專利名稱：具有抗腫瘤活性的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗腫瘤活性的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物，它們具有MDM2拮抗活性。特別是，這些化合物作為MDM2與p53相互作用的拮抗劑，可導致細胞內活性p53增加，因此可允許p53蛋白在癌細胞中促進編程性細胞死亡。
原癌蛋白MDM2(mouse double minute 2，人的等價蛋白有時指HDM2)在很多人腫瘤中異常表達(Oliner等，1992,Nature 358,80-83；Leach等，1993，癌癥研究54,794-799；Ebert等1994，國際腫瘤雜志5,1279-1284；Bueso-Ramos等.1993，血液82,2617-2623；Chilosi等。1994，血液84,4295-4300；Marchetti等.1995,Diagn.Mol.Pathol.4,93-97；McCann等。1995，英國癌癥雜志71,981-985；Cordon-Cardo等。1994，癌癥研究54,794-799)。MDM2通過與p53的N-末端活化區域結合形成負自身調節環(Kussie等。1996，科學274,948-953)，來抑制p53的功能(Momand等。1992，細胞69，1237-1245；Oliner等。1993，自然362,857-860；Barak等.1992,EMBO J.11,2115-2121；Finlay 1993，細胞分子生物學13,301-306；Chen等。1996，細胞分子生物學16,2445-2452；Haupt等。1996,EMBOJ.15,1596-1606)和促進p53的蛋白酶降解(Kubbutat等。1997，自然387,299-302；Haupt等。1997，自然387,296-299；Midgley等。1997，癌基因15,1179-1189)。干擾MDM2與p53之間的這個自身調節環可用于增加哺乳動物細胞中活性p53的濃度。在很多腫瘤細胞的例證中由于活性p53耗盡導致有缺陷的細胞周期和編程性細胞死亡調節。但是，腫瘤細胞只有一部分帶有突變缺損的p53。在腫瘤細胞的剩余部分帶有野生型p53，因此，可通過干擾MDM2與p53之間的相互作用來增加活性p53的平衡濃度。已有使用肽模型的MDM2-p53相互作用拮抗劑，在體外(Bttger等。1997，分子生物學雜志269,744-756)和哺乳動物細胞中(Bttger等。1997，現代生物學7,860-869)均顯示出p53活性恢復。另外，用合成的核酸抑制MDM2的表達也顯示出可增加活性p53的水平，并因此可增加細胞系對細胞抑制性藥物的敏感度(Chen等.1998,Proc.Natl.Acad.Sci USA 95,195-200)。功能性p53的缺少是與腫瘤耐受化療或輻射治療有關的最常見的分子缺陷。MDM2失調被認為是此現象的一個原因(Kondo等。1995，癌基因10,2001-2005；Blaydes等.1997，癌基因14,1859-1868)。可通過干擾MDM2 p53的相互作用增加p53在腫瘤細胞中的分子內濃度的藥劑對于增加腫瘤細胞對化療或輻射治療的敏感度有治療性應用。在對增加功能性p53特別敏感的治療類型中(Hansen等.1995，癌基因11,2535-2545)，這些藥劑本身足夠誘導編程性細胞死亡。
除了通過增加活性p53的分子內濃度作用而產生作用外，MDM2拮抗劑還可對哺乳動物細胞的細胞周期調節發揮作用，此作用是獨立于p53的。從E2F-依賴的啟動子的轉錄是被MDM2活化的，它與E2F的相互作用在相同的結合位點且與p53相互作用時在同源表位(Piette等.1997，癌基因15,1001-1010；Brown等.1993，分子細胞生物學13,6849-6857)。因此，MDM2通過加強S-相傳代促進一般的細胞增生(Leveillard和Wasylyk 1997，生物化學雜志272,30651-30661)，增加血管緊張素促細胞分裂劑的表達(Kondo等，1996，癌基因13,1773-1779)且抑制分化(Fiddler等.1996，分子細胞生物學16,5048-5057)。因此，MDM2抑制劑可治療與p53無關的MDM2失調的腫瘤。
已經發現，帶有酸性部分通過亞烷基鏈連接到酚氧原子的O-取代的酚衍生物是有效的MDM2活性拮抗劑，特別是MDM2-p53相互作用的拮抗劑。
在文獻中有報道，在兩個苯環中的一個帶有羧甲氧基取代基的查耳酮衍生物具有抗潰瘍活性(波蘭化學雜志，vol.65(2-3),369-75,1991；DE 3537207,Biorex；藥物化學雜志，vol.27(12),2943-53,1979；FR 2383157,Biorex；JP 54019948,Taisho)，殺菌活性(Pharmazie,vol.44(3),190-1,1989；Hacettepe Univ.EczacilikFak.Derg.,vol.11(1),1-11,1991)，低血脂活性(hypolipemicactivity)(FR 2639043；US 3,994,955,Searle；T’ai-wan Yao HsuehTsa Chih,vol.27(1-2),12-16,1975)，利尿活性(歐州藥物化學雜志-Chim.Ther.,vol.Chem.)，防疫活性(CA904291,Dow Chem)，或降低血液中的血纖維蛋白原的水平(DE 4327365,BoehringerMannheim)。但至今沒有報道過抗腫瘤活性。
在現有技術中報道的具有抗腫瘤活性的查耳酮衍生物在苯環上不帶有羧甲氧基或四唑基甲氧基部分，且已知其作為抗微管蛋白劑(US4,904,697,Merrell Dow)。
本發明的目的是使用通式(Ⅰ)化合物，其立體異構體或其藥學上可接受的酸或堿，制備具有MDM2拮抗活性的藥物，優選治療MDM2失調的腫瘤，例如肉瘤
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基團可在鄰、間、對位；-A選自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基團
其中R’是氫或(C1-C4)烷基；或基團A-(CH2)p-C(R1)(R2)-選自苯基，芐基或(吲哚基)甲基，它可被R4基團取代；-p是0,1或2；-R1和R2分別選自氫或(C1-C8)烷基，或它們與相連的碳原子一起形成(C3-C7)環烷基；-R4是0至2個取代基，分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基團
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整數；-m是0或1；-B選自直鏈或支鏈C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或當m為0時，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或當m為1時是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R選自氫，-Ar或-CO-Ar；-R3是氫或(C1-C8)烷基；-R5和R6分別是(C1-C4)烷基或與它們相連的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，嗎啉代或硫代嗎啉代基團；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3個分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代。
本發明的另一目的是如上所述的新的通式(Ⅰ)化合物，條件是，當m是0時，A選自-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基團
其中R’是氫或(C1-C4)烷基；和當m是0時，A是-COO-(C1-C4)烷基，B只能是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6。
優選的通式(Ⅰ)化合物是那些-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基團在對位的化合物。
更優選的通式(Ⅰ)化合物是那些R4是1-2個氯原子或那些Ar是被1-2個氯原子取代的苯基的化合物。
更優選的通式(Ⅰ)化合物是那些m是0,R是氫且A是四唑基的化合物。
最優選的通式(Ⅰ)化合物是
和
本發明化合物的制備其中m是0且B是直鏈或支鏈C1-C10烷基，-COCH3,-CO-C(R3)=CH-R或-CH=C(R3)-CO-Ar基團的通式(Ⅰ)化合物可從通式(Ⅱ)的中間體開始制備
其中R4定義如上，且B’是直鏈或支鏈C1-C10烷基，-COCH3,-CO-C(R3)=CH-R或-CH=C(R3)-CO-Ar，與通式(Ⅲ)的酸酯反應Hal-C(R1)(R2)-(CH2)p-COO-(C1-C4)烷基(Ⅲ)或與通式(Ⅲ’)的腈反應Hal-C(R1)(R2)-(CH2)p-CN(Ⅲ’)其中R1,R2定義如上，且Hal是氯，溴或碘原子，或與通式(Ⅲ”)基團反應芳基-Hal(Ⅲ”)其中Hal是氯，溴或碘原子，且芳基是芐基，(吲哚基)甲基和被反應后易除去的基團如三羰基鉻(O)基團活化的苯基。
式(Ⅱ)中間體與式(Ⅲ)或(Ⅲ’)中間體的反應可在溶劑中進行，優選非質子偶極溶劑如二甲基甲酰胺或二甲基亞砜，且在堿如堿金屬或堿土金屬碳酸鹽存在下反應。反應溫度優選室溫至100℃的范圍。
其中B’不是-COCH3的通式(Ⅱ)中間體與通式(Ⅲ)中間體的反應產物已經是通式(Ⅰ)化合物，它還可通過水解酯基轉化為其中A=-COOH的另一通式(Ⅰ)化合物。此水解反應可在堿存在下，如堿金屬或堿土金屬碳酸鹽或氫氧化物，在溶劑中如醇中進行。
可通過在溶劑如二甲基甲酰胺中與疊氮化鈉反應，將其中B’不是-COCH3的通式(Ⅱ)中間體與通式(Ⅲ’)中間體的反應產物轉化為其中A是四唑基的如上所述的通式(Ⅰ)化合物，且任意地，可通過合適的烷基化試劑，如硫酸二甲酯在堿存在下將四唑環上的1或2個氮原子烷基化。
可選擇地，其中A是四唑基，m是0且B是-CO-C(R3)=CH-R其中R3是氫的上述通式(Ⅰ)化合物可通過三步反應獲得包括a)其中B’是-COCH3的上述通式(Ⅱ)中間體與通式(Ⅲ’)中間體反應；b)將a)步驟反應所得化合物在溶劑如二甲基甲酰胺中與疊氮化鈉反應，且任意地可通過合適的烷基化試劑，如硫酸二甲酯在堿存在下將四唑環上的1或2個氮原子烷基化；c)將b)步驟反應所得的化合物與芳香醛R-CHO在惰性溶劑中，在堿如堿金屬或堿土金屬氫氧化物存在下，在室溫至回流的溫度范圍內反應。
可選擇地，其中A是四唑基，m是0且B是-CO-C(R3)=CH2，即其中R是H的通式(Ⅰ)化合物可從通式(Ⅱ’)
其中A是定義如上的四唑基，且R1,R2,R3,R4和p定義如上，與多聚甲醛反應得到。通過通式(Ⅱ’)與多聚甲醛和胺HNR5R6的鹽酸鹽，其中R5和R6定義如上，在Mannich反應條件下反應，并連續用弱堿如堿金屬或堿土金屬碳酸氫鹽處理可得到其中B’=-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6的通式(Ⅰ)化合物的鹽酸鹽。
其中B’是-COC(R3)=CH-R，且R=Ar或R=-CO-Ar的通式(Ⅱ)化合物可通過通式(Ⅳ)化合物
與Ar-CHO或Ar-CO-CHO的醛在惰性溶劑，在堿如堿金屬或堿土金屬氫氧化物存在下，在室溫到回流的溫度范圍內反應獲得。
類似地，其中B’是-CH=C(R3)-CO-Ar的通式(Ⅱ)化合物可通過通式Ar-CO-CH2-R3與通式(Ⅳ’)的醛反應獲得
其中B’是C1-C10烷基，Ar-CHO,Ar-CO-CHO和Ar-CO-CH2-R3的通式(Ⅳ),(Ⅳ’),Ⅱ化合物是已知化合物，它們可用化學家已知的方法制備或甚至是市場上可買到的產品。
如上所述，其中A是四唑基的通式(Ⅱ’)化合物可通過通式(Ⅳ)化合物與通式(Ⅲ’)反應并接著與疊氮化鈉反應制備。
其中m=0且B是-CO-CH(R3)-CH2-R基團的通式(Ⅰ)化合物可通過催化氫化其中B’是-CO-C(R3)=CHR的通式(Ⅱ)化合物中雙鍵并接著如上所述與通式(Ⅲ)或(Ⅲ’)的中間體反應獲得。與中間體(Ⅲ’)反應得到的通式(Ⅰ)化合物還可任意地如上所述與疊氮化鈉反應轉化為另一個其中A是四唑基的通式Ⅰ化合物。
其中m是1且B是-CH=C(R3)CO-Ar的通式(Ⅰ)化合物可通過通式(Ⅴ)化合物
其中p,n,R1,R2和R4定義如上，且A’與A定義相同只是不是-COOH，與通式(Ⅵ)的中間體反應獲得Ar-CO-C(R3)=CH-COOH(Ⅵ)其中B是-CO-C(R3)=CH-R或-CO-CH(R3)-CH2-R的化合物可用類似的方法制備。這類反應通過活化式(Ⅵ)化合物的羧基進行，例如通過混合酸酐或酰基氯，或在合適的縮合劑如二環己基碳化二亞胺存在下。如此得到的通式(Ⅰ)化合物當A’=-COO-(C1-C4)烷基時，可通過在堿條件下水解酯基，或當A’=-CN時與疊氮化物反應，后續步驟如前所述，轉化為其它的通式(Ⅰ)化合物。
可通過在相應的酸(其中A’是-COOH)的酸條件下酯化制備通式(Ⅴ)化合物，可按照Synthesis,(1997),778-782中描述的方法制備，此文獻在此引作參考。合適的酯化條件可以是甲醇在足以使氨基鹽化和催化酯化反應量的硫酸存在下。接著用弱堿處理可恢復游離氨基。
通式(Ⅵ)化合物可按照Am.Soc.,70,3359(1948)中描述的方法制備，此文獻在此引作參考。本發明化合物的生物活性本發明化合物與MDM2蛋白，特別是人MDM2蛋白相互作用，并抑制MDM2蛋白與其它蛋白，特別是MDM2與p53之間的相互作用。MDM2具有很多功能，主要的一個是在細胞周期中控制p53的活性(Piette等的綜述，1997，癌基因15,1001-1010)。MDM2在其氨基末端區域形成疏水口袋，這特別適應肽表位存在于p53氨基末端(Kussie等.1996，科學274,948-953)。p53的N-末端與MDM2的N-末端區之間的相互作用是MDM2發揮對p53活性控制的主要先決條件。與MDM2 N-末端區域的疏水口袋結合的化合物因此可作為MDM2調節的p53的抑制和降解的拮抗劑。依據這個機理活性p53的水平可被提高，特別反應在對p53調節的編程性細胞死亡和細胞周期停止的誘導敏感的腫瘤細胞中。至今為止，已知只有肽和蛋白具有此類型干預的可行性(Bttger等.1997，分子生物學雜志269,744-756；Bttger等.1997，今日生物學7,860-869)。本發明的化合物第一次提供了可中斷MDM2-p53相互作用的低分子量化學物質。
另外，本發明化合物可抑制MDM2從其N-末端區域與其它具有相似作用位點的蛋白如E2F-1的相互作用。本發明化合物因此可對獨立于p53狀態的腫瘤細胞顯示抗增生或致敏效果(實施例15)。
另外，本發明化合物與MDM2的相互作用特別專一。在哺乳動物細胞中，存在著許多具有疏水口袋可容納化合物或疏水殘基的蛋白，這類蛋白的一個例子是谷胱甘肽S-轉移酶(GST)(Reinemer等.1992，分子生物學雜志227,214-226；Cameron等.1995,Structure 3,717-727；McTigue等.1995，分子生物學雜志246,21-27)。本發明已發現，特定的化合物可以與MDM2和GST都相互作用。這類化合物的一個例子是利尿酸，以前曾報道過它是GST抑制劑，與此蛋白的疏水口袋結合(Oakley等.1997，生化36,576-585；Ploemen等.1993,Xenobiotica 23,913-923)。在本發明中，驚奇地發現利尿酸與MDM2的相互作用。因此本發明提供了化合物分別對MDM2和GST結合活性不同的分析鑒定。本發明進一步提供了對MDM2具有高親和性且對GST具有低或無親和性的化合物的鑒別技術。對MDM2-p53之間的相互作用有高的抑制活性且對GST的抑制活性相對低或無的化合物是基于抑制MDM2的對治療性抗腫瘤效果誘導的特別優選的化合物，因為許多腫瘤在化療周期中耐受腫瘤細胞的數量會增加，在很多情況下使酶GST上調(Chen and Waxman1994，生化藥理.47,1079-1087；Pickett andLu 1989，生化綜述年報.58,743-764)。與MDM2和GST之間都有相互作用的化合物會由于競爭導致可對MDM2抑制的化合物缺失。此類型化合物如LSM 83177(實施例12的化合物，也稱為化合物E)，在本發明中已發現它是獨立于其GST狀態的腫瘤細胞的潛在致敏劑(實施例15)。LSM 83177的化學結構是
另外，低或無GST抑制活性是治療有效的MDM2拮抗劑所期望的性質，因為毒副作用如利尿，高血糖，高血鈣可能與GST的抑制有關(O’Dwyer等.1991，癌癥研究.51,6059-6065；Oakley等.1997，生化36,576-585)。
下面實施例12-15證明本發明化合物的生物活性是如何測定的。
本發明化合物可在0.01mg-0.4g每公斤體重每天的劑量范圍內給藥。獲得最佳效果的優選劑量方案是使用約1mg-約50mg每公斤體重每天，使用單位劑量達到使體重約70Kg的患者在24小時內服用約70mg-約3.5g活性化合物。這種劑量方案可調整以獲得最佳的治療效果。例如，給藥劑量應考慮患者的治療狀況。活性化合物可通過口服，靜脈內，肌肉內或皮下給藥。
本發明的藥物組合物含有治療有效量的至少一種本發明化合物及藥學上相容的賦形劑。
口服的組合物一般包括惰性稀釋劑或可食載體。它們可封入明膠膠囊或壓成片。其它的口服給藥形式有膠囊，藥丸，酏劑，懸浮液或糖漿。
片劑，藥丸，膠囊和類似的組合物可含有下列組分(除了活性成分之外)粘合劑如微晶纖維素，西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如海藻酸，淀粉羥乙酸鈉(primogel)，玉米淀粉等；潤滑劑如硬脂酸鎂；液化劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精或調味劑如薄荷香料，水楊酸甲酯或橘子味香料。當組合物選擇為膠囊形式，它還可含有液體載體如脂肪油。在其它的組合物中可含有不同的材料以改變其物理形式，例如包衣劑(用于片劑和藥丸)如糖或蟲膠。用于制備組合物的材料應是在所用劑量為藥學純且無毒的。
為了制備腸道外給藥的藥物組合物，可將活性組分包括在溶液或懸浮液中，其中還可含有下列組分無菌稀釋劑如注射用水，鹽水溶液，油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如芐基醇；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；絡合劑如亞乙基二氨基四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽和調節溶液張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。腸道外給藥的制劑可裝入安瓿，單劑量注射器，玻璃或塑料小瓶中。
本發明的另一目的是提供含有至少一個本發明化合物及藥學上合適的賦形劑的藥物組合物。
化學實施例部分下面通過制備和實施例進一步舉例說明本發明。
在查耳酮環上位置編號如下
制備14’-羥基-3-氯查耳酮向1.36g 4-羥基苯乙酮在14ml乙醇中的溶液中，于室溫加入0.64g氫氧化鋰一水合物，再加入6ml乙醇用于幫助攪拌。加入1.17ml3-氯苯甲醛，然后將反應混合物回流7小時。真空蒸除溶劑并將剩余物溶于15ml水。將溶液在0℃冷卻并加入15ml 1N的鹽酸。分離出黃色固體，攪拌1小時，然后過濾并真空干燥過夜。固體用2.5ml96％乙醇結晶，得到0.41g產物，m.p.163-165℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.90ppm(d,2H)；7.4ppm(m,H)；7.6ppm(d,1H)；7.8ppm(m,1H)；8ppm(d,1H)；8.05ppm(m,1H)；8.1ppm(d,2H)；10.45ppm(s,1H).制備23’,4’-二氯-4-羥基查耳酮向4-羥基苯甲醛(1.22g)在20ml乙醇的溶液中于室溫加入0.63g氫氧化鋰一水合物和1.89g 3,4-二氯苯乙酮，然后回流6小時(4小時后分離出深紅色固體)并在室溫過夜。濾出固體，母液濃縮至干，然后將剩余物溶于乙酸乙酯和1N鹽酸的混合物中。分出有機相，用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮至干。剩余物(1.4g)再溶于30ml水，乙酸乙酯和1N鹽酸直到達到酸性pH。攪拌30分鐘后，分出有機相，用鹽水洗滌兩次，用硫酸鈉干燥并濃縮至干。剩余物用乙酸乙酯(30ml)在回流下結晶，得到0.946g產物為黃色固體，m.p.198-199℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.85ppm(d,2H)；7.7-7.9ppm(m,5H)；8.1ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H)；10.15ppm(s,1H).制備3:3,4-二氯-4’-羥基查耳酮向4-羥基苯苯乙酮(5.45g)在60ml乙醇的溶液中加入3.36g氫氧化鋰一水合物和7g 3,4-二氯苯甲醛，然后回流2小時。再加入3g 3,4-二氯苯甲醛并將反應混合物再回流21小時并在室溫過夜。過濾回收分離的固體；并再溶于50ml水和50ml 1N鹽酸中。將黃色固體分離物攪拌1小時，然后過濾收集并在40℃真空干燥幾小時，得到7.3g產物，用乙酸乙酯(90ml)和異丙醇(5ml)的混合物結晶。得到1.3g產物。用硅膠色譜純化母液并濃縮至干又回收2.4g產品，m.p.190-192℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.9ppm(d,2H)；7.65ppm(d,1H)；7.7ppm(d,1H)；7.8ppm(m,1H)；8.05ppm(d,1H)；8.1ppm(d,2H)；8.3ppm(s,1H)；10.4ppm(s,1H).制備4:3,4-二氯-4’-羥基-二氫查耳酮向0.6g 3,4-二氯-4’-羥基查耳酮在10ml乙醇中的溶液和3ml二噁烷中加入0.14g 10％鈀炭，然后氫化1小時15分鐘。通過硅藻土塞子濾出催化劑并將反應混合物濃縮至干。將此剩余物用乙醚結晶得到0.124g產物，m.p.128-130℃。用硅膠色譜純化(洗脫劑；石油醚/乙酸乙酯8∶2)母液并濃縮至干又回收0.221g產品。1H-NMR in d6-DMSO:2.9ppm(t,2H)；3.3ppm(t,2H)；6.8ppm(d,2H)；7.25ppm(d,1H)；7.5-7.6ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H)；10.3ppm(s,1H).制備52,3-二氯-4-丁酰苯酚將144g 2,3-二氯茴香醚溶于288ml二硫化碳中并加入92.3g丁酰氯。在攪拌和冰冷卻下，滴加入115g三氯化鋁，并保持溫度低于25℃。將反應混合物在室溫保持1小時，然后在45℃加熱45分鐘。加入280ml正庚烷和115g三氯化鋁后，使反應混合物反應過夜，然后蒸除二硫化碳并再滴加入200ml正庚烷。固體分離物在攪拌下于80-90℃加熱3小時并在室溫過夜。過濾收集固體，然后用86ml濃鹽酸和1L水處理。混合物用乙醚萃取3次且有機萃取物倒出并用水和750ml 5％氫氧化鈉洗滌。萃取物用濃鹽酸處理且油狀分離物在冷卻下結晶。得到114.7g產物。制備6(2,3-二氯-4-丁酰苯氧)乙腈將45g 2,3-二氯-4-丁酰苯酚與26.7g調色劑和16g氯代乙腈在190ml二甲基亞砜中混合，并將混合物在攪拌下于85℃加熱2小時30分鐘。將反應混合物用490g冰使之驟冷。用乙醚萃取4次得到油狀分離物，有機相用400ml 5％氫氧化鈉處理并用水洗滌。有機相用硫酸鎂干燥并濃縮至干，得到45.2g油狀物，在188℃和0.8mmHg蒸餾，得到40g產物。制備75-[((2.3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑將40g(2,3-二氯-4-丁酰苯氧)乙腈與11.5g疊氮化鈉和9.5g氯化銨在294ml二甲基甲酰胺中混合。將反應混合物在攪拌下在120-130℃加熱30分鐘，然后減壓蒸發溶劑(在80℃)。剩余物在攪拌下用1.3L水處理。將油狀分離物結晶并過濾收集。得到44g粗產物，用400ml甲醇和200ml水的混合物結晶，得到34.8g產物，m.p.135-137℃。元素分析(％理論值/實際值)C 45.73/45.43；H 3.84/3.73；N17.78/17.32；Cl 22.50/22.56.制備85-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑和5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氫)甲基]-2-甲基四唑將8.53g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑溶于120ml水和480ml丙酮中。加入31.8g碳酸鈉，然后滴加入52.8g二甲基硫酸酯并使反應混合物反應20小時。將混合物倒入水中，在90℃減壓蒸除有機溶劑。從水相冷卻結晶油狀分離物。將固體過濾并干燥得到7.93g 1∶1標題四唑的混合物。將固體用1∶1的苯/環己烷混合物重結晶，得到2.55g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑。將濾液濃縮至干且剩余物用環己烷結晶，得到3.5g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑。制備94-(氰基甲氧)苯乙酮向4-羥基苯乙酮(0.272g)在DMF(8ml，用分子篩干燥)的溶液中加入2-氯乙腈(0.164ml)接著加入碳酸鉀(0.636g)，將所得混合物在60℃加熱1小時。
冷卻至室溫后用水(40ml)稀釋，用HCl將溶液調至pH4并用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌一次，用Na2SO4干燥并蒸發至干，得到4-(氰基甲氧)苯乙酮為黑色固體(0.354g)。此材料可直接在下一步使用。1H-NMR(CDCl3):2.58ppm(s,3H)；4.85ppm(s,2H),7.05ppm(m,2H)；8.0ppm(m,2H).制備104-(5-四唑基甲氧)苯乙酮向4-(氰基甲氧)苯乙酮(0.349g)在DMF(5ml；用分子篩干燥)中的溶液加入疊氮化鈉(0.165g)和氯化銨(0.107g)，所得混合物在70℃加熱2.5小時。
將混合物冷卻至0℃并用1N HCl(50ml)處理。在0℃攪拌0.5小時后過濾回收黃色沉淀，并在40℃真空干燥過夜，得到4-(5-四唑基甲氧)苯乙酮(0.32g)為棕色固體。此材料可直接用于下一步。1H-NMR(DMSO-D6):2.45ppm(s,overlapping with DMSO signal)；5.6ppm(s,2H)；7.15ppm(d,2H)；8.0ppm(d,2H)；16.9ppm(br.s,1H).實施例14’-(乙氧羰基甲氧)-3-氯代查耳酮在室溫氮氣氛圍下，向4’-羥基-3-氯查耳酮(1.3g)在24ml無水二甲基甲酰胺中溶液加入1.73g碳酸鉀和0.84ml溴代乙酸乙酯。將反應混合物在60℃加熱1小時30分鐘，然后用100ml水稀釋并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。將有機萃取物倒出并用鹽水洗滌，有機相用硫酸鈉干燥并濃縮至干，得到剩余物(1.83g)用硅膠色譜純化(洗脫劑∶石油醚/乙酸乙酯7.5∶2.5)，得到0.66g產物，m.p.68-70℃。1H-NMR in CDCl3:1.3ppm(t,3H)；4.3ppm(q,2H)；4.75ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.34ppm(m,2H)；7.5ppm(m,1H)；7.55ppm(d,1H)；7.6ppm(m,1H)；7.7ppm(d,1H)；8.0ppm(d,2H).實施例24’-(羧甲氧)-3-查耳酮在室溫向0.345g 4’-(乙氧羰基甲氧)-3-氯代查耳酮在4ml乙醇中的溶液加入4ml水和0.212g碳酸鈉，并在室溫保持過夜。再加入1.5ml乙醇和1.5ml水并將反應混合物回流1小時，然后冷卻至室溫同時分離出黃色固體。過濾回收固體，再溶于水/乙酸乙酯中并加入1N鹽酸直到達到酸性反應。分離有機相，用鹽水洗滌，硫酸鈉干燥并濃縮至干，得到0.29g黃色固體，用乙酸乙酯(20ml)結晶得到0.12g產物，m.p.180-181℃。1H-NMR in d6-DMSO:4.9ppm(s,2H)；7.05ppm(d,2H)；7.5ppm(m,2H)；7.7ppm(d,1H)；7.85ppm(m,1H)；8.05ppm(d,m)；8.1ppm(s,1H)；8.2ppm(d,2H)；13.1ppm(s,1H).實施例33’,4’-二氯-4-(乙氧羰基甲氧)查耳酮在室溫和氮氣氛圍下，向3’,4’-二氯-4-羥基查耳酮(0.586g)在9ml無水二甲基甲酰胺中的溶液加入0.69g碳酸鉀和0.334g溴代乙酸乙酯。將反應混合物在60℃加熱3小時，然后冷卻至室溫并倒入40ml水和20ml乙酸乙酯的混合物中。將混合物保持攪拌使所有固體溶解，分出有機相，用乙酸乙酯洗滌，硫酸鈉干燥并濃縮至干，得到0.737g產物為黃色固體。1H-NMR in d6-DMSO:1.2ppm(t,3H)；4.2ppm(q,2H)；4.9ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.7-8.0ppm(m,5H)；8.15ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H).實施例43’,4’-二氯-4-(羧甲氧)查耳酮向0.38g 3’,4’-二氯-4-(乙氧羰基甲氧)查耳酮在4ml乙醇中的懸浮液加入4ml水和0.212g碳酸鈉并將其回流3小時30分鐘。將反應混合物冷卻至室溫并過濾分離固體，在水和乙酸乙酯之間分配，加入1N鹽酸直到酸性pH。分出有機相，用鹽水洗滌，硫酸鈉干燥并濃縮至干。剩余物用乙酸乙酯(10ml)結晶得到0.158g產物，m.p.203-206℃.1H-NMR in d6-DMSO:4.8ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.7-8.0ppm(m,5H)；8.1ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H)；13.1ppm(s,1H).實施例53,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)二氫查耳酮向3,4-二氯-4’-羥基查耳酮(0.221g)在3.5ml無水二甲基甲酰胺的溶液中加入0.125ml溴代乙酸乙酯和0.26g碳酸鉀，然后在60℃加熱1小時45分鐘。將反應混合物冷卻至室溫并用20ml水和20ml乙酸乙酯稀釋。將混合物用1N鹽酸酸化至pH3-4，分離有機相，用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮至干。得到0.268g產物為黃色油狀物。1H-NMR in CDCl3:1.3ppm(t,3H)；3.0ppm(t,2H)；3.2ppm(t,2H)；4.25ppm(q,2H)；4.6ppm(s,2H)；6.9ppm(d,2H)；7.05ppm(dd,1H)；7.3ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H).實施例63,4-二氯-4’-(羧基甲氧)二氫查耳酮向0.268g 3,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)二氫查耳酮在3ml乙醇的溶液中，加入3ml水，然后再加入0.15g碳酸鈉并在70℃加熱2小時。將反應混合物濃縮至干，加入4ml水和2ml 1N鹽酸，直到pH2-3。攪拌30分鐘后，過濾回收固體，用水在過濾器上洗滌并在50℃真空干燥過夜。得到0.196g產品為白色粉末，m.p.148-150℃。1H-NMR in d6-DMSO:2.9ppm(t,2H)；3.3ppm(t,2H)；4.7ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.25ppm(dd,1H)；7.6ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H)；13.1ppm(s,1H).實施例75-[((2.3-二氯-4-(2’-亞甲基丁酰)苯氧)甲基]四唑將39.2g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑，4.33g多聚甲醛和11.2g二甲基胺鹽酸鹽在1ml乙酸中的溶液在80-90℃加熱2小時。冷卻至室溫后，將反應混合物在水和乙醚之間分配。水溶液用碳酸氫鈉處理并將固體分離過濾收集。將固體(22g)用220ml水和220ml2N氫氧化鈉處理，混合物加熱直到完全成為溶液后再加熱1小時。將水相酸化并用乙醚萃取。將有機萃取物倒出，用硫酸鎂干燥并濃縮至干。剩余物(7.66g)用70ml苯結晶，得到5.3g產物。元素分析(％理論值/實際值)C 47.72/47.01；H 3.70/3.52；N17.13/16.78；Cl 21.67/21.43。實施例85-[((2,3-二氯-4-(2’-亞甲基丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑將9.5g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑，1.01g多聚甲醛和2.53g二甲基胺鹽酸鹽在5滴乙酸中的溶液在80-90℃加熱2小時。將混合物濃縮至干并倒入100ml水，加入200ml碳酸氫鈉溶液并將混合物連續攪拌4小時直到固體分離。過濾固體得到6.3g粗產物，用130ml 1∶1的苯/環己烷混合物重結晶，得到5.58g產物，m.p.124-125℃。元素分析(％理論值/實際值)C 49.28/49.69；H 4.14/4.33；N16.42/16.41；Cl 20.79/20.53。實施例95-[((2,3-二氯-4-(2’-亞甲基丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑將8g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑，0.89g多聚甲醛和2.29g二甲基胺鹽酸鹽在4滴乙酸中的溶液在80-90℃加熱2小時。過濾收集固體。濾液用碳酸氫鈉溶液處理并用水浴加熱。過濾收集形成的固體，得到7.76g剩余物，用400ml環己烷結晶，得到4.16g產物。元素分析(％理論值/實際值)C 49.28/49.11；H 4.14/4.55；N16.42/16.13；Cl 20.79/20.54。實施例102-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯(化合物D)向10.3g β-(4-氯苯甲酰)丙烯酸溶于100ml四氫呋喃的溶液中，加入7.02ml三乙胺并冷卻至-15℃。滴加入5.25ml氯代甲酸乙酯并使反應混合物連續攪拌15分鐘。向反應混合物中滴加入12.6g 2-(4-(2-氨基乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯在20ml四氫呋喃中的溶液，在-15℃保持30分鐘，在0℃保持2小時30分鐘并在室溫保存過夜。將混合物濃縮至干再溶于乙醚。有機相用2N鹽酸，然后是2N氫氧化鈉，最后是水洗滌，然后用硫酸鈉干燥并濃縮至干。剩余物用少量乙醚結晶后得到10g產物，m.p.76-77℃。元素分析(％理論值/實際值)C 64.94/64.77；H 5.90/5.59；N3.15/3.14；Cl 7.98/8.12。實施例112-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸將20g 2-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯溶于70ml甲醇中并加入100ml 1N氫氧化鉀溶液。連續攪拌3小時并在45℃加熱。冷卻至室溫后，將混合物濃縮至干，再溶于乙醚中并用1N鹽酸處理。分離有機相，用硫酸鈉干燥并濃縮至干，得到8g產物為棕色無定形固體。實施例123,4-二氯-4’-(羧基甲氧)查耳酮(化合物E或LSM83177)
在室溫氮氣氛圍下，向3,4-二氯-4’-羥基查耳酮(0.586g)(制備3)在9ml無水二甲基甲酰胺中的溶液加入0.69g碳酸鉀和0.334g溴代乙酸乙酯。將反應混合物在60℃加熱3小時，然后冷卻至室溫并倒入40ml水和20ml乙酸乙酯的混合物中。將混合物連續攪拌直到所有固體溶解，然后分離有機相，用乙酸乙酯洗滌，硫酸鈉干燥并濃縮至干，得到3,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)查耳酮。按照實施例4的類似方法，將3,4-二氯-4’--(乙氧羰基甲氧)查耳酮皂化得到3,4-二氯-4’-(羧基甲氧)查耳酮。實施例12A3,4-二氯-4’-(5-四唑基甲氧)查耳酮(化合物F)在氮氣氛圍下，向攪拌著的4-(4-四唑基甲氧)苯乙酮(0.15g)在乙醇(2ml)中的懸浮液中加入氫氧化鋰水合物(0.059g)，再加入3,4-二氯苯甲醛(0.123g)。將所得混合物加熱回流2小時。冷卻至室溫，過濾收集沉淀并再懸浮于水(2ml)中。用1N HCl處理將懸浮液調至酸性pH并攪拌2小時。過濾分離固體并用MeOH重結晶，得到3,4-二氯-4’-(四唑基甲氧)查耳酮為黃色粉末(117mg)。m.p.＞230℃1H-NMR(DMSO-D6):5.45ppm(s,2H)；7.25ppm(d,2H)；7.65ppm(d,1H)；7.78ppm(m,1H)；7.88ppm(m,1H),8.10ppm(d,1H),8.20ppm(d,2H)；8.35ppm(m,1H).生物試驗部分實施例13MDM2的制備將從PCR獲得的編碼人MDM2氨基酸1-118的DNA片斷在適合于在E.coli中表達的T5啟動子和pUBS 520阻抑蛋白(Brinkmann等.，1989，基因，85,109-114)的控制下插入一修飾的質粒載體(pQE40；QIAGEN Inc.,Chatsworth CA,USA)。BL21細胞(E.coli)在LB介質37℃中生長，并加入1mM IPTG用于誘導表達，允許其生長＞15小時用于積累MDM2蛋白。收集細胞，用French Press破壞并用標準方案制備不溶的MDM2蛋白。將MDM2包涵體增溶并重折疊于100mM Tris,pH7；1mM EDTA；10mM DTT(按照Rudolph等.1997，蛋白功能A practical approach,2nd ed.,IRL Press,57-99)。一般所制備MDM2制劑＞80％純度的適于化合物的相互作用分析。用標準色譜過程(疏水相互作用色譜)進行進一步純化。得到更長的MDM2片斷1-213aa并用上述類似方法純化。實施例14MDM2和p53之間相互作用的BIACORE分析為了量化所選化合物在p53上結合MDM2蛋白的性質，需使用BIACORE 2000的生物傳感器測定方法。BIACORE 2000是由BIACORE AB提供的生物傳感器系統。此生物傳感器的技術是基于表面胞質基因組共振(SRP)的光現象，檢測接近于傳感器晶片表面的溶液的折射率的變化。折射率與此層中的質量濃度直接相關且當分析物與表面固定化配體結合時增加。SPR應答在共振單元(RU)中表達并按照時間連續記錄得到傳感圖。當一個相互作用完成后，可使用能除去結合分析物且不影像結合配體活性的溶液再生表面。將相應于野生型人p53的氨基酸19-32且從GenosysBiotechnologies(Cambridge)獲得的N-末端生物素化的肽(5μM在PBST緩沖液中)以5μl/分鐘的流速在SA-傳感器晶片(傳感器晶片用鏈霉親和素預先固定化，BIACORE A)上捕捉6分鐘。將40μl MDM2 1-213(100nM在PBST)與40μl樣品(40μM在含有2％DMSO的PBST中)混合。在10℃保溫15分鐘后，將30μl混合物以10μl/分鐘流速注射到傳感器晶片上。表面用PBST緩沖液清洗4分鐘后，可計算樣品的抑制效果。用100mM HCl和100mM H3PO4清洗再生傳感器表面。

圖1顯示所選混合物在MDM2與p53衍生肽作為相關單元之間相互作用的抑制效果。實施例15GST活性的分光光度分析將人細胞系如人克隆癌細胞系HT29在添加了抗菌素的MDEM,5％CO2中和37℃的條件單層生長并加入胎牛血清，一周傳代2次。在胞質中的GST活性按照Habig等(Habig,W.H.,Pabst,M.J.&Jakoby,W.B.，生化雜志249,7130-7139,1974)的方法測定，使用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和谷胱甘肽。GST催化的CDNB與谷胱甘肽的結合導致CDNB-谷胱甘肽產物在340nm具有很強的摩爾吸收。探測吸收變化5分鐘。
收集1×106個細胞并用冰冷卻的磷酸鹽緩沖的鹽水在1000rpm在4℃洗滌1次10分鐘。將細胞粒再懸浮與200μl冰冷卻的磷酸鹽緩沖的鹽水中，在冰上超聲2分鐘。將超聲物(sonicate)在Eppendorf離心機11750g,4℃離心15分鐘，上清液用于分析GST活性。利尿酸(EA)固有的抑制效果和選擇的MDM2拮抗劑對HT29胞質GST活性的檢測通過在加入谷胱甘肽之前直接向細胞提取物加入藥物進行。表1顯示了EA和LSM 83177在HT29細胞提取物中對GST活性的抑制效果。實施例16MDM2拮抗化合物的輻射增敏活性的生物分析含有野生型p53和低水平GST的人腫瘤細胞系，如MCF7(乳腺癌)或含有p53突變體和高GST含量的，如MCF7 ADR(抗阿霉素乳腺癌)在RPMI介質中培養，添加胎牛血清至半鋪滿狀態。
為了檢測所選化合物對這些細胞的輻射增敏活性，在室溫，以低毒劑量2Gy(戈J/Kg)且帶有137銫源測定。帶有2Gy的單層細胞在指數生長階段照射后，細胞與不同濃度的所選化合物一起孵化2-6小時。將細胞用胰蛋白酶消化并接種于在6孔板的適當的稀釋液中。12-13天后使存活細胞接受胰蛋白酶作用并用錐蟲藍對活/死細胞染色測定細胞數目。按照Khjl等.,1996,Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.34,375-380建立方案。表2顯示了所選化合物對具有低或高GST含量的MCF-7細胞系的不同的輻射增敏活性。
在MCF-7細胞中，兩個化合物，利尿酸和LSM 83177都可觀察到輻射增敏作用通過藥物增強輻射，當藥物在細胞上孵化2小時時因數為1.5，當孵化6小時時，因數為2。
權利要求
1.使用通式(Ⅰ)化合物，其立體異構體或其藥學上可接受的酸或堿，制備具有MDM2拮抗活性的藥物
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基團可在鄰、間、對位；-A選自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基團
其中R’是氫或(C1-C4)烷基；或基團A-(CH2)p-C(R1)(R2)-選自苯基，芐基或(吲哚基)甲基，它可被R4基團取代；-p是0,1或2；-R1和R2分別選自氫或(C1-C8)烷基，或它們與相連的碳原子一起形成一(C3-C7)環烷基；-R4是0至2個取代基，分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基團
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整數；-m是0或1；-B選自直鏈或支鏈C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或當m為0時，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或當m為1時是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R選自氫，-Ar或-CO-Ar；-R3是氫或(C1-C8)烷基；-R5和R6分別是(C1-C4)烷基或與它們相連的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，嗎啉代或硫代嗎啉代基團；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3個分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代。
2.權利要求1的用途，用于治療腫瘤。
3.權利要求2的用途，所治療的腫瘤是肉瘤。
4.通式(Ⅰ)化合物，其立體異構體或其藥學上可接受的酸或堿
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基團可在鄰、間、對位；-A選自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基團
其中R’是氫或(C1-C4)烷基；或基團A-(CH2)p-C(R1)(R2)-選自苯基，芐基或(吲哚基)甲基，它可被R4基團取代；-p是0,1或2；-R1和R2分別選自氫或(C1-C8)烷基，或它們與相連的碳原子一起形成一(C3-C7)環烷基；-R4是0至2個取代基，分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基團
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整數；-m是0或1；-B選自直鏈或支鏈C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或當m為0時，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或當m為1時是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R選自氫，-Ar或-CO-Ar；-R3是氫或(C1-C8)烷基；-R5和R6分別是(C1-C4)烷基或與它們相連的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，嗎啉代或硫代嗎啉代基團；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3個分別選自氯，溴，碘，氟，直鏈或支鏈(C1-C8)烷基，羥基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代，條件是，當m是0時，A選自-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基團
其中R’是氫或(C1-C4)烷基；和當m是0時，A是-COO-(C1-C4)烷基，B只能是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6。
5.按照權利要求4的化合物，其中m是0,R是氫且A是四唑基。
6.按照權利要求4的化合物，其中Ar是被1-2個氯原子取代的苯基。
7.按照權利要求4-6的任一化合物，其中R4是1-2個氯原子。
8.按照權利要求4-7的任一化合物，其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基團在對位。
9.下列任一通式化合物
和
10.藥物組合物，含有至少一種權利要求4-9的任一化合物及藥學上合適的賦形劑。
全文摘要
本發明涉及使用通式(Ⅰ)的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物,其立體異構體或其藥學上可接受的酸或堿,制備具有MDM2拮抗活性的藥物,式中各基團定義詳見說明書。
文檔編號A61K31/192GK1232028SQ99104509
公開日1999年10月20日 申請日期1999年3月30日 優先權日1998年3月30日
發明者R·迪多米尼可, S·漢森, B·卡路薩, E·門特, R·舒馬徹 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司