，且為 最常見的下肢截肢的原因。在極端情況下，無效的傷口愈合可導致死亡。
[0006] 傷口愈合需要復雜的生物學事件的協調整合，這些生物學事件包括細胞迀移、增 殖和伴隨基質沉積的細胞外重塑，普遍受到TGF-β和其它生長因子刺激。在糖尿病中，這 些復雜且交互的防護過程被破壞。因此，需要提供能夠恢復或改善正常傷口愈合的方法或 組合物。
[0007] 發明概述
[0008] 在一個方面，提供有一種促進傷口愈合或傷口閉合的方法。本文所述的方法包括 施用miR-198抑制劑和/或卵泡抑素樣-I (follistatin-like-1，FSTL1)多肽。
[0009] 在另一方面，提供有一種治療慢性皮膚傷口的方法。治療慢性皮膚傷口的方法可 包括施用miR-198抑制劑和/或卵泡抑素樣-I (FSTLl)多肽。
[0010] 在另一方面，提供有一種不愈合傷口（慢性皮膚傷口）的鑒定方法。所述慢性皮 膚傷口的鑒定方法可包括分析miR-198的表達水平，其中miR-198的表達或表達增加表明 所述傷口為慢性皮膚傷口。如本文所述的不愈合傷口的鑒定方法可任選包括分析FSTLl基 因的表達和/或FSTLl多肽水平，其中FSTLl基因的表達減少或無表達和/或FSTLl多肽 的水平降低或缺失表明所述傷口為慢性皮膚傷口。
[0011] 在另一方面，提供有miR-198作為用于鑒定不愈合傷口（慢性皮膚傷口）的生物 標記物的用途。
[0012] 在另一方面，提供有miR-198在制備用于治療不愈合傷口的藥物中的用途。還提 供FSTLl多肽在制備用于治療不愈合傷口的藥物中的用途。
[0013] 在另一方面，提供有一種包含如本文所述的組合物或化合物的藥物組合物。所述 藥物組合物可包含miR-198抑制劑和TGF-β 1 ;或miR-198抑制劑和FSTLl多肽；或FSTL 多肽和TGF-β 1 ;或miR-198抑制劑和TGF-β 1以及FSTLl多肽。
[0014] 附圖簡述
[0015] 參見詳細說明，并結合非限制性實例和附圖考慮時，將更好地理解本發明，在附圖 中：
[0016] 圖1示出在上下文特定生理狀態下外顯子miRNA或所連接的ORF的表達。a)染 色體3(NCBI參考序列：NM_007085)中FSTLl基因的示意圖，示出外顯子-內含子邊界，編 碼!1^1?-198前體的3'-^1?序列（下劃線的核苷酸表示成熟1^1?-198)。13)示出1^1?-198 表達的柱狀圖，如通過qRT-PCR在器官培養外植體中在損傷后的指定時間點所測定的。如 早在損傷后3小時觀察到的miR-198的顯著下調**[P〈0. 001]。c)在損傷后的（左）0和 (右）24小時時，由對正常皮膚上的成熟miR-198具有特異性的LNA探針原位雜交獲得的 圖像。注意，受傷后24小時時，miR-198表達顯著下調。d)在損傷前后在指定的時間點，對 外植體樣品中FSTLlmRNA的典型半定量-RT-PCR分析。e)在受傷后的（左）0和（右）24 小時時FSTLl蛋白的免疫組織化學定位。FSTLl蛋白表達在受傷后24小時時觀察到（η = 5)。比例尺=100 μΜ。圖1闡明了在損傷后0和24小時時，人皮膚離體器官培養系統的差 異miRNA表達譜。圖1闡明了 miR-198為在損傷時下調的一致且顯著差異表達的miRNA。
[0017] 圖2a)的直方圖表示轉染有對照或miR-198的N/TERT-1細胞中的成熟miR-198定 量（η = 3)。13)示出在刮傷后在不同時間點轉染有非祀標miRNA對照（上圖）或miR-198(下 圖）的角化細胞迀移的代表圖。虛線標記了角化細胞的細胞膜片（cellsheet)的迀移邊緣 (η = 6)。c)的直方圖表示在刮傷試驗中的相對傷口閉合。經過24小時，在對照轉染細胞中 觀察到完全傷口閉合，而miR-198的過表達導致35 ± 10 %的傷口閉合（η = 6)。林P〈0. 001。 誤差棒表示標準誤差。d)示出轉染有對照或miR-198的角化細胞的增殖，通過相對細胞匯 合度來評價。miR-198的過表達與增殖的任何顯著差異并不相關（η = 3)。e)示出轉染有 對照或miR-198模擬物的N/TERT-1細胞中FSTLlmRNA的相對水平。N. S :不顯著（η = 3)。 miR-198過表達不導致FSTLlmRNA水平的顯著變化。f)示出細胞共轉染有FSTL13'-UTR熒 光素酶報告基因構建體以及miR-198或非靶向亂序對照。標準化的相對熒光素酶活性顯示 為柱形圖。熒光素酶活性表示為相對于對照的平均值，N. S :不顯著（η = 3)。g)示出從轉 染有對照或miR-198的角化細胞的微陣列數據中選擇的基因的基因表達值，表示為熱圖。 表達值顯示為在線性標度下相對于基因的單個平均值的明暗度。h)示出表示從微陣列中 鑒定的且通過qRT-PCR驗證的所選基因的相對轉錄本豐度（對照對miR-198過表達）的直 方圖（η = 3)。微陣列數據示出與qRT-PCR結果的顯著相關。*P〈0. 05, #P〈0. 001。學生 t檢驗用于計算P值，誤差棒表示平均值土 s. e. m.。因此，圖2示出miR-198抑制角化細胞 迀移不依賴于FSTLl。
[0018] 圖3示出人皮膚器官培養物損傷模型中靶基因表達的結果。a)示出在損傷后0和 24小時使用來自皮膚（器官培養物）的RNA由微陣列產生的選擇基因（假定靶標）的熱 圖。表達值顯示為在作為熱圖的線性標度下相對于基因的單個平均值的明暗度。b)示出通 過熒光素酶報告基因試驗的miR-198的直接靶標的驗證。293T細胞共轉染有如圖所示的 3' -UTR熒光素酶報告基因構建體以及miR-198或非靶向亂序對照。標準化的相對熒光素 酶活性示為柱形圖。熒光素酶活性表示為相對于對照的平均值。（η = 3)。**P〈0. 001。學生 t檢驗用于計算P值，誤差棒表示平均值土s.e.m.。c)示出損傷后0小時和24小時，在來 自器官培養物的切片和來自慢性糖尿病傷口的切片上miR-198靶標PLAU、LAMC2和DIAPHl 的免疫組織化學分析。在受傷后24小時時（中間圖）清楚觀察到靶基因的蛋白表達的大 幅增長。然而，在慢性糖尿病性潰瘍傷口（右圖）中，靶基因的表達仍相對較低（η = 8)。 d)示出在損傷后24小時的正常傷口或在慢性傷口切片上通過免疫組織化學檢測FSTLl蛋 白表達（左圖）和對miR-198的原位雜交（右圖）（η = 8)。比例尺-100 μΜ。FSTLl僅在 正常傷口中檢測到，而未在慢性糖尿病傷口中檢測到。慢性糖尿病傷口持久表達高水平的 miR-198,而miR-198在正常損傷中下調。因此，圖3闡明了調控開關在慢性傷口中受損。
[0019] 圖4示出為了理解轉錄后調控開關而進行的一系列試驗，確定轉錄本起到 pri-miRNA或mRNA的作用的命運。a)示出在TGF-M存在或缺失下使用抗KSRP抗體或 IgG對照對來自角化細胞裂解物RNA免疫沉淀。表示轉錄本富集倍數的定量RT-PCR揭示了 KSRP與pri-miR-198轉錄本的特異性結合，但不與最豐富的mRNA種類KRT14特異性結合（η =3)。b)顯示了 RNA-凝膠阻滯試驗，其示出KSRP與在pre-miR-198轉錄本的環中的富含 G-的基序特異性結合，且取消了與該位點的突變⑶C基序（Mut-I)的結合。pre-miR-198轉 錄本的莖中GG基序突變為CC僅產生適度的結合損失（Mut-2)。僅用KSRP觀察到RNA-蛋 白質復合物，而用BSA對照則未觀察到（最后泳道）（η = 3)。c)示出在重組KSRP (rKSRP) 的存在下pre-miR-198的有效加工。體外合成的pre-miR-198轉錄本用293T細胞質提取 物在rKSRP的濃度有無增加下孵育。裂解的成熟miR-198通過與在pre-miR-198用RNase III處理時釋放的產物的共迀移來檢測。d)示出表示成熟miR-198的密度定量的直方圖