專利名稱：：含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種含有噻氯匹定(ticlopidine)和銀杏提取物的藥物組合物。具體而言，作為一種抗血栓形成的制劑，聯合使用含有所述噻氯匹定和銀杏提取物的具有PAF-拮抗劑和抗氧化劑作用的藥物組合物，用來自然地抑止由于單獨反復使用噻氯匹定而產生的毒性所導致的中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥。此外，噻氯匹定通過減少血漿中的纖維蛋白原同時增加血紅細胞的可塑性來降低血液的粘度。同樣，噻氯匹定是一種用來抑制血小板功能的合成藥。該藥被廣泛地用于臨床預防與血栓癥、動脈硬化、諸如絞痛以及間歇性跛行等的缺血性心臟疾病同時發生的中風的目的。然而，如果重復使用噻氯匹定本身，就會產生問題，其中主要的副作用是可逆的中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥。中性白細胞減少癥定義為血液中嗜中性白細胞數降低到1200/mm3以下。粒細胞缺乏癥定義為血液中嗜中性白細胞數降低到450/mm3以下。在開始3個月的治療中，患者中表現出前述的毒性的發生率為0.8％。盡管可用粒細胞集落刺激因子改善景況，但不能作為基本的解決方法。因此，用阿斯匹林作為中風等的首選藥物，而噻氯匹定作為輔助藥物在患者對阿斯匹林不耐受的情況下使用。在惡化的條件下，噻氯匹定可導致骨髓毒性，引起血小板減少癥，其依次導致紫癜或出血時間延長。問題可由于再生障礙性貧血的出現更加復雜。另外，在也出現類似噻氯匹定的中性白細胞減少癥的問題的氯氮平的情況下，已經聯合使用L-抗壞血酸，一種抗氧劑，來改善情況。[韓國專利申請No.97-700915]。但是，該方法不是優選的，因為L-抗壞血酸僅有抗氧劑作用，而沒有提高氯氮平的效果。本發明的總結為了解決單獨使用噻氯匹定作為抗血栓形成制劑時各種問題，將具有抗氧劑作用和血小板聚集抑制效果的銀杏提取物與所述的噻氯匹定結合使用。因此，本發明的目的是提供一種新的含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物，其能夠降低中性白細胞減少癥毒性并提高對血小板聚集的抑制。圖2表示表示在處理16周繼而停止2周后噻氯匹定單獨使用和噻氯匹定與銀杏提取物結合使用對大鼠股骨骨髓細胞數量的影響。圖3是在16周期間噻氯匹定單獨使用或與銀杏提取物結合使用(5∶1，5∶2，5∶4)時白鼠股骨骨骺骨髓細胞的組織和對照組的照片(x400)。圖4是在噻氯匹定單獨使用或與銀杏提取物結合使用(5∶2)處理16周繼而停止2周后白鼠股骨骨骺骨髓細胞的組織照片(x400)。圖5是柱形圖，表示當噻氯匹定單獨使用或與銀杏提取物結合使用時對噻氯匹定(30mg／ml)引起的CFU-C的抑制效果。圖6是柱形圖，表示當噻氯匹定(10-4M)單獨使用或與銀杏提取物結合使用(5∶2)時對由骨髓細胞的過氧化氫引起的過氧化脂質的效果。優選實施方案的詳細說明本發明涉及含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物。本發明尤其涉及所述的藥物組合物，其用作一種抗血栓制劑，含有噻氯匹定和銀杏提取物活性成分。現更詳細地描述本發明如下本發明涉及含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物，其具有PAF-拮抗劑和抗氧化劑的作用。該藥物組合物在此用作抗血栓形成的制劑，以改善單獨使用噻氯匹定導致中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥。基于所述發明，噻氯匹定(5-[(2-氯苯基)甲基]-4，5，6，7-四氫噻吩并[3，2-C]吡啶)屬于噻吩并吡啶類，由于其抗血栓形成的性能作為血小板聚集抑制劑廣泛應用。噻氯匹定抑制了糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的表達，糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板血漿膜上的纖維蛋白原受體，因此抑制了ADP導致的血小板的聚集。另外，所述噻氯匹定抑制了膠原蛋白、花生四烯酸、凝血酶和PAF誘發的血小板聚集，好象血小板被麻醉了一樣。簡而言之，認為所述的噻氯匹定在此具有抗血栓形成的效果。通過減少血漿中的纖維蛋白原，噻氯匹定降低了血液粘度，具有提高血紅細胞可塑性的效果。除了這些優點，仍然存在與嗜中性白細胞減少、粒細胞缺乏癥相關的問題。因此，本發明的特征在于含有所述噻氯匹定和適量銀杏提取物的藥物組合物，用于提高對血小板聚集的抑制效果同時解決上述問題。基于所述的發明，使用銀杏提取物，其通過該主題所屬領域普通技術人員-般公知的方法制備。優選使用含有大于15重量％黃酮-甙、萜烯-內酯和烷基-苯酚化合物的銀杏提取物。一般已知由這類工藝得到的銀杏提取物含有具備抗氧劑和細胞保護作用的黃酮甙。據報道，含有萜烯內酯的銀杏提取物除了擴張血管和心血管的作用以外，對PAF和ADP導致的血小板聚集有抑制效果。假定銀杏葉萃取物具有通過其抗氧劑性能改善嗜中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥狀況的效果。換句話說，當噻氯匹定和銀杏提取物聯合使用時，有效地去除了反應性代謝物的自由基，諸如噻氯匹定誘導的過氧化物陰離子。在這種條件下，在從骨髓過氧化物酶和白細胞衍生的親核試劑中，即，蛋白質和谷胱甘肽中，缺乏共價鍵，結果顯著減少了嗜中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥。基于所述發明，在組合物中，對于100重量份噻氯匹定含有10-240重量份銀杏提取物。銀杏提取物以每日40-480mg的量使用，優選80-240mg。如果銀杏提取物部分降低到10重量份以下，不能以顯著的方式達到本發明的目標效果。如果用量大于240重量份，超過推薦的劑量，有可能產生其他不希望的副作用。另外，如果每日劑量小于40mg，不能產生顯著的效果。如果用量大于480mg，超過推薦劑量，有可能產生其他不希望的副作用。基于所述發明的藥物組合物可經腸給藥，諸如口服。所述組合物特別可配制成片劑、泡騰劑(vesicant)、顆粒劑或膠囊劑。在這個方面，藥劑包括指定量的噻氯匹定和銀杏提取物，以及在藥物制備中常用的稀釋劑、載體和助劑。例如片劑可包括活化填料、顆粒、稀釋劑、結合劑、消散劑、潤滑劑、穩定劑、顏料、甜料或香味劑。上述制備的配制品的單位劑量應含有50-600mg噻氯匹定，或優選100-250mg。銀杏提取物的單位劑量應為20-240mg，或優選40-120mg。基于所述發明的藥物組合物的每日用量取決于給藥方法或治療條件，但在口服情況下，成人每日優選給藥1-4次。這樣制備的含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物甚至在重復用藥后也不出現嗜中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥相關的問題。此外，組合物實際上借助噻氯匹定的抗血栓形成作用起抗血栓形成和抗栓子劑的作用，而沒有任何諸如細胞毒性的副作用。基于下列非限定性的實施例將更詳細地解釋本發明。制備實施例100g干燥粉末形式的銀杏提取物置于離心管中。加入930ml60v/v％的丙酮含水溶液，使銀杏葉粉末充分泡制。12小時后，減壓過濾溶液，濾液減壓濃縮到150ml。隨后，加入水，使溶液達到200ml，然后用力混和。之后，溶液在15℃冷卻12小時，過濾分離上層清液和沉淀。在攪拌期間，加入50g硫酸銨。15分鐘后，向其加入37ml甲乙酮和25ml丙酮。然后，用甲乙酮和丙酮1∶1的混和溶液將有機溶劑層萃取分離3次。減壓濃縮溶液直到甲乙酮和丙酮層的總量等于10g。在所述濃縮物中加入68ml50v/v％的乙醇溶液并溶解，隨后用Diaplo(R)超率層(AniconeCo.，USA)在4大氣壓下過濾溶液。然后，將濾液減壓濃縮到5g，用25m190v/v％乙醇溶液溶解。溶液在室溫儲存1天。隨后，過濾溶液直至透明并在最高60℃的溫度減壓下干燥。結果得到2.16g活性成分(黃色粉末)。當聯合使用50mg/kg噻氯匹定和40mg/kg銀杏提取物時，表現出95％的血小板聚集抑制率，比單獨使用噻氯匹定的效果強1.5倍。所述的聯合給藥效果類似于使用200mg／kg噻氯匹定情況下的血小板聚集抑制效果。實驗2小鼠急性血栓模型中痊愈率的提高含有噻氯匹定和銀杏提取物的制劑(regimen)在3天期間給小鼠服用。最后一次服用制劑1小時后，將含有膠原和腎上腺素(膠原1100ug+腎上腺素110ug/10ml鹽溶液/kg)的混和溶液注入尾部靜脈。適當地記錄肺栓塞導致的癱瘓或死亡以及痊愈的狀態。結果如表6所示。表6在上述實驗中，如果將含有膠原和腎上腺素的混和溶液注入尾部靜脈，其后短時間內由于肺動脈閉塞導致大量血栓產生，幾乎身體各個部分都處于癱瘓狀態并伴隨瞳孔放大。發生呼吸困難，繼而是癲癇發作。約5分鐘內，約70-80％的小鼠死亡。對于剩余者，幾乎每只小鼠都在15分鐘內死亡或處于繼續的癱瘓中。如表6所述，對照組只有20％的小鼠在15分鐘內痊愈并行動自由。但是，在單獨使用50mg/kg或100mg/kg噻氯匹定的情況下，分別表現出38％和47％的痊愈率，這證明了在急性血栓模型中使用噻氯匹定的抗血栓形成效果。另外，當50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg或40mg/kg銀杏提取物聯合使用時，分別記錄到了43％和71％的痊愈率，與單獨使用相比，有更高的痊愈率。實驗3通過動脈-靜脈分流(下文稱為A-V分流)形成血栓和對血小板聚集的效果在9天期間給雌性大鼠服用50或100mg/kg的噻氯匹定第一制劑和聯合服用50mg噻氯匹定與20mg(5∶2)或40mg(5∶4)銀杏提取物的第二藥劑。隨后，將A-V分流中棉線上形成的血栓重量記錄在表1中。在此，血栓重量按照實驗后即時的濕重和完全干燥后的干重測定。從對照大鼠A-V分流中的血栓重量計算血栓形成抑制率(5)。表7注*∶P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，統計學上顯著如表7所示，當單獨使用50mg/kg或100mg/kg噻氯匹定時，血栓形成抑制率分別為26％(濕)、25％(干)和36％(濕)、31％(干)。當聯合使用50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg銀杏提取物時，血栓形成抑制率為39％(濕)和36％(干)，從所示的各個用藥情況得出，這是對血小板聚集的抑制效果的顯著改進。聯合給藥組的結果類似于使用100mg/kg噻氯匹定所示的效果。另外，當聯合使用50mg/kg噻氯匹定和40mg/kg銀杏提取物時，血栓形成抑制率為45％(溫)和42％(干)，其遠遠超過了使用100mg/kg噻氯匹定的效果。實驗4大鼠的A-V分流中對血小板聚集的作用持續9天服用與實施例3相同的藥劑后，測量給A-V分流血栓形成的重量，同時收集血樣，用于AV-分流后研究對體外血小板聚集的作用。為了導致聚集，特別在各個血樣制備的PRP(在200Xg離心血樣10分鐘后的上層清液)中加入血小板聚集誘導劑ADP3×10-6M。進行A-V分流的大鼠的血小板比對照組更活潑。為了研究對未A-V分流大鼠血液的體外血小板聚集作用，使用濃度低于1×10-5M的ADP。設定A-V分流的對照組中大鼠的最大血小板聚集率為100，各個聚集率與之相比。結果如表8所示。表8(注)P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，統計學上顯著在對照組中向PRP加入ADP2.4分鐘后產生最大聚集。此后3分鐘，保持89％的聚集率。用了5.7分鐘完成解聚集。另外，對于單獨使用50mg/kg或100mg/kg噻氯匹定的大鼠，最大聚集為78％，是對照組的72％。在2和3分鐘的間隔，其聚集率分別為74％，45％，62％，21％。隨著時間，其聚集率顯著低于對照組。另外，對于聯合使用50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg銀杏提取物(5∶2)的組，最大聚集率、在2和3分鐘的間隔的聚集率分別為67％、58％和27％，類似于使用100mg所示的效果。但是，對于聯合使用50mg/kg噻氯匹定和40mg/kg銀杏提取物(5∶4)的組，最大聚集率、在2和3分鐘的間隔的聚集率均高于聯合使用50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg銀杏提取物的組。對于形成最大聚集和完全解聚集的時間間隔，單獨使用時，100mg組比50mg組短。當聯合使用50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg銀杏提取物時，時間間隔分別為1.6分鐘和3.4分鐘，類似于單獨使用100mg噻氯匹定的時間間隔。上述時間間隔比聯合使用50mg/kg噻氯匹定和40mg/kg銀杏提取物情況下的1.8分鐘達到血小板最大聚集的時間間隔和4.0分鐘的總聚集時間短。實驗5延長流血時間持續5天給雌性大鼠服用噻氯匹定與銀杏提取物的藥劑。最后一次服用藥劑1小時后，向肌肉組織注射250mg／kg氯胺酮用于麻醉。用剃刀片切尾端起2mm處，在5秒至出血停止期間用濾紙吸流出的血液。記錄各個時間，如表9所示。表9<tablesid="table9"num="009"><table>治療劑量(mg/kg/天)大鼠的數量時間(秒)對照-61028±335*噻氯匹定(T)5061546±332*噻氯匹定(T)10062023±872*T+銀杏提取物50+2061528±377*T+銀杏提取物50+4062480±921*</table></tables>注*∶P＜0.05統計學上顯著如表9所示，相對于僅使用了金合歡膠的對照組，使用50mg/kg組的出血時間增加了1.5倍。另外，相對于對照組，使用100mg/kg的組出血時間增加了2倍。當聯合使用50mg/kg噻氯匹定和20mg/kg銀杏提取物時，相對于對照組相應的出血時間增加了，但是相對于使用50mg/kg的組出血時間沒有增加。但是，當以5∶4的比例聯合使用噻氯匹定和銀杏提取物時，出血時間比單獨使用100mg/kg噻氯匹定延長了。因此，當聯合使用銀杏提取物時，可降低噻氯匹定的劑量而不會削弱其效果。實驗6使用藥物組合物16周后嗜中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞和淋巴細胞比例的變化為了顯示本發明藥物組合物的效果，使用下列試劑和儀器進行給藥實驗離心機，CBC瓶，5m1玻璃試管+肝素(200U／ml)29ul/試管，2mlEphendorph管，3ml注射器+21G針頭10ml注射器，鹽溶液，白細胞計數器，玻片，10％甲醛溶液，庫爾特粒度計(CoulterElectronicsInc.，Hialeah，Fla.33010，和Mississauga，Ontario)，切片機，HPLC-UV色譜(Kontron420，SupelcoInc.Bellefonte，PA)。此外，對于該實驗所使用的實驗動物，購買6周大、每只60g的大鼠(Spraque-Dawley)，在23℃和50％濕度飼養，隨意采食和飲水。將這些大鼠分成對照組、噻氯匹定給藥組和5∶1、5∶2和5∶4不同比例的噻氯匹定+銀杏提取物給藥組。由于劑量和混和比例產生的變化設定如下。按照臨床應用，每片噻氯匹定片劑為100mg或250mg，每日劑量為200mg-600mg。另外，每片銀杏提取物為40mg、80mg、120mg，每日劑量120mg-240mg。噻氯匹定與銀杏提取物的混和比例為5∶1、5∶2和5∶4。表10使用所述的試劑和儀器，持續16周將噻氯匹定給6周大的大鼠單獨口服或以5∶1、5∶2和5∶4的比例與銀杏提取物聯合口服。麻醉后，從腹部主動脈收集血液，用庫爾特粒度計對白細胞計數。用細胞化學染色方法測定嗜中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的比例。結果見表11。表11噻氯匹定單獨給藥或與銀杏提取物聯合給藥16周對大鼠白細胞數的影響每個數據表示為平均值±S.E．*P＜0.05；與標準組顯著不同#P＜0.05；與噻氯匹定治療組顯著不同結果，與對照組相比，當持續16周使用噻氯匹定時，血液中的白細胞表現出輕微的減少趨勢，但不是統計學上的顯著差別。另外，當持續16周以5∶1、5∶2和5∶4的比例聯合使用噻氯匹定與銀杏提取物時，與對照組或單獨使用噻氯匹定的組相比沒有顯著的差別。另外，對于嗜中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞或淋巴細胞，當在16周期間噻氯匹定或銀杏提取物單獨使用或以5∶1、5∶2和5∶4的比例聯合使用時，與對照組相比，沒有顯著的差別。但是，在嗜中性白細胞減少癥的情況下，正常的大鼠表現為14.3±1.5％，噻氯匹定單獨給藥組降低到10.5±1.1％(P＜0.05)。當在16周期間噻氯匹定和銀杏提取物以5∶2聯合使用時，結果為15.0±1.8％(P＜0.05)，與單獨使用噻氯匹定相比，恢復顯著。實驗7使用藥物組合物16周然后停藥2周，白細胞總數和嗜中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞或淋巴細胞比例的變化持續16周給大鼠服用與實驗6相同的制劑，分開飼養那些停藥2周的大鼠。如表12所示，特別將6周大的大鼠分成對照組、噻氯匹定給藥組和噻氯匹定+銀杏提取物聯合(5∶2)給藥組。16周治療后停藥2周，用與實驗6相同的方法測定白細胞數和嗜中性白細胞、嗜酸性細胞、嗜堿細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的比例。表12測定結果如表13所示。表13噻氯匹定單獨或與銀杏提取物聯合治療16周然后停藥2周對大鼠白細胞數的影響每個數據表示為平均值±S.E.當如表11持續16周口服噻氯匹定時，血液中的白細胞總數表現出減低的趨勢，然而嗜中性白細胞的數量表現出顯著的降低。當持續口服噻氯匹定16周然后停藥2周后，嗜中性白細胞的數量如對照組中的正常的恢復。另外，當以5∶2的比例聯合使用噻氯匹定與銀杏提取物時，其結果類似于對照組或單獨使用噻氯匹定的組。實驗8持續16周使用藥物組合物后骨髓細胞數量的改變為了測定由于噻氯匹定引起的骨髓中血細胞原的減少，持續16周給6周大的大鼠單獨使用噻氯匹定或以5∶1、5∶2和5∶4的比例與銀杏提取物聯合使用。隨后測定骨髓細胞。具體地，為了測定白細胞的原細胞數量，切割股骨部分并除去周圍的肌肉組織。然后，切除兩端的骨骺，得到約2cm的股骨。用1ml鹽水沖洗材料，使用的是3ml的注射器(21G)。然后，用Ephendorph管收集灌注液，在2000rpm離心5分鐘。除去上層清液，在沉淀的細胞層中加入含有10％乙酸和用于白細胞的染料的提爾克氏溶液。之后，輕輕地混合管子并在2000rpm離心5分鐘。除去上層清液后，在沉淀的細胞層中加入1ml鹽溶液。再次輕輕地混合管子，在2000rpm離心5分鐘，隨后洗滌細胞。然后，再次除去上層清液，在沉淀的細胞層中加入0.5ml鹽溶液并混合。由此形成的滴加入到血細胞計數器中，在RRRRR5部分(4個角和中心)對細胞計數。所計數值×50×10×103=白細胞原的數量/股骨。骨髓細胞的數量如圖1所示。特別當持續16周重復使用噻氯匹定時，骨髓中白細胞原的數量比對照組顯著降低。另一方面，當在16周期間以5∶2的比例聯合使用噻氯匹定和銀杏提取物時，與單獨使用噻氯匹定的情況相比，數量顯著恢復。另外，當在16周期間以5∶1或5∶4的比例聯合使用噻氯匹定和銀杏提取物時，與單獨使用的情況相比，數量有增加的趨勢，但是沒有顯著差別。結果表明了與前述嗜中性白細胞的變化相同的趨勢。實驗916周使用藥物組合物后停藥2周，骨髓細胞數量的改變使用與實驗8中相同的方法，持續16周將噻氯匹定給6周大的大鼠單獨或以5∶2的比例與銀杏提取物聯合使用，然后停藥2周。之后，測定股骨的骨髓細胞。結果如圖2所示。如圖1所示，當持續16周口服噻氯匹定時，骨髓細胞的數量顯著降低，而聯合給藥的數量與對照組類似。另一方面，當16周重復使用噻氯匹定，然后停藥2周，股骨的骨髓細胞數值恢復到正常水平。另外，當噻氯匹定和銀杏提取物聯合使用時，骨髓細胞的數量類似于對照組和單獨使用噻氯匹定的組。實驗10使用藥物組合物16周后骨髓細胞的組織學檢查為了測定由于噻氯匹定引起的骨髓中血細胞原的減少，持續16周給6周大的大鼠單獨使用噻氯匹定或以5∶1、5∶2和5∶4的比例與銀杏提取物聯合使用。隨后對骨髓細胞進行組織學檢查。具體地，為了對骨髓細胞進行組織學檢查，切割來自每個組的大鼠的股骨，用10％甲醛溶液保存。這樣提取的股骨在常規的組織學處理后用脫鈣劑脫鈣，埋入石蠟。這樣埋入石蠟的股骨組織被切成4um厚度，然后用蘇木精和曙紅染色。之后，用400倍光顯微鏡檢查切片。當持續16周將噻氯匹定單獨或與銀杏提取物以5∶1、5∶2或5∶4的比例聯合用于6周大的大鼠時，股骨骨髓細胞的組織學檢查得到的照片如圖3所示。與對照組相比，單獨使用噻氯匹定時的骨髓細胞密度表現出惡性的空泡形成，這由脂肪細胞的溢出造成。血細胞的前體，巨核細胞的密度與對照組相比在骨骺上降低了。在白細胞原中，在生長階段的髓細胞的密度顯著降低，而桿狀粒細胞、成熟的白細胞表現出沒有變化。表14噻氯匹定單獨或與銀杏提取物聯合治療16周對大鼠白細胞數的影響另一方面，當噻氯匹定與銀杏提取物聯合使用時，由于缺少惡性腫瘤，骨髓細胞密度類似于對照組。對于5∶4組，在密度方面有不顯著的降低。其它骨髓細胞在密度方面類似于對照組。實際上，與對照組相比，僅使用噻氯匹定的組表現出骨髓細胞的萎縮，空泡的增加以及密度的降低。白細胞原，髓細胞密度的降低被認為是在抑制作用中與嗜中性白細胞減少癥相關的改變。當噻氯匹定和銀杏提取物聯合使用時，沒有顯著的變化取決于比例。但是，對于5∶2組，骨髓密度和細胞組成類似于對照組。實驗11使用藥物組合物16周、停藥2周后骨髓細胞的組織學檢查為了測定由于噻氯匹定引起的骨髓中血細胞原的減少，持續16周給6周大的大鼠單獨使用噻氯匹定或以5∶1、5∶2和5∶4的比例與銀杏提取物聯合使用，然后停藥2周。隨后對骨髓細胞進行組織學檢查。另外，在使用噻氯匹定16周然后停藥2周的組中，由于缺少惡性腫瘤，骨髓細胞密度類似于對照組(參見表15和圖4)。表15噻氯匹定單獨或與銀杏提取物聯合使用16周停藥2周對大鼠白細胞數量的影響另外，當噻氯匹定聯合使用時，與噻氯匹定單獨使用相比，對于在白細胞原細胞中生長階段的髓細胞有確定的增加趨勢。因此，當噻氯匹定使用16周停藥2周時，如萎縮消失和髓細胞增加所示，有恢復的趨勢。另外，血細胞前體，股骨中巨核細胞幾乎增加到了對照組的水平。相反，當噻氯匹定和銀杏提取物以5∶2聯合使用然后停藥2周后，髓細胞僅有輕微的減少。實驗12CFU-C分析從白鼠的股骨分離髓細胞。然后，使用1.1比重的Percoll試劑，髓細胞中的單核細胞分離成3層，比重分別為1.090、1.075和1.063。用密度梯度離心法將細胞分別分離。特定地將髓細胞層裝入25ml離心試管，傾入20ml所述溶液，其中形成了3層。在4℃、2000rpm將試管離心30分鐘。然后，在其中間層得到髓細胞。用使用羊紅細胞的E-rosette制備方法除去T-淋巴細胞。得到的細胞用Hank平衡鹽溶液(HBSS)洗滌3次，分散在Iscove改進的Dubecco介質(IMDMGIBCO)上。在培養介質中，噻氯匹定對培養基(CFU-C)中集落形成單元的作用測試如下懸浮2×105髓細胞，在1mlIMDM中培養，IMDM含有0.3％瓊脂(DIFCO)、15％牛胎血清(GIBCO)、100U粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(CSF-CHUGAI)、0.02ml單獨使用的或與銀杏提取物聯合使用的噻氯匹定。在此，噻氯匹定的濃度為30ng／ml。另外，與30ng／ml噻氯匹定濃度相對照，以5∶1、5∶3、5∶4的比例聯合使用銀杏提取物，隨后在5％CO2、37℃和100％濕度條件下培養細胞10天。至此，用反轉顯微鏡對由50或更多細胞組成的集落的數量計數，計算相對于對照組的細胞抑制效果的百分比。同時，在將對照CFU-C表現出約50％抑制效果的30ng／ml噻氯匹定與銀杏提取物以5∶1、5∶2、5∶4的比例聯合使用的情況下，CFU-C的改變如圖5所示。當噻氯匹定和銀杏提取物以5∶1和5∶4的比例使用時，與單獨使用噻氯匹定相比沒有顯著變化。但是當噻氯匹定和銀杏提取物以5∶2的比例使用時，抑制效果顯著提高，并有類似于對照組的恢復趨勢。上述結果與體內實驗相符，改善了由于口服噻氯匹定16周導致的嗜中性白細胞和骨髓細胞數量的降低。此外，對于以5∶2的比例使用噻氯匹定和銀杏提取物，上述結果與恢復到類似于對照組的水平的實驗結果相符。實驗13關于髓細胞脂質過氧化的測定切割大鼠的股骨部分，除去周圍的肌肉組織以得到股骨。用1ml鹽水沖洗材料，使用的是3ml的注射器。然后，用試管收集灌注液，在3000rpm離心15分鐘。除去上層清液后，將沉淀的髓細胞分散到IMDM上，用細胞計數器測量細胞數量的方法稀釋到107細胞／ml。細胞分為3組，即，對照組、噻氯匹定組和噻氯匹定+銀杏提取物組(5∶2)。在對照組中，加入10mmol/L的H2O2、20ul的相同物質。在噻氯匹定治療組，加入10-5g/ml。在噻氯匹定+銀杏提取物聯合組，加入10-5g/ml噻氯匹定和4×10-6g/ml銀杏提取物。所有的組在37℃培養1小時。此后，用TBA方法測定髓細胞的脂質過氧化水平。特別地，用分光光度計測定與TBA樣品溶液反應得到的丙二醛(malondialdehyde)的量，結果如圖6所示。對照組的TBA測定為0.23±0.02，然而噻氯匹定(10-5g/ml)治療組的為0.30±0.02，差別明顯地表明了噻氯匹定導致的細胞破壞。雖然如此，當聯合使用銀杏提取物(4×10-6g／ml)時，結果為0.24±0.01，類似于對照組，與單獨使用噻氯匹定的結果相比有顯著的降低。因此，認為銀杏提取物通過抗氧化劑作用抑制了噻氯匹定導致的細胞破壞。從實驗6-13，將100重量份噻氯匹定(約300mg/kg/天)溶于飲用水并給6周大的大鼠服用16周。隨后，證實在血液和骨髓中存在嗜中性白細胞減少癥。另外，以相對比例20、40、80重量份的量聯合使用有抗氧劑作用的銀杏提取物，測量嗜中性白細胞減少癥的減輕。使用噻氯匹定16周后，測定包括骨髓細胞和白細胞原髓細胞的減少。使用16周噻氯匹定然后停藥2周后，上述抑制作用回到正常水平。此外，當聯合使用噻氯匹定的40％重量份的銀杏提取物時，骨髓細胞，即，嗜中性白細胞的減少回到類似于對照組的水平。但是，在噻氯匹定聯合20或80重量份銀杏提取物使用時，沒有顯著的抑制作用。同時，用在體內實驗中培養粒細胞原細胞測定對細胞生長的抑制效果時，噻氯匹定表現出通過劑量依賴的抑制效果的毒性。但是，在與銀杏提取物聯合使用的情況下，抑制作用降低。另外，毒性在體內實驗中由噻氯匹定導致的經在骨髓細胞中與過氧化物酶的氧化反應增加，但是與銀杏提取物聯合使用時毒性則降低。上述結果表明，噻氯匹定經對嗜中性原細胞的毒性導致了嗜中性白細胞減少癥，具有抗氧劑作用的銀杏提取物抑制了這種噻氯匹定導致的毒性。特別地，在體內實驗中，對照100重量份噻氯匹定使用40重量份銀杏提取物表現出最好的效果。總之，當噻氯匹定和銀杏提取物聯合使用時，與單獨使用噻氯匹定相比，具有有力的抗血栓形成和抗聚集作用，盡管在取決于劑量、持續時間和測試方法的結果上略有差異。因此，通過將銀杏提取物與噻氯匹定聯合使用，可期望降低噻氯匹定的劑量，并同時將噻氯匹定的副作用最小化。權利要求1．一種藥物組合物，含有噻氯匹定和銀杏提取物。2．根據權利要求1的含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物，其中對于100重量份噻氯匹定，所述的銀杏提取物含量為10-240重量份。3．根據權利要求1的含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物，其配制成片劑、泡騰劑、顆粒劑或膠囊劑形式的單位劑量。4．根據權利要求1的含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物，其中所述的單位劑量含有50mg-600mg的噻氯匹定和20mg-240mg的銀杏提取物。5．一種抗血栓形成的制劑，含有銀杏提取物和噻氯匹定作為活性組分。6．根據權利要求5的抗血栓形成的制劑，其中血栓形成導致的疾病包括腦局部缺血疾病、缺血性心臟疾病、慢性動脈閉塞和術后血栓栓塞事件，即，在血管或蛛網膜下出血手術后。7．根據權利要求5的抗血栓形成的制劑，其中所述的藥物組合物降低了噻氯匹定導致的嗜中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥的危險。全文摘要本發明涉及一種含有噻氯匹定和銀杏提取物的藥物組合物。具體而言,作為一種抗血栓形成的制劑,聯合使用含有所述噻氯匹定和銀杏提取物的具有PAF－拮抗劑和抗氧化劑作用的藥物組合物,用來自然地抑止由于單獨反復使用噻氯匹定而產生的毒性所導致的中性白細胞減少癥和粒細胞缺乏癥。文檔編號A61K36/16GK1283119SQ98812652公開日2001年2月7日申請日期1998年2月27日優先權日1997年12月23日發明者安炯洙,尹惠淑,金永植,李龍五,李京姬,姜勝安申請人:柳柳產業株式會社