專利名稱：可溶性ctla4突變型分子及應用的制作方法
貫穿本申請引用了多種出版物。這些公開了的完整出版物在此引入是為了更完整地描述本發明涉及領域的進展情況。發明背景T淋巴細胞與抗原提呈細胞(APCs)間的抗原非特異性相互作用可引起導致T細胞對抗原應答的T細胞共刺激信號的產生(Jenkins andJohnson(1993)Curr.Opin.Immunol.5361-367)。共刺激信號決定了T細胞對抗原應答的大小程度，以及該應管是否激活或滅活對抗原的后續應管(Mueller et al.(1989)Annu.Rev.Immunol.7445-480)。
缺乏共刺激信號的T細胞的活化導致抑制性或無反應性T細胞應答(Schwartz，R.H.(1992)Cell 711065-1068)。一種關鍵的共刺激信號是由T細胞表面受體CD 28和CTLA 4與APC上B7(也稱B7-1和B7-2，或CD 80和CD 86)相關分子之間的相互作用所提供(P.Linsley and J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11191-212)。
現在稱為CD 80(B7-1)的分子當初曾被描述是一種人類B細胞相關的活化抗原(Yokochi，T.et al.(1981)J.Immunol.128823-827；Freeman，G.J.et al.(1989)J.Immunol.1432714-2722)，后來鑒定是相關T細胞分子CD 28和CTLA 4的反受體(Linsley，P.，etal.(1990)PNAS USA 875031-5035；Linsley，P.S.et al.(1991 a)J.Exp.Med.173721-730；Linsley，P.S.et al.(1991 b)J.Exp.Med.174561-570)。
近來，APC上的另一種CTLA 4 Ig的反受體被確定(Azuma，N.etal.(1993)Nature 36676-79；Freeman(1993 a)Science 262909-911；Freeman，G.J.et al.(1993 b)J.Exp.Med.1782185-2192；Hathcock，K.L.S.，et al.(1994)J.Exp.Med.180631-640；Lenschow，D.J.et al.，(1993)PNAS USA 9011054-11058；Ravi-Wolf，Z.，et al(1993)PNAS USA 9011182-11186；Wu，Y.et al.(1993)J.Exp.Med.1781789-1793)。
這種分子現稱為CD 86(Caux，C.，et al.(1994)J.Exp.Med.1801841-1848)，也稱為B 7-0(Azuma et al.，1993，上文)或B 7-2(Freeman et al，1993 a，上文)，其在胞外區與CD 80約有25％序列相同(Azuma et al.，1993，上文，Freeman et al.，1993a，上文，1993b，上文)。CD 86轉染細胞可激發CD 28介導的T細胞應答(Azuma et al.，1993，上文；Freeman et al.，1993 a，1993 b，上文)。
CD 80和CD 86表達的比較一直是許多研究的主題(Azuma et al.1993，上文；Hathcock et al.，1994，上文；Larsen，C.P.，et al.(1994)J.Immunol.1525208-5219；Stack，R.M.，et al.，(1994)J.Immunol.1525723-5733)。現有資料表明CD 80和CD86表達的調節不同，并提示在免疫應答中CD 86的表達有助于促進CD 80的表達。
CD 28和CTLA 4的可溶形式已通過將CD 28和CTLA 4可變(v)樣胞外區與免疫球蛋白(Ig)恒定區融合生成CD 28 Ig和CTLA 4 Ig而構建成功。CTLA 4 Ig結合CD 80+和CD 86+細胞的能力明顯強于CD28 Ig(Linsley，P.et al.(1994)Immunity 1793-80)。CTLA 4 Ig在體內和體外可阻斷許多T細胞依賴的免疫應答(Linsley，et al.，(1991b)，上文；Linsley，P.S.et al.，(1992 a)Science 257792-795；Linsley，P.S.et al.，(1992 b)J.Exp.Med.1761595-1604；Lenschow，D.J.et al.(1992)，Science 257789-792；Tan，P.et al.，(1992)J.Exp.Med.177165-173；Turka，L.A.，(1992)PNAS USA8911102-11105)。
Peach等(J.Exp.Med.(1994)1802049-2058)鑒定出CTLA4胞外區中對強力結合CD 80分子十分重要的區域。具體而言，在互補決定區3(CDR 3)樣區中的六肽基元(MYPPPY)被證實在所有CD28和CTLA 4家族成員中是完全保守的。丙氨酸掃描誘變法使CTLA 4中基元和CD 28 Ig中選擇性殘基突變會降低或消除與CD 80結合的能力。
還構建了CTLA 4和CD 28同源區域互換的嵌合分子。HS 4分子，HS 4A和HS 4B分子是將CTLA 4中CDR 3樣區(其中包括含有一些非保守氨基酸殘基的C末端延伸部分)移植在CD 28 Ig上構建而成的。這些同源突變物表現出對CD 80結合力明顯高于CD 28。
另一組嵌合型同源突變物是將CTLA 4中CDR 1樣區移植至HS 4和HS 4-A中而獲得，CDR 1區在CD 28中是非保守的且推測其在空間位置上鄰近CDR 3樣區。這些嵌合型同源突變分子(稱為HS 7和HS8)表現出更為強大的與CD 80結合的能力。
嵌合型同源突變分子還可通過將CTLA 4中CDR 2樣區移植入HS 7和HS 8分子中而制備，但是這種結合物不能進一步增加對CD 80的親合力。因此認為CTLA 4和CD 28中的MYPPPY基元在結合CD 80中十分關鍵，不過在CTLA 4中的CDR 1和CDR 3樣區的某些非保守氨基酸殘基在增加CTLA 4與CD 80結合力方面也起作用。
已表明CTLA 4 Ig可有效地阻斷CD 80相關的T細胞共刺激作用但不能有效地阻斷CD 86相關的應答。具有比野生型CTLA 4更高的結合CD 86親和力的可溶性CTLA 4突變型分子已構建出來，與CTLA 4 Ig相比可能更好地阻斷抗原特異性活化細胞的激活。
應用定點誘變和新的篩選程序鑒定出CTLA 4分子胞外區中能優先促進結合CD 86親和力的幾個突變。與先前的可溶性CTLA 4相比，這些分子將為治療免疫抑制和癌癥提供更好的藥用組合物。發明概述本發明提供了可溶性CTLA 4突變型分子，與野生型CTLA 4相比結合CD 86抗原的親合力較高。
在本發明的一個實施方案中，CTLA 4突變型分子稱為LEA 29Y。LEA 29Y結合CD 86的親和力比野生型CTLA 4 Ig(下文指稱作CTLA4 Ig)高2倍多。這種強力結合導致LEA 29Y對免疫應答的阻斷效應較CTLA 4 Ig強達10倍多。
在本發明的另一個實施方案中，CTLA 4突變型分子稱為L 106E。L 106E結合CD 86的親和力也比野生型CTLA 4 Ig高。附圖簡述

圖1顯示LEA 29Y、L 106E及野生型CTLA 4 Ig與CD 86 Ig的平衡結合分析。LEA 29Y結合CD 86 Ig的能力明顯強于L 106E或CTLA4 Ig。得出的平衡結合常數(Kd)如表1所示。LEA 29Y Kd(2.6)低于L 106E Kd(3.4)或CTLA 4 Ig kd(5.2)，這表明LEA 29Y與CD86 Ig結合力更高。這三種分子具有類似的與CD 80 Ig結合的平衡常數。
圖2顯示FACS分析結果表明LEA 29Y和L 106E與穩定轉染人CD86的中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)的結合力明顯強于CTLA 4 Ig。每種蛋白與轉染人CD 80的CHO細胞的結合力相等。
圖3顯示體外作用分析表明LEA 29Y在抑制PMA(十四酰佛波乙酸脂)處理的CD86+人T細胞的增殖作用方面比CTLA 4 Ig強10多倍。對PMA處理的CD 80+人T細胞的增殖作用的抑制效應兩者更為接受。
圖4顯示在抑制異種刺激的人T細胞產生細胞因子IL-2，IL-4和K-干擾素的效應上，LEA 29Y比CTLA 4 Ig強10倍以上。
圖5顯示在抑制異種刺激的人T細胞產生細胞因子IL-2，IL-4和K-干擾素的效應上，LEA 29Y比CTLA 4 Ig強5～7倍。
圖6顯示在抑制PHA刺激的猴外周血單核細胞(PBMC′s)增殖的效應上LEA 29Y比CTLA 4 Ig強10倍以上。
圖7列出編碼可溶性CTLA 4分子的全部氨基酸序列。發明詳述本申請中所應用的如下詞和句具有特殊含意。
在此所用的“CTLA 4突變型分子”是至少包含CTLA 4分子胞外區或其某個能識別和結合CD 86的部分的一種分子。該分子突變后表現為對CD 86的結合力高于野生型CTLA 4。它可以在其中或外接上一種生物或化學活性的非CTLA 4分子。它可能是可溶的(即，循環性的)或結合在表面上的。
在此所用的“野生型CTLA 4”是天然存在的CTLA 4或Linsley等(1989)，上文描述的CTLA 4 Ig。
為了使在此描述的發明得到更全面的理解，進行以下說明。發明內容本發明提供了可溶性CTLA 4突變型分子，其結合CD 86的能力高于CTLA 4 Ig。具有比野生型CTLA 4結合CD 86更高能力的可溶性CTLA 4突變型分子應該比CTLA 4 Ig能更好地阻斷抗原特異性活化細胞的激活。
在本發明的一個實施方案中，可溶性CTLA 4突變型分子具有圖7所示的氨基酸序列。具體而言，第29位名為Xaa的氨基酸是選自丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。進一步第106位名為Yaa的氨基酸是選自谷氨酸和亮氨酸中。
在本發明的另一個實施方案中，可溶性CTLA 4突變型分子包含187個氨基酸，如SEQ ID NO 1所示始于第1位的丙氨酸止于187位的天冬酰胺。在這個方案中Xaa是酪氨酸，Yaa是谷氨酸(在此稱LEA29Y)。或者，Xaa是丙氨酸，Yaa是谷氨酸(在此稱L 106E)。
本發明進一步提供的可溶性CTLA 4突變型分子具有如圖7所示的與CTLA 4突變體胞外區相應的第一氨基酸序列，對應于能改變CTLA 4突變型分子溶解性及和CD 86結合的親和力、和/或效價的那部分的第二氨基酸序列。
按照本發明的實踐，該部分可能是免疫球蛋白恒定區或它的一部分。為了用于體內，最好是免疫球蛋白恒定區在受試者體內不引起有害的免疫反應。例如在臨床應用上含有人或猴免疫球蛋白恒定區的突變分子是優選的。一種適宜的免疫球蛋白區是人類Cγ1。其它同型物也可以。另外其它弱的或非免疫原性免疫球蛋白恒定區也可以。
本發明還提供了可溶性突變型CTLA 4 Ig融合蛋白，與野生型CTLA4相比可優先與CD 86抗原反應，該蛋白具有由如圖7所示的CTLA 4突變分子胞外區組成的第一氨基酸序列，由人類免疫球蛋白如Cγ1的絞鏈區、CH2區和CH3區組成的第二氨基酸序列。
本發明還提供了一種可溶性CTLA 4突變型受體蛋白，其氨基酸序列如圖7(SEQ ID NO1)所示，它可優先識別、結合CD 86，親和力至少是野生型CTLA 4的5倍。
另外，本發明提供了一種可溶性CTLA 4突變型分子，包括187個氨基酸，如SEQ ID NO1所示始于第1位的丙氨酸止于第187位天冬酰胺。
進一步講，本發明提供了一種可溶性CTLA 4突變型分子，其具有(a)膜糖蛋白如CD 28、CD 86、CD 80、CD 40和gp 39的第一氨基酸序列，其與第二氨基酸序列融合阻斷T細胞增殖；(b)如圖7所示的突變型CTLA 4胞外區片段的第二氨基酸序列，能阻斷T細胞增殖；(c)第三氨基酸序列，其作為一種識別標志或增加分子的溶解性。例如第三氨基酸序列可基本上由非免疫原性免疫球蛋白分子的絞鏈區、CH2區、CH3區的氨基酸殘基組成。適宜的免疫球蛋白分子的例子包括但不僅限于人或猴免疫球蛋白如Cγ1。其它同型也可以。
突變型CTLA 4(在此也稱為CTLA 4突變型分子)可通過加入第二種分子變得可溶。第二種分子的作用可能是增加CTLA 4的溶解性或者作為識別標志。適宜的第二種分子的例子包括但不僅限于p 97分子、env gp 120分子、E7分子和ova分子(Dash，B.et al.J.Gen.Virol.1994June，75(pt 6)1389-97；Ikeda，T.，et al.Gene，1994 Jan 28，138(1-2)193-6；Falk，K.，et al.Cell.Immunol.1993 150(2)447-52；Fujisaka，K.et al.Virology 1994 204(2)789-93)。也可使用其它分子(Gerard，C.et al.Neuroscience 1994 62(3)721；Byrn，R.et al.1989 63(10)4370；Smith，D.et al.Science 1987 2381704；Lasky，L.Science 1996 233209)。
本發明進一步提供了編碼本發明中的可溶性突變型CTLA 4分子氨基酸序列的核酸分子。在一個實施方案中，核酸分子為DNA(如cDNA)或其雜合體。或者核酸分子為RNA或其雜合體。
另外，本發明提供了一種含發明cDNA的質粒。還提供了一種宿主載體系統。該系統包含在適宜宿主細胞中構建的質粒。作為適宜宿主細胞的例子包括但不僅限于細菌細胞和真核細胞。
本發明進一步提供了產生蛋白質的方法，包括培養本發明的宿主載體系統以便在宿主內生成蛋白質，和回收所生成蛋白質。
另外，本發明提供了一種調節功能性CTLA 4和CD 28陽性T細胞與CD 86和/或CD 80陽性細胞間相互作用的方法，包括將CD 80和/或CD 86陽性細胞與本發明的可溶性CTLA 4突變型分子接觸以便形成CTLA 4/CD 80和/或CTLA 4/CD 86復合體，該復合體可干擾內源性CTLA 4抗原與CD 80和/或CD 86的反應。在本發明的一個實施方案中，可溶性CTLA 4突變型分子是一種至少包含一部分突變型CTLA 4胞外區的融合蛋白。在另一個實施方案中，可溶性CTLA 4突變型分子是CTLA 4 Ig融合蛋白，其第一氨基酸序列包括相當于CTLA 4胞外區氨基酸序列的大約第1位到第125位氨基酸殘基，其第二氨基酸序列包括相當于人免疫球蛋白γ如Cγ1的絞鏈區、CH2區、CH3區的氨基酸殘基，如SEQ ID NO 1所示。
按照本發明的實踐，將CD 86+細胞與可溶性CTLA 4突變型分子片斷或其衍生物接觸。另外，可溶性CTLA 4突變型分子是一種CD 28 Ig/CTLA 4 Ig融合蛋白雜合體，其第一氨基酸序列相當于CD 28受體胞外區的一部分，并融合到第二個相當于CTLA 4突變型受體胞外區一部分的氨基酸序列中(SEQ ID NO 1)，第三個氨基酸序列相當于人免疫球蛋白Cγ1的絞鏈區、CH2區和CH3區。
本發明進一步提供了一種治療由CD 28和/或CTLA 4陽性細胞與CD 86/CD 80陽性樹狀細胞相互作用所介導的免疫系統疾病的方法。在一個實施方案中，T細胞相互作用被抑制。
該方法包括給受試者施用本發明的可溶性CTLA 4突變型分子來調節T細胞與CD 80和/或CD 86陽性細胞間的相互作用。按照本發明的實踐，可溶性CTLA 4突變型分子可以是CTLA 4 Ig融合蛋白，或者是一種帶有與突變CTLA 4相連的膜糖蛋白的突變CTLA 4雜合體。
本發明還提供了抑制受試者體內移植物抗宿主疾病的方法，包括給受試者應用本發明的可溶性CTLA 4突變分子同時配合應用與IL-4反應的配體。
本發明包括突變型CTLA 4分子與其它免疫抑制劑的聯合應用，如環磷酰胺(Mathiesen，“異種移植的成蝕質細胞瘤細胞在環磷酰胺A處理大鼠中樞神經系統中的延長存活和血管化”Cancer Lett.，44(2)，151-6(1989))、強的松、硫唑嘌呤和氨甲喋呤(R.Handschumacher“Chapter 53免疫抑制藥物”Pages 1264-1276)。其它免疫抑制劑也可以。原核細胞中CTLA 4突變型分子的表達在某些意義上CTLA 4突變型分子在原核細胞中表達是優選的。
通常原核細胞主要代表是不同株的細菌，可以是革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的。一般優選的是革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。其它菌株也可以。
編碼CTLA 4突變型分子的序列可插入到原核細胞如大腸桿菌中表達外源性序列的載體當中。這些載體含有常用的原核細胞調控序列，在此指的是包括轉錄起始的啟動子、任選具有操縱子，以及核糖體結合位點序列；常用的啟動子有β-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(Chang et al，Nature 1981056(1977))、色氨酸(trp)啟動子系統(Goeddel et al.，Nucleic Acids Res.84057(1980))和λ噬菌體PL啟動子以及N-基因核糖體結合位點(Shimatake et al.，Nature 292128(1981))。
這些載體還含有復制起點和選擇性標志，如決定對抗生素抗性的β-內酰胺酶或新霉素磷酸轉移酶的基團，因此這些載體能在細菌中復制并且在氨芐青霉素或卡那霉素存在時，帶有質粒的細胞能被選擇出來。
可通過多種標準方法將表達質粒導入原核細胞中，包括但不僅限于CaCl2體克法(見Cohen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1972)692110，and Sambrook et al.(eds.)，分子克隆實驗室手冊，第二版，Cold SpringHarbor出版社，(1989))和電轉化法。真核細胞中CTLA 4突變型分子的表達按照本發明的實踐，真核細胞也是適宜的宿主細胞。
真核細胞的例子包括某些動物細胞(原代的或永生化的)、酵母菌(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))和植物細胞。用作宿主細胞的動物細胞例子有骨髓瘤、COS和CHO細胞，植物細胞例子包括煙草(整個植株或煙草愈傷組織)、玉米、大豆和水稻細胞。玉米、大豆和水稻的種子也可以。
編碼CTLA 4突變型分子的序列可插入到在真核細胞宿主中表達外源序列的載體中。不同的真核細胞宿主其載體的調控元件可能不同。
常用的真核細胞調控序列包括與哺乳類細胞相容的啟動子和控制序列，例如CMV啟動子(CDM 8載體)和鳥肉瘤病毒(ASV)啟動子(πLN載體)。其它常用的啟動子包括猴病毒40(SV 40)早、晚期啟動子(Fiers et al.，Nature 273113(1973))或其它病毒來源的啟動子，如多瘤病毒、腺病毒2和牛乳頭狀瘤病毒。一種誘導性啟動子如hMTII也可以使用(Karin，et al，Nature 299797-802(1982))。
真核細胞中表達CTLA 4突變型分子的載體也可攜帶稱作增強子區域的序列。這些增強子在優化基因的表達中起重要作用，可見于啟動子的上游或下游。
編碼CTLA 4突變型分子的序列能整合進入真核宿主細胞的基因組中并隨著宿主基因組的復制而復制。或者是帶有CTLA 4突變型分子的載體可能包含了允許染色體外復制的復制起點。
為了在釀酒酵母中表達所述序列，可采用內源酵母菌質粒2μ的復制起點。(Broach，Meth.Enz.101307(1983)。或者采用酵母菌基因組中能促進自主復制的序列。(見Stinehcomb et al.，Nature 28239(1979))；Tschemper et al.，Gene 10157(1980)；and Clarkeet al.，Meth.Enz.101300(1983))。
酵母菌載體轉錄調控序列包括糖酵解酶合成的啟動子(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7149(1968)；Holland et al.，Biochemistry174900(1978))。本領域中已知的其它啟動子包括由CDM 8載體提供的CMV啟動子(Toyama and Okayama，FEBS 268217-221(1990)、3-磷酸甘油酸激酶啟動子(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.2552073(1980))以及其它的糖酵解酶啟動子。
某些啟動子是誘導性的，因為它們可被環境刺激或細胞生長培基所調控。這些誘導性啟動子包括來自熱休克蛋白、醇脫氫酶2、同種細胞色素C、酸性磷酸酶、與氨代謝有關的酶和利用半乳糖和麥芽糖的酶的基因的啟動子。
調控序列也可能位于編碼序列的3′末端。這些序列可能起穩定mRNA的作用。在幾種酵母來源的或哺乳動物基因中緊接編碼序列的3′未翻譯區中可見到這些終止子。
植物和植物細胞載體的例子包括但不僅限于土壤桿菌(Agrobacterium)Ti質粒、花椰菜花葉病毒(CaMV)，蕃茄金黃色花葉病毒(TGMV)。
哺乳動物細胞宿主體系轉化的一般情況已由Axel描述過(U.S.Patent No.4,399,216，1983年8月16日授權)。哺乳動物細胞轉化方法包括但不僅限于磷酸鈣轉染法、微注射法、電轉化法、病毒載體轉導法。
外源性DNA序列導入植物和酵母菌基因組中的方法包括(1)機械法，如用微注射法將DNA注入單細胞或原生質體中；在DNA存在下將玻璃珠與細胞渦旋混合；或將DNA包被的金粒或鎢粒射入細胞或原生質體中，(2)用聚乙二醇處理或高壓電脈沖作用(電轉化)制備可通透大分子的原生質體而導入DNA，(3)利用與原生質體融合的脂質體(含cDNA)。CTLA 4突變型分子的鑒定和回收CTLA 4突變型分子的表達可用考馬斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE法和抗CTLA 4抗體免疫印跡法檢測。用標準的蛋白純化的方法如親和色譜法或離子交換色譜法可有效地回收蛋白，可得到基本純的產物(R.Scopes Protein Purification，Principles and Practice，ThirdEdition Springer-Verlag(1994))。基于CTLA 4 Ig密碼子的誘變在一個實施方案中，用定向誘變和新的篩選程序來鑒定CTLA 4分子胞外區的幾處突變，這些突變能增加CTLA 4分子與CD 86的結合力，而只略微改變與CD 80的結合。在此方案中，發生突變的殘基位于CDR1環中(25位絲氨酸～33位精氨酸)、C′鏈中(49位丙氨酸和51位蘇氨酸)、F鏈中(95位賴氨酸、97位谷氨酸和98位亮氨酸)以及CDR 3中99位蛋氨酸一直到104位酪氨酸，105位酪氨酸一直到109位甘氨酸和G鏈中114位谷氨酰胺、116位酪氨酸和118位異亮氨酸。這些位點是根據對嵌合型CD 28/CTLA 4融合蛋白研究結果選出的(J.Exp.Med，1994，1802049-2058)，并根據一種模型推測其氨基酸殘基側鏈暴露于溶劑中，并且在CD 28和CTLA 4之間某些位置不具氨基酸殘基同一性或同源性。并且任何與這些鑒定的殘基在空間上接近(5-20埃單位)的殘基被認為是本發明的內容。
采用二步法合成和篩選與CD 86結合的親和力改變了的可溶性CTLA 4突變型分子。實驗要求首先合成一個CTLA 4胞外區特定密碼子發生突變的文庫，然后通過BIAcore分析法篩選出來用于鑒定改變了與CD 86或CD 80反應性的突變。發明優點比野生型CTLA 4結合CD 86能力更高的可溶性CTLA 4突變型分子應該比CTLA 4 Ig能更好地阻斷抗原特異性活化細胞的激活。
另外，生產CTLA 4 Ig費用很高。高親合力的突變型CTLA 4 Ig有很強的免疫抑制活性，在臨床上用明顯低于CTLA 4 Ig用量的突變型CTLA 4 Ig分子就能獲得同等程度的免疫抑制效果。可溶性CTLA 4突變型分子如LEA 29Y成本上將是切實可行的。
以下實例用來詳解本發明并幫助本領域普通技術人員制備和應用。實例決不意味著限制本發明的范圍。實施例1常規體內、外研究表明CTLA 4 Ig本身不能完全阻斷抗原特異性活化T細胞的激活。體外研究CTLA 4 Ig和CD 80或CD 86特異性單克隆抗體對T細胞增殖的抑制作用表明抗CD 80單克隆抗體不能增強CTLA 4 Ig的抑制作用，而抗CD 86單克隆抗體則可以，這表明CTLA4 Ig在阻斷CD 86相互作用上不是那么有效。這些資料支持Linsley等的早期發現(Immunity，1994，1793-801)，即抑制CD 80介導的細胞應答所需CTLA 4 Ig的濃度低于抑制CD 86介導的應答所需的100倍左右。基于這些發現提出比野生型CTLA 4結合CD 86能力更高的可溶性CTLA 4突變型分子應該比CTLA 4 Ig能更好地阻斷抗原特異性活化細胞的激活。
為此目的，用定向誘變和新的篩選程序來鑒定CTLA 4分子胞外區的幾處突變，這些突變能增加CTLA 4分子與CD 86的結合力而只略微改變與CD 80的結合。突變的殘基位于CDR 1環中(25位絲氨酸～33位精氨酸)、C′鏈中(49位丙氨酸和51位蘇氨酸)、F鏈中(95位賴氨酸、97位谷氨酸和98位亮氨酸)以及CDR 3中99位蛋氨酸一直到104位酪氨酸，105位酪氨酸一直到109位甘氨酸和G鏈中114位谷氨酰胺、116位酪氨酸和118位異亮氨酸。這些位點是根據對嵌合型CD28/CTLA 4融合蛋白研究結果選出的(J.Exp.Med，1994，1802049-2058)，并根據一種模型推測其氨基酸殘基側鏈暴露于溶劑，并且在CD 28和CTLA 4之間某些位置不具氨基酸殘基同一性或同源性。方法基于CTLA 4 Ig密碼子的誘變設計誘變寡核苷酸PCR引物以使一特定密碼子位置1和位置2的某個堿基發生隨機突變，而位置3只能是鳥嘌呤或胸腺嘧啶(XXG/T)。照這樣，編碼一個氨基酸的特定密碼子可隨機突變成編碼20種氨基酸的任何一個密碼子。編碼突變的PCR產物十分接近CTLA 4 Ig的CDR 3樣環(MYPPPY)，用SacI/XbaI酶切，并且亞克隆進入同樣切割的CTLA 4 Ig IILN表達載體中。對于發生在十分靠近CTLA 4 Ig CDR 1樣環的突變，先通過PCR引物定點誘變法在該環5′端引入一個靜止的NheI限制性位點。用NheI/XbaI酶切PCR產物并亞克隆進入同樣切割的CTLA 4 Ig表達載體中。微量制備質粒cDNA培養96種轉化的細菌克隆，每一克隆代表一個特定位點的單一突變，用Biorobot 9600(Qiagen)自動制備出cDNA。COS細胞轉染用突變型CTLA 4 Ig瞬時轉染24孔培養板中培養的COS細胞，3天后收集培養基。BIAcore分析條件化的COS細胞培養基進入BIAcore中流過帶有CD 86 Ig或CD80 Ig的生物傳感器芯片，根據突變型分子比野生型CTLA 4 Ig流速慢來鑒定突變型CTLA 4 Ig。測定相應于選定培養基樣品的cDNA序列并制備出足夠量的DNA以進行大規模的COS細胞瞬時轉染，由此制備出突變型CTLA 4 Ig蛋白，緊接著對培養基中蛋白A的純化。
BIAcore分析條件和平衡結合數據分析按照J.Greene等所描述方法(1996)JBC 271(42)26762進行。BIAcore數據分析分析前使感應圖基線與0反應單位(RU)一致。由于溶液之間容積折射率不同，樣本流過模擬衍生流動細胞來決定本底RU值。平衡解離常數(Kd)是根據Req比C的曲線計算出Req是穩態反應減去模擬衍生芯片的反應，C是被分析物摩爾濃度。用商用非線性曲線擬合軟件(Prism Graph PAD軟件)分析結合曲線。
首先，實驗數據符合配體與受體一對一結合模式(單位點模式，即單一朗繆爾系統，
)，平衡結合常數(Kd＝[A].[B]\[AB])根據方程R＝Rmax.C/(Kd+C)計算出來。其次，實驗數據符合最簡單的配體結合的兩點模式(即一個受體有兩個無交叉作用非依賴性結合位點)，描述為方程R＝Rmax1.C\(Kd1+C)+Rmax2.C\(Kd2+C)。
通過對比實驗數據直觀分析和平方和的F檢驗來統計學分析這兩種模式的擬合優度。除非兩點模式適合度非常好(p＜0.1)，一般選擇簡單的單位點模式是最適合的。
用BIA 2.1軟件(Pharmacia)分析結合和解離作用。可用兩種方法計算結合率常數Kon，即均一單位點相互作用和平衡雙位點相互作用法。對于單位點相互作用，Kon值根據方程Rt＝Req(1-exp-ks(t-to))計算，Rt是給定時間t內的反應；Req是穩態反應；to是注入開始時間；ks＝dR/dt＝kon.Ckoff，其中C是待分析物濃度，ks是根據單位點結合計算的。對于雙位點相互作用，kon值根據方程Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-to))+Req2(1-expks2(t-to))計算。每種模式的Kon值取決于Ks比C曲線的斜率(最大結合約70％)。
根據單位點模式(AB＝A+B)或雙位點模式分析解離數據，根據最優合曲線計算出解離率常數(koff)。一般用單位點模式，除非偏差大于儀器本底(2-10RU，取決于儀器)時才用雙位點模式。用t1/2＝0.693/koff計算受體占據半衰期。流式細胞術鼠單克隆抗體L 307.4(抗-CD 80)購自Becton Dickinson(SanJose，加利福尼亞)，IT 2.2(抗-B7-0[CD 86])購自Pharmingen(San Diego，加利福尼亞州)。為了免疫染色，用含有10mM EDTA的磷酸緩沖液孵育CD 80和/或CD 86陽性的CHO細胞，將其從培養容器中移出。CHO細胞(1～10×105)先與單克隆抗體或免疫球蛋白融合蛋白在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中共育，然后洗滌，與異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠或羊抗人免疫球蛋白第二步試劑共育(Tago，Burlingame，加利福尼亞)。細胞最后洗一次后在FACScan上分析(Becton Dickinson)。
CTLA 4 Ig和突變分子結合恒定轉染的CD 80和CD 86陽性CHO細胞的FACS分析法操作如下(見圖2)。
CD 80和CD 86陽性的CHO細胞與濃度不斷增加的CD 28 Ig共育，洗滌后用異硫氰酸熒光素標記的羊抗人免疫球蛋白檢測結合的免疫球蛋白融合蛋白。同法檢測CTLA 4 Ig的結合。
圖2中LEA 29Y(圓圈，O)和L 106E(三角形，△)結合的CHO細胞(1.5×105)與一定濃度CTLA 4 Ig(方塊，■)23℃下，共育2小時后洗滌，再與異硫氰酸熒光素標記的羊抗人免疫球蛋白抗體共育。用FACScan分析共5000個活細胞的結合(單測定)，用PC-LYSYS數據直方圖確定其平均熒光強度(MFI)。背景熒光用只與第二步熒光標記抗體共育的細胞測定(MFI＝7)，并以此校正所測數據。對照L6單克隆抗體(80μg/ml)的MFI小于30。這代表著四個獨立的實驗。功能測定人CD 4陽性細胞如本文所述分離。
用免疫磁性負選擇法分離CD 4+T細胞(Linsley et al.，(1992)“CTLA 4和CD 28在活化T淋巴細胞上的共表達和功能協作”J.Exp.Med.1761595-1604)。
如圖3所示進行PMA和CD 80-或CD 86-的CHO細胞對T細胞刺激作用的抑制。為測定刺激作用，將PHA集落(Linslty et al.，(1991)“B細胞活化抗原B7對CD 28的結合共刺激T細胞增殖和IL-2mRNA積累”J.Exp.Med.173561-570)以4×104/孔與照射過的CHO細胞刺激物共培養，對照無照射過的CHO細胞。CD 4+T細胞(8-10×104/孔)在有或無照射過的CHO細胞刺激物存在下，加1nM PMA培養72小時，在最后7小時內加入1μCi/孔的3[H]-胸苷測定增殖反應。用酶免疫測定儀(Biosource，Camariuo，California)測條件培養基(刺激24小時后收集的)中IL-2的產量。
圖4和圖5顯示上述所制備的異種刺激人類T細胞的抑制作用，是用一種叫作PM的人類B細胞LCL系進行異種刺激。T細胞濃度為3×104/孔，PM濃度為8.0×103/孔。首次異種刺激6天后，在測同位素摻入7小時前用3H-胸苷處理細胞；再次異種刺激按下述方法進行。用LSM(Ficol)收集經首次異種刺激作用7天的T細胞，靜置24小時，然后用與首次相同劑量的PM再刺激，3天后用放射性標記物處理細胞，并按上法收集。為測定細胞因子產量(圖5)，建立了另一套同樣的再次異種刺激板，3天后，按制造商推薦的條件，用Biosource試劑盒測試。
圖6顯示猴混合淋巴細胞反應(MLR)。將來自兩只猴的PBMC′S用LSM提純，然后分別以3.5×104/孔與2μg/ml PHA混合，刺激3天后，收集前16小時用放射性標記物處理。
表I平衡結合常數CD 80 Ig(kd) DC 86 Ig(kd)CTLA 4 Ig 0.925″0.025 5.2″1.38L 106 E 0.84″0.04 3.4″0.35LEA 29 Y1.26″0.34 2.6″0.71BIAcoreTM分析所有實驗均在25℃溫度下在BIAcoreTM或BIAcoreTM2000生物傳感器上進行(Pharmacia Biotech AB，Uppsala)。用標準的N-乙基-N′-(二甲氨基丙基)碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺偶合物(Johnsson，B.，et al.(1991)Anal.Biochem.198268-277；Khilko，S.N.，et al.(1993)J.Biol.Chem 2685425-15434)將配體固定在研究級NCM 5號傳感器芯片上(Pharmacia)。
序列說明(1)一般資料(i)申請人Peach，Robert J.Namura，Joseph R.
Linsley，Peter S.Bajorath，Jurgen(ii)發明名稱可溶性CTLA 4突變型分子及應用(iii)序列號1(iv)通訊地址(A)聯系人Bristol-Myers Squibb Company(B)街道P.O.Box 4000(C)城市普林斯頓(D)州新澤西州(E)國美國(F)郵政代號08543-4000(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申請數據(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名Sorrentino，Joseph M.
(B)注冊號32，598(C)參考/文擋號ON 0152a(ix)電訊資料(A)電話(609)252-3953(B)電傳(609)252-4526(1)SEQ ID NO1信息(i)序列特征
(A)長度561堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設非(iv)反義非(vi)原始來源(A)有機體Homo Sapiens(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置1..561(xi)序列描述SEQ ID NO1GCA ATG CAC GTG GCC CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC AGC CGAGGC 48Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser ArgGly1 5 10 15ATC GCC AGC TTT GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC Xaa GCC ACTGAG 96Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Xaa Ala ThrGlu20 25 30GTC CGG GTG ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAAGTC 144Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr GluVal35 40 45TGT GCG GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GATGAT 192Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu AspAsp50 55 60TCC ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA GTG AAC CTC ACTATC 240Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu ThrIle65 70 7580CAA GGA CTG AGG GCC ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTGGAG 288Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys ValGlu85 90 95CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG Yaa ATA GGC AAC GGA ACCCAG 336Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Yaa Ile Gly Asn Gly ThrGln100 105 110ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC TTC CTCCTC 384Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe LeuLeu115 120 125TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG TTT TTT TAT AGC TTTCTC 432Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser PheLeu130 135 140CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CTA AAG AAA AGA AGC CCTCTT 480Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser ProLeu145 150 155160ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA ACA GAG CCA GAA TGTGAA 528Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu CysGlu165 170 175AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCC ATC AAT561Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn180 18權利要求
1.結合CD 86的可溶性CTLA 4突變型分子，該CTLA 4突變型分子的氨基酸序列如圖7所示，其中名為Xaa的第29位氨基酸選自丙氨酸和酪氨酸，名為Yaa的第106位氨基酸選自谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸。
2.權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子，包括如SEQ ID NO1所示的187個氨基酸，始于第1位的丙氨酸止于第187位的天冬酰胺。
3.權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子，其中Xaa是丙氨酸，Yaa是谷氨酸。
4.權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子，其中Xaa是酪氨酸，Yaa是谷氨酸。
5.一種可溶性CTLA 4突變型分子，其具有(a)相當于圖7所示的CTLA 4突變型的胞外區的第一氨基酸序列；(b)相當于改變CTLA 4突變型分子溶解性和與CD 86結合的親和力和/或效價那部分的第二氨基酸序列。
6.權利要求5的可溶性CTLA 4突變型分子，其中所述部分是免疫球蛋白恒定區。
7.可與CD 86抗原反應的可溶性突變型CTLA 4 Ig融合蛋白，該蛋白具有由圖7所示的CTLA 4突變型胞外區組成的第一氨基酸序列，和由人免疫球蛋白Cγ1中絞鏈區、CH2區和CH3區組成的第二氨基酸序列。
8.具有圖7所示氨基酸序列的可溶性CTLA 4突變受體蛋白，其可識別和結合CD 86抗原。
9.包括SEQ ID NO 1中第1位丙氨酸到187位天冬酰胺的187個氨基酸的可溶性CTLA 4突變型分子。
10.編碼相當于權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子的氨基酸序列的核酸分子。
11.權利要求10的cDNA。
12.包含權利要求11的cDNA的質粒。
13.在合適宿主細胞中包括權利要求12的質粒的宿主載體系統。
14.權利要求13的宿主載體系統，其中適宜的宿主細胞是細菌細胞。
15.權利要求13的宿主載體系統，其中適宜的宿主細胞是真核細胞。
16.生產蛋白質的方法，包括培養權利要求13的宿主載體系統以在宿主中產生蛋白質和回收生成的蛋白質。
17.調節功能性CTLA 4陽性T細胞與CD 80和CD 86陽性細胞間相互作用的方法，包括將CD 80和CD 86陽性細胞與權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子接觸，以形成CTLA 4/CD 80和/或CTLA 4/CD 86復合體，該復合體干擾內源性CTLA 4抗原與CD 80和CD 86之間的反應。
18.權利要求17的方法，其中可溶性CTLA 4突變型分子是一種融合蛋白，至少包含突變型CTLA 4胞外區的一部分。
19.權利要求17的方法，其中可溶性CTLA 4突變型分子是CTLA4 Ig融合蛋白，其第一氨基酸序列包括相當于CTLA 4胞外區的氨基酸序列中大約第1位到第125位氨基酸殘基，其第二氨基酸序列包括相當于SEQ ID NO 1所示人免疫球蛋白Cγ1絞鏈區、CH2區和CH3區的氨基酸殘基。
20.權利要求17的方法，其中CD 86陽性細胞和可溶性CTLA 4突變型分子片段或其衍生物接觸。
21.權利要求20的方法，其中CD 86陽性細胞是B細胞。
22.權利要求17的方法，其中CTLA 4陽性T細胞與CD 80和CD86陽性細胞間相互作用被抑制。
23.由T細胞與CD 80和CD 86陽性細胞相互作用介導的免疫系統疾病的治療方法，包括給受試者施用權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子來調節T細胞與CD 86陽性細胞間的相互作用。
24.權利要求23的方法，其中可溶性CTLA 4突變型分子是CTLA4 Ig融合蛋白。
25.權利要求23的方法，其中可溶性CTLA 4突變型分子是突變的CD 28 Ig/CTLA 4 Ig融合蛋白雜合體。
26.權利要求23的方法，其中所說的T細胞相互作用被抑制。
27.受試者體內移植物抗宿主疾病的抑制方法，包括給受試者施用權利要求1的可溶性CTLA 4突變型分子和與IL-4反應的配體。
全文摘要
本發明提供了可溶性CTLA4突變型分子,與野生型CTLA4相比結合CD86抗原的親合力較高。
文檔編號A61K38/00GK1244803SQ98802054
公開日2000年2月16日 申請日期1998年1月29日 優先權日1997年1月31日
發明者R·J·皮奇, J·R·內姆拉, P·S·林斯利, J·巴約拉思 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司