專利名稱：人多潛能白血病細胞分化相關基因的制作方法
技術領域：
本發明為兩種人多潛能白血病細胞分化相關基因ASH2L及PHF2與白血病細胞增殖與分化狀態的關系，涉及生物醫學高技術中基因的開發與應用領域。
PHD(plant homeodomain)鋅指結構(C4HC3)蛋白廣泛存在于不同生物體內。作為轉錄因子其主要功能是在染色質水平調節同源異形盒(HOX)基因的轉錄。編碼含PHD結構蛋白的基因在進化過程中十分保守。這一鋅指結構的基本特征是在50-80個氨基酸殘基范圍內有一個C4HC3基序(motif)。通過對人體白血病細胞染色體易位的研究發現，具有PHD結構特征的蛋白質與造血系統惡性疾病有關。如定位于人類染色體11q23區域的MLL(mixed-lineageleukemia，又名HRX、ALL1、HTRX1)基因編碼的蛋白質就包括有連續4個串聯的PHD結構。位于8p11區域的MOZ(monocytic leukemia zinc finger protein)基因編碼的蛋白質也包含有2個PHD鋅指結構。甚至有作者將PHD鋅指結構稱為白血病相關蛋白(leukemia-associated-protein，LAP)結構域。克隆編碼PHD鋅指結構的基因并研究其功能和應用具有重要的理論價值和實際意義。
我們實驗室應用基因組信息學原理、分子克隆、聚合酶鏈式反應(PCR)、cDNA文庫篩選、DNA序列測定技術等技術，克隆到人類編碼PHD鋅指蛋白新基因PHF2和ASH2L的cDNA及編碼蛋白質的序列，本發明目的是研究人類編碼PHD鋅指蛋白基因PHF2和ASH2L與白血病細胞增殖與分化狀態的關系。
我們實驗室應用基因組信息學原理、分子克隆、聚合酶鏈式反應(PCR)、cDNA文庫篩選、DNA序列測定技術等技術，克隆到人類編碼PHD鋅指蛋白新基因PHF2和ASH2L，本發明應用Northern印跡雜交及細胞誘導分化技術等，對人類編碼PHD鋅指蛋白基因PHF2和ASH2L它們與白血病細胞增殖與分化狀態的關系進行了鑒定。
對PHF2和ASH2L基因鑒定達到的技術指標為1、兩種新的編碼PHD及PHD相關的鋅指蛋白基因及其相應可變剪接異構體1)PHF2cDNA全長2104bp，相應蛋白質有567aa，在靠近N端的150aa范圍內編碼兩個連續排列的PHD鋅指結構。PHF2蛋白與果蠅的PCL蛋白具有43％的同源性；2)ASH2L1及其可變剪接異構體ASH2L2cDNA及相應蛋白的長度分別為ASH2L12381bp，628aa；ASH2L22450bp，534aa。它們與果蠅的ASH2基因同源性約為60％。但在ASH2蛋白PHD鋅指結構相應區域，ASH2L1、ASH2L2蛋白則為(C2C2)鋅指結構(圖1，2，3)。
2、這兩個基因在有巨核及紅系特點的Hel、Dami及K562白血病細胞系中表達量明顯增高(圖4)。
3、在白血病細胞向巨核細胞分化過程中ASH2L表達水平明顯下降，誘導后0.5、1、2及4小時分別下降32％、56％、77％及90％；而PHF2則表現為一定水平的上調，誘導后2、4及8小時分別上升1.3、4.4及7倍(圖5)。
4、研究結果表明人類基因ASH2L及PHF2在維持多潛能白血病細胞系Hel、Dami及K562細胞的增殖狀態及誘導分化過程中起著重要的調控作用。
本項發明的優點是對篩選出的人多潛能白血病細胞分化相關基因PHF2和ASH2L與白血病細胞增殖與分化狀態的關系進行了鑒定，這對闡明該類腫瘤發生與分化的生物學機制具有一定的意義，也為該類腫瘤的臨床診斷和治療提供了目標基因和輔助診斷指標。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。


圖1 PHF2 cDNA及相應蛋白質序列圖。下畫線部分為PHD鋅指結構域。
圖2 ASH2L1 cDNA及相應蛋白質序列圖。下畫線部分為C2C2鋅指結構域。
圖3 ASH2L2 cDNA及相應蛋白質序列圖。下畫線部分為C2C2鋅指結構域。
圖4 人PHF2、ASH2L在不同人白血病細胞系中的表達差異。
圖5 PMA誘導K562細胞系向巨核系分化時人ASH2L、PHF2基因表達水平的變化。
實施例1人多潛能白血病細胞分化相關基因 PHF2的篩選1、PCR引物設計P3A，P3B通過M96(小鼠的一種具有PHD結構的金屬反應元件DNA結合蛋白)基因在GenBank人類EST(Expressed Sequence Tag)數據庫中進行查詢比較，選擇兩個同源性較高的EST(GenBank AccR13825，N48557)進行設計。2、PCR制備cDNA探針采用P3A、P3B引物對人多種組織(如心臟、睪丸、骨髓、十二指腸、胎盤、成人腦及胎腦)來源的cDNA文庫進行PCR擴增PCR反應體積為25μl，含10mM Tris-HCl(pH 9.0)，0.1％Triton X-100，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1μlλ噬菌體，引物濃度為1μM，1u Taq DNA聚合酶。循環條件是在MJ Research.Inc PTC-100TM熱循環儀上進行反應，94℃變性3分鐘后，94℃30秒、57℃30秒、72℃ 45秒，30個循環，72℃延伸10分鐘。PCR擴增得到長度為733bp的P3AB片段。3、對P3AB片段進行標記及PHF2的雜交篩選片段的標記用膠回收試劑盒進行P3AB DNA擴增片段的膠回收。取約25ng的探針模板DNA于0.5ml離心管中，用隨機引物標記試劑盒(Promega-a-GeneRLabeling System)進行標記。
篩選以此隨機引物標記探針，對人胎盤cDNA文庫進行雜交篩選，獲得陽性單克隆后，采用λgt11通用引物擴增陽性克隆的cDNA插入片段，將PCR產物直接測序即得到人PHF2全長cDNA(圖1)。4、PHF2 cDNA的序列分析PHF2 cDNA共有2104個堿基(圖1)，起始密碼子ATG后第一個堿基為G，與Kozak共有序列最保守的堿基一致。3’端poly(A)上游11bp有加尾信號AATAAA。PHF2 cDNA包含了一個完整的開放閱讀框(53-1756)，相應的蛋白質由567個氨基酸殘基組成。
PHF2基因的蛋白產物與果蠅的多梳樣核蛋白(PCL)具有43％的相似性，在靠近編碼蛋白N端的一個富含半胱氨酸的150aa區域內有2個相隔不遠的PHD鋅指結構(PHD結構域在物種進化過程中相當保守。)，其特征序列為CX1-2CX12-13CX2CX4HX2CX17-18CX2C。在我們查詢GenBank數據庫時已有澳大利亞作者M Coulson登記了PHF基因的一個剪接異構體PHF1(97.10.9)，因此我們將我們克隆的cDNA命名為PHD鋅指蛋白基因2(PHD finger proteingene 2 PHF2)，于98年3月4日送往GenBank，登記號為AF052205。實施例2ASH2L1及其可變剪接異構體ASH2L2的篩選1、PCR引物設計P2A、P2B用果蠅ASH2全長cDNA查詢GenBank dbEST，獲得數個相互重疊的小鼠EST，根據其中AA073756、AA102084的cDNA序列使用oligo 4.0軟件設計。2、PCR篩選cDNA文庫點陣雜交用特異引物P2A和P2B以PCR的方法篩選點陣排列的人胎腦λDR2 cDNA文庫，篩選出胎腦文庫中的陽性盒，隨后篩選陽性盒的行混合管、列混合管，直至篩出單管cDNA文庫。將特異引物P2A和P2B的PCR擴增產物進行隨機引物標記，進行噬菌斑原位雜交篩選，最終獲得陽性單克隆。
陽性克隆的純化對照X光片，從培養皿上相應部位挑取陽性克隆噬菌斑，并將其懸浮于300μl SM溶液中。如克隆不是單噬斑，在90mm培養板上鋪100個左右的噬斑，隨機挑選5至10個單克隆，懸浮于300μl SM溶液中，4℃放置8小時以上。取1μl懸浮液用PCR鑒定，條件同前。3、將陽性λDR2噬菌體環化為質粒pDR2λDR2是一種能在多種人細胞系中高效表達的載體。當λDR2感染表達了cre重組酶的細菌菌株(如E.coli AM1)時，λDR2含有的兩個噬菌體P1來源的loxP重組位點能使含插入片段的重組pDR2由λDR2自動切出和環化成質粒，而不需要插入片段的亞克隆。環化操作依據Clontech公司的操作手冊進行。4、獲得ASH2L1及可變剪接異構體ASH2L2用pDR2F及pDR2R引物擴增質粒的cDNA插入片段，將插入片段最長(約2.1Kb)的pDR2質粒測序即得到我們所要的cDNA(命名為ASH2L1見圖2)。
在進行數據分析時，我們首先將此cDNA通過blast工具在人類EST數據庫中進行了同源性比較，得到一些3′端完全相同的EST(如AA101373等)，再用這些EST查詢UniGene數據庫時發現它們都屬于UniGene Hs.6856目錄下，并在Hs.6856中發現一個長度標為4.3Kb的克隆IMAGE563828，這一結果提示我們可能有更長的克隆存在。因此我們將克隆IMAGE563828購回并測序，發現它的實際長度只有2450bp，并且是ASH2L1的一個可變剪接異構體即ASH2L2(圖3)。5、ASH2L1、ASH2L2 cDNA的序列分析ASH2L1 cDNA全長2381bp，從第5到第1891個堿基為一完整的開放閱讀框(ORF)，起始密碼子ATG后第一個堿基為G，與Kozak共有序列最保守的堿基一致。
ASH2L2 cDNA全長2450bp，ORF的范圍是296-1801bp，第一個起始密碼子的前3個后1個堿基與ASH2L1的完全相同。在ASH2L2的poly(A)尾上游16bp有加尾信號AATAAA。ASH2L1及ASH2L2相應的蛋白質分別由628及534個氨基酸殘基組成，由于可變剪接ASH2L2蛋白比ASH2L1蛋白少94個氨基酸殘基，但它們都具有一個C2C2鋅指結構。
ASH2L蛋白與果蠅三胸蛋白ASH2的同源性高達60％，根據同源基因命名原則我們將其命名為ASH2同源基因[Homo sapiens ash2(absent，small，or homeotic，Drosophila，homolog)-like gene(ASH2L)]，我們獲得了ASH2L基因的兩個可變剪接異構體ASH2L1、ASH2L2，并于98年4月1日送往GenBank，登記號分別為AF056718及AF056717。在ASH2的PHD結構域相應的區域ASH2L則是一個C2C2鋅指結構，與ASH2L同源的其它物種(如酵母及線蟲等)中的蛋白都有PHD結構，但在小鼠及人類的同源蛋白中這一DNA或蛋白結合結構域卻演變成了只能結合一個鋅離子的C2C2結構。在ASH2L與ASH2蛋白的C端同源性更高，但目前對該區域的生物學功能尚不了解。實施例3人多潛能白血病細胞分化相關基因的鑒定1、人類ASH2L、PHF2基因的表達特異性分析我們從10種代表不同細胞系的人白血病細胞系中提取RNA，用對PHF2、對ASH2L特異的DNA探針進行Northern印跡雜交和分析，結果表明人類ASH2L、PHF2這兩個基因在人多潛能白血病細胞系(K562、HEL、Dami)中都有高水平表達，而在其余細胞內的表達量均較少(見圖4)。提示這兩基因在巨核系分化潛能的細胞中起著某種特殊的作用。
K562細胞系源于一位慢性粒細胞白血病患者。該細胞系具有慢粒白血病標志性染色體ph1染色體，即t(922)。易位涉及22號染色體bcr(breakpoint cluster region)區域及9號染色體的c-abl酪氨酸激酶原癌基因。編碼的融合蛋白p210bcr-abl實際上是c-abl蛋白的N端由bcr的N端部分取代。從而導致了c-abl細胞酪氨酸激酶(cryptic tyrosinekinase)的激活。K562細胞具有多潛能造血細胞的特點。通過表面抗原的檢測發現它能夠表達紅系、粒系、單核及巨核系的分子標志物。佛波酯(phorbol ester)及ganglioside GM3等可以誘導K562細胞向巨核細胞系分化。
在細胞分化過程中，DAMI細胞具有較多的成熟巨核細胞的特點，HEL細胞表達αIIb及α2整合素而不能表達其它的巨核細胞標志，如GPI b，因此HEL細胞可能處在一種幼稚的巨核體狀態。K562細胞表達TSP(Thrombospondin)表明其處于造血發育的早期階段，因為TSP存在于大多數處于造血早期階段的前體細胞中。2、人類ASH2L、PHF2基因在K562細胞誘導分化時表達水平的變化及意義我們使用化合物誘導劑佛波脂(PMA)誘導K562細胞系向巨核細胞分化。
培養細胞懸浮細胞接種于含10％熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37℃并充以5％CO2的細胞培養箱中培養生長。
誘導分化收獲對數生長期細胞，并重懸于新鮮的含10％熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，將細胞濃度調整到4-5×105/ml。PMA溶于二甲基亞砜(DMSO)，儲存濃度為1mg/mL(1.6×10-3M)避光保存于-20℃。使用時以RPMI-1640培養基將其稀釋100倍，每10毫升細胞加稀釋后的PMA 31μl，終濃度為50×10-9M。以不同的時間對細胞進行誘導后，收獲細胞提取總RNA，進行Northern印跡雜交和分析。
結果向巨核分化過程中我們觀察到了表達水平的變化(見圖5)。首先是ASH2L變化最為明顯。我們第一次用PMA誘導分化時收獲細胞提取RNA的時間分別為6、12、24，48、72小時。發現在6小時收獲細胞所得的RNA中就幾乎檢測不到ASH2L的表達。然后我們縮短了誘導時間，分別在0.5、1、2、4、8小時提取RNA，結果顯示在1小時內轉錄本的量就下降了一半。說明ASH2L基因在PMA誘導分化時是一個早期反應基因，提示它的表達下調不需要細胞合成新的蛋白質，很有可能是通過轉錄后調控對PMA的誘導迅速作出下調的反應。
與此相反，PHF2基因在K562細胞向巨核系分化時轉錄水平表現出上調，誘導后2、4及8小時分別上升1.3、4.4及7倍。
因此我們認為，ASH2L及PHF2在維持多潛能白血病細胞系Hel、Dami及K562細胞的增殖狀態及誘導分化過程中起著重要的調控作用，可用于該腫瘤的基因診斷和作為臨床治療中的輔助診斷指標，還可作為該腫瘤基因治療的靶基因。
權利要求
1.本發明涉及兩個人多潛能白血病細胞分化相關基因PHF2及ASH2L，分析其與白血病細胞增殖與分化狀態的關系，特征在于1)這兩個基因在有巨核及紅系特點的Hel、Dami及K562白血病細胞系中表達量明顯增高；在白血病細胞向巨核細胞分化過程中ASH2L表達水平明顯下降，而PHF2則表現為一定水平的上調。
2.根據權利要求1所述之人多潛能白血病細胞分化相關基因，其特征在于這兩個基因與人類多潛能白血病細胞的增殖及誘導分化狀態有關，可用于白血病的基因診斷和治療。
全文摘要
本發明涉及兩個人類多潛能白血病細胞(K562、HEL及Dami)特異高表達基因PHF2及ASH2L,該基因編碼含PHD鋅指結構(C4HC3)及PHD相關鋅指結構(C2C2)的轉錄因子,與人類多潛能白血病細胞的增殖及誘導分化狀態有關,對闡明該類腫瘤發生與分化的生物學機制有一定意義,可用于白血病的基因診斷和治療。
文檔編號A61P35/00GK1247228SQ9911101
公開日2000年3月15日 申請日期1999年7月27日 優先權日1999年7月27日
發明者張伯勤, 袁建剛, 汪俊華 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所