本(ben)發明屬于藥物制劑，涉及一(yi)種核酸-脂質納米顆粒凍干組合(he)物及其制備方(fang)法和應用(yong)。

背景技術：

1、mrna疫苗(miao)(miao)是將含(han)有編碼抗原蛋(dan)白基因序列的(de)(de)mrna（信使(shi)核(he)(he)糖核(he)(he)酸(suan)）通(tong)(tong)過特定的(de)(de)遞送系(xi)統導(dao)入機體細胞(bao)(bao)，通(tong)(tong)過在(zai)體內(nei)表達目的(de)(de)蛋(dan)白，刺激機體產生特異性(xing)(xing)免疫學反應，能(neng)實(shi)現體液與(yu)細胞(bao)(bao)的(de)(de)雙(shuang)重(zhong)免疫，有效性(xing)(xing)高(gao)。隨(sui)著moderna和(he)biontech公司的(de)(de)mrna疫苗(miao)(miao)在(zai)臨(lin)床上的(de)(de)安全(quan)性(xing)(xing)和(he)保護效力得到驗(yan)證，使(shi)得mrna疫苗(miao)(miao)技(ji)術得到廣泛關注。已上市的(de)(de)mrna-lnp（mrna-脂質納米顆粒）藥物載(zai)體組成為可(ke)電(dian)離(li)(li)陽離(li)(li)子(zi)脂質，中(zhong)性(xing)(xing)脂質，膽固(gu)醇及(ji)peg（聚乙二醇）修飾脂質。可(ke)電(dian)離(li)(li)陽離(li)(li)子(zi)脂類在(zai)酸(suan)性(xing)(xing)ph下帶(dai)正(zheng)電(dian)荷(he)與(yu)帶(dai)負電(dian)荷(he)的(de)(de)核(he)(he)酸(suan)靜電(dian)相互作用包載(zai)核(he)(he)酸(suan)，在(zai)生理(li)ph下變為中(zhong)性(xing)(xing)電(dian)荷(he)，與(yu)帶(dai)負電(dian)的(de)(de)核(he)(he)內(nei)體脂質融合，從而將核(he)(he)酸(suan)釋放到細胞(bao)(bao)質中(zhong)。

2、永(yong)久(jiu)(jiu)帶(dai)電(dian)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)是一系(xi)列兩親性化合(he)物，由一個(ge)(ge)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)頭(tou)基(ji)與一個(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)具(ju)有不同接頭(tou)的疏(shu)水脂(zhi)(zhi)肪酸尾基(ji)共軛組(zu)成。陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)頭(tou)基(ji)通(tong)常含有一個(ge)(ge)或(huo)多個(ge)(ge)突(tu)出的氨基(ji)，如季銨鹽、帶(dai)電(dian)荷的其他氨基(ji)、胍或(huo)雜環(huan)化合(he)物，使整個(ge)(ge)化合(he)物在生理ph下(xia)帶(dai)正(zheng)電(dian)荷。永(yong)久(jiu)(jiu)帶(dai)電(dian)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)頭(tou)基(ji)通(tong)過(guo)靜(jing)電(dian)吸附作用吸附核(he)酸，其兩親性結構(gou)有助于(yu)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體或(huo)脂(zhi)(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)粒的制備，用于(yu)治(zhi)療性基(ji)因傳遞。其中，永(yong)久(jiu)(jiu)帶(dai)電(dian)陽(yang)(yang)離(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)dotap（(2,3-二(er)油(you)酰(xian)基(ji)-丙基(ji))-三甲(jia)基(ji)氯化銨）的納(na)米(mi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體可以(yi)遞送編碼抗原的mrna，預防傳染性疾(ji)病(bing)，可形(xing)成聚合(he)物雜交納(na)米(mi)粒子(zi)遞送mrna分子(zi)來治(zhi)療癌(ai)癥及遺傳性疾(ji)病(bing)。

3、目前(qian)，已上市mrna-lnp疫(yi)苗均存(cun)在長期(qi)穩定(ding)性(xing)差，需(xu)要(yao)超(chao)低(di)溫存(cun)儲（-20℃或-70℃下保(bao)存(cun)）。疫(yi)苗的(de)運(yun)輸和存(cun)儲穩定(ding)性(xing)成為(wei)其應用(yong)的(de)主要(yao)問題(ti)。現急(ji)需(xu)開發具(ju)有長期(qi)穩定(ding)性(xing)良好且可在4℃低(di)溫及室溫能夠長期(qi)穩定(ding)，方便運(yun)輸的(de)制劑。

技術實現思路

1、針對現有技(ji)術的(de)不足，本發(fa)明的(de)目的(de)在(zai)于提供一(yi)種核酸-脂質納米顆粒凍干組合(he)物(wu)及其(qi)制(zhi)備方(fang)法和應用。

2、為達此目的，本(ben)發明采用以下技術(shu)方案：

3、一(yi)方(fang)面，本(ben)發明(ming)提供(gong)一(yi)種核(he)酸-脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)凍(dong)(dong)干組(zu)合物，所(suo)述(shu)核(he)酸-脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)凍(dong)(dong)干組(zu)合物包(bao)括(kuo)核(he)酸-脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)和凍(dong)(dong)干保護(hu)劑，所(suo)述(shu)核(he)酸-脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)包(bao)括(kuo)核(he)酸和脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)，所(suo)述(shu)脂(zhi)質(zhi)納(na)米(mi)顆(ke)粒(li)包(bao)括(kuo)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)質(zhi)、中性脂(zhi)質(zhi)、輔助脂(zhi)質(zhi)和聚(ju)合物共軛(e)脂(zhi)質(zhi)（也稱作(zuo)綴合脂(zhi)質(zhi)），所(suo)述(shu)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)質(zhi)包(bao)括(kuo)可電離(li)(li)(li)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)質(zhi)和永(yong)久帶電的(de)(de)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)脂(zhi)質(zhi)的(de)(de)組(zu)合。

4、在本(ben)發(fa)明中，通過使(shi)用可電(dian)離(li)陽離(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)和(he)(he)永(yong)久帶電(dian)的(de)陽離(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)組(zu)合(he)作為陽離(li)子(zi)(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)，配(pei)合(he)中性(xing)(xing)(xing)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)、輔助脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)（膽(dan)固醇）和(he)(he)聚(ju)合(he)物(wu)共軛(e)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)構(gou)成核(he)酸-脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)納米顆粒(li)，能夠使(shi)得凍干(gan)組(zu)合(he)物(wu)產品穩定性(xing)(xing)(xing)高，在4℃條件穩定存放3個月以上。并且其(qi)凍干(gan)前(qian)后的(de)顆粒(li)均一(yi)性(xing)(xing)(xing)良好、包封率和(he)(he)mrna完整性(xing)(xing)(xing)優(you)異、能充分保證凍干(gan)前(qian)后的(de)核(he)酸不被(bei)降解；水分低、復(fu)溶時間短，理(li)化性(xing)(xing)(xing)能優(you)異。

5、優選地，所述(shu)(shu)(shu)可(ke)電離(li)陽(yang)離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)、永(yong)久帶(dai)電的陽(yang)離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)、中性(xing)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)、輔助脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)以(yi)及聚(ju)(ju)合物(wu)共軛脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的摩(mo)爾(er)比(bi)(bi)為(wei)(5-65):(5-65):(5-15):(35-45):(1-5)，在所述(shu)(shu)(shu)摩(mo)爾(er)比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)內(nei)，所述(shu)(shu)(shu)可(ke)電離(li)陽(yang)離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的占比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)5-65可(ke)以(yi)為(wei)5、6、8、9、10、15、18、20、23、25、28、30、33、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、63或(huo)65等，所述(shu)(shu)(shu)永(yong)久帶(dai)電的陽(yang)離(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)占比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)5-65可(ke)以(yi)為(wei)5、6、8、9、10、15、18、20、23、25、28、30、33、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、63或(huo)65等，所述(shu)(shu)(shu)中性(xing)脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)占比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)5-15可(ke)以(yi)為(wei)5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或(huo)15等，所述(shu)(shu)(shu)輔助脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)占比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)35-45可(ke)以(yi)為(wei)35、36、37、38、39、30、41、42、43、44或(huo)45等，所述(shu)(shu)(shu)聚(ju)(ju)合物(wu)共軛脂(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的占比(bi)(bi)范(fan)(fan)圍(wei)1-5可(ke)以(yi)為(wei)1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或(huo)5等。

6、優(you)(you)選(xuan)地，所述電(dian)離(li)陽離(li)子脂質和永久帶(dai)電(dian)的陽離(li)子脂質的摩(mo)爾比(bi)為1:9～9:1，例(li)如1:9、1.5:8.5、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2或(huo)9:1等，優(you)(you)選(xuan)2:8～8:2，進(jin)一步(bu)優(you)(you)選(xuan)3:7～7:3，更進(jin)一步(bu)優(you)(you)選(xuan)5:5即1:1。

7、優選(xuan)地(di)，所述可電離陽離子脂質選(xuan)自yk-009、yk-401、yk305、alc0315、sm102、dlin-mc3-dma中的(de)一種(zhong)或(huo)至少兩(liang)種(zhong)的(de)組合，其中：

8、yk-009具有式(shi)(i-i)所(suo)示(shi)結構(gou)：

9、

10、yk-401具有(you)式(shi)(ii-i)所示結構：

11、

12、yk-305具有式(iv-i)所示結構：

13、

14、alc0315具有式(v-i)所示結構：

15、

16、sm102具有(you)式(vi-i)所示結(jie)構(gou)：

17、

18、dlin-mc3-dma具有式(shi)(vii)所示結構：

19、。

20、優選地(di)，所(suo)述永久(jiu)帶電陽離子(zi)脂(zhi)質選自(2,3-二(er)油(you)酰基(ji)(ji)-丙基(ji)(ji))-三(san)甲(jia)基(ji)(ji)氯(lv)化(hua)銨(an)（dotap）；(2,3-二(er)油(you)酰基(ji)(ji)-丙基(ji)(ji))-三(san)甲(jia)基(ji)(ji)銨(an)及其(qi)鹽；1,2-二(er)-o-十(shi)八(ba)烯(xi)基(ji)(ji)-3-三(san)甲(jia)基(ji)(ji)銨(an)丙烷(wan)（dotma）或(huo)雙十(shi)二(er)烷(wan)基(ji)(ji)二(er)甲(jia)基(ji)(ji)溴(xiu)化(hua)銨(an)（ddab）中的一種或(huo)至少兩(liang)種的組(zu)合。

21、優選地，所述中性脂(zhi)(zhi)(zhi)質選自(zi)以下物質中的一種或者多(duo)種：二棕櫚酰(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian)(jian)(dppc)、二硬(ying)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian)(jian)(dspc)、二油酰(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)乙醇胺（dope）或其(qi)混合物磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)；優選為二硬(ying)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)磷(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)(xian)膽(dan)堿(jian)(jian)(dspc)。

22、優選地，所(suo)述輔助(zhu)脂質選自(zi)膽固醇(chun)、維生素e、dc-膽固醇(chun)或其衍生物，優選自(zi)膽固醇(chun)。

23、優選地，所述聚合物共軛脂(zhi)質為(wei)聚乙二(er)醇（peg）修飾的脂(zhi)質。

24、優選(xuan)地，所述聚(ju)(ju)乙(yi)(yi)二(er)(er)醇修飾的(de)(de)脂質選(xuan)自二(er)(er)硬(ying)脂酰基(ji)(ji)(ji)磷脂酰乙(yi)(yi)醇胺聚(ju)(ju)乙(yi)(yi)二(er)(er)醇2000（dspe-peg2000）、二(er)(er)肉豆蔻(kou)酰甘油-3-甲氧(yang)基(ji)(ji)(ji)聚(ju)(ju)乙(yi)(yi)二(er)(er)醇2000（dmg-peg2000）或甲氧(yang)基(ji)(ji)(ji)聚(ju)(ju)乙(yi)(yi)二(er)(er)醇雙十四(si)烷(wan)基(ji)(ji)(ji)乙(yi)(yi)酰胺（alc-0159）中(zhong)的(de)(de)任意(yi)一種(zhong)或至少(shao)兩種(zhong)的(de)(de)組合。

25、優選(xuan)地(di)，所述凍干(gan)保護劑(ji)選(xuan)自(zi)蔗糖(tang)、海藻糖(tang)或甘(gan)露醇中(zhong)的(de)任(ren)意一種或至少(shao)兩種的(de)組合。

26、優選地，所述(shu)核(he)酸選自小(xiao)干(gan)擾rna、不對稱干(gan)擾rna、微rna、dicer-底物rna、小(xiao)發夾(jia)rna、mrna、長鏈非(fei)編碼rna、環狀rna、自擴增rna或(huo)5'-ppprna中的任意一種或(huo)至少(shao)兩種的組合。

27、在本發明中(zhong)使用(yong)的mrna的序列如seq?id?no.1所示。

28、優選(xuan)地，所(suo)述脂質納米顆粒與核(he)酸的質量(liang)比為10~30:1，例(li)如(ru)10:1、13:1、15:1、18:1、20:1、22:1、25:1、28:1或30:1。

29、另一(yi)方(fang)面，本(ben)發明提供一(yi)種如上所(suo)述核(he)酸-脂質納米顆粒(li)凍干組(zu)合物的(de)制(zhi)(zhi)備方(fang)法(fa)，所(suo)述制(zhi)(zhi)備方(fang)法(fa)包括以下步驟：

30、將凍(dong)干(gan)保(bao)護劑溶液(ye)與核酸-脂(zhi)質(zhi)納米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)溶液(ye)混合，得到待凍(dong)干(gan)混合液(ye)，進行冷(leng)凍(dong)干(gan)燥，得到所(suo)述核酸-脂(zhi)質(zhi)納米(mi)(mi)顆(ke)粒(li)凍(dong)干(gan)組合物。

31、優選地，所(suo)述(shu)凍(dong)干(gan)保(bao)護劑溶(rong)液中凍(dong)干(gan)保(bao)護劑的質(zhi)量百分含量為5%~20%，例如5%、6%、8%、10%、12%、15%、18%或20%。

32、優(you)選地，所述凍干保護劑溶(rong)液(ye)中溶(rong)劑為無(wu)酶水或(huo)ph值(zhi)5-9（例(li)如5、6、7、8或(huo)9）的tris緩(huan)沖(chong)液(ye)或(huo)dpbs緩(huan)沖(chong)液(ye)。

33、優選(xuan)地，所述核酸-脂質納米顆粒(li)溶液中核酸和脂質納米顆粒(li)的(de)質量百分(fen)比含量為0.1%~1%，例如0.1%、0.3%、0.5%、0.8%或1%。

34、優選地，所述核酸-脂質納米顆(ke)粒溶液(ye)(ye)中溶劑為ph值(zhi)5-9（例(li)如5、6、7、8或9）的tris緩沖液(ye)(ye)或dpbs緩沖液(ye)(ye)。

35、優(you)選地，將所述待凍干混合液灌(guan)裝至(zhi)2ml樣(yang)品瓶中，灌(guan)裝體積在0.5~1.5ml（例(li)如0.5ml、1.0ml或1.5ml），進(jin)行冷(leng)凍干燥。

36、在(zai)本發(fa)明中(zhong)，所(suo)述(shu)樣品(pin)瓶為西(xi)林(lin)瓶。

37、優選地，所(suo)述冷凍干燥(zao)(zao)包括以下(xia)步(bu)驟：預(yu)凍階(jie)段(duan)、升華干燥(zao)(zao)階(jie)段(duan)、解(jie)吸(xi)干燥(zao)(zao)階(jie)段(duan)。

38、優選地(di)，所述預凍階(jie)段采(cai)用液(ye)氮降溫。

39、優選地，所述液氮降(jiang)溫的(de)時間為30min~6h，例如30min、45min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h。

40、優選地，所述升華干燥(zao)階段(duan)(duan)的溫度為-40~0℃（例(li)如-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、-5℃或(huo)(huo)0℃），保(bao)持(chi)50~100h（例(li)如50h、55h、58h、60h、65h、70h、75h、80h、85h、90h、95h或(huo)(huo)100h），分2~4段(duan)(duan)（例(li)如2、3或(huo)(huo)4段(duan)(duan)）呈(cheng)梯度升溫，每(mei)段(duan)(duan)升溫5~20℃（例(li)如5℃、8℃、10℃、13℃、15℃、18℃或(huo)(huo)20℃），每(mei)段(duan)(duan)維持(chi)時間6~70h（例(li)如6h、8h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h或(huo)(huo)70h）。

41、進一步優選地，所述升(sheng)(sheng)華干(gan)燥階段的升(sheng)(sheng)溫(wen)過程(cheng)依次為：-40℃50h，-35℃12h，-15℃7h，0℃6h。

42、優選地(di)，所(suo)述解吸干燥階段(duan)的溫度為15~30℃（例如15℃、18℃、20℃、23℃、25℃、28℃或30℃），運(yun)行時間為2~5h（例如2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h或5h）。

43、優選(xuan)地，所述冷凍干燥過程中，保持真空壓(ya)力控(kong)制≤0.05mbar，例如可以將(jiang)真空壓(ya)力控(kong)制在0.05mbar、0.03mbar、0.01mbar、0.008mbar、0.005mbar、0.003mbar、0.001mbar等。

44、另(ling)一方面，本發明(ming)提供了(le)如上所述的核酸-脂質(zhi)納米顆粒凍干組(zu)合(he)物在(zai)制備核酸藥物中的用途(tu)。

45、另一方面，本發(fa)明提(ti)供了如(ru)上所述的(de)核酸(suan)-脂質納(na)米顆粒凍干組合物在(zai)制備用于治療有(you)需要哺乳動物的(de)疾(ji)病或病癥的(de)藥(yao)物中的(de)用途。

46、優(you)選(xuan)地，所述(shu)疾病(bing)或病(bing)癥選(xuan)自(zi)由以下組成(cheng)的組：感染性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)、增(zeng)生性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)、遺傳性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)、自(zi)體免疫性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)、神經退化性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)、心血管和腎血管疾病(bing)以及代謝性(xing)(xing)(xing)疾病(bing)。

47、優選地，所述疾病為(wei)癌(ai)癥。

48、優選地，所(suo)述疾病(bing)為糖尿病(bing)。

49、優選地，所(suo)述感染性(xing)疾(ji)病(bing)選自：由冠狀病(bing)毒(du)、流感病(bing)毒(du)或hiv病(bing)毒(du)引(yin)起的疾(ji)病(bing)、小兒肺炎、裂谷熱(re)、黃熱(re)病(bing)、狂犬病(bing)或多種疤疹。

50、相對于(yu)現有技(ji)術，本發明(ming)具有以下有益效果：

51、本(ben)發明的核酸-脂質納米顆粒凍(dong)干組合物(wu)產品穩定(ding)性(xing)高(gao)，在4℃條件穩定(ding)存(cun)放3個月以(yi)上(shang)。并且其(qi)凍(dong)干前(qian)后的顆粒均一性(xing)良好、包封率和(he)mrna完整(zheng)性(xing)優異、能(neng)充分保證(zheng)凍(dong)干前(qian)后的核酸不被降解；水(shui)分低、復溶時間短(duan)，理化(hua)性(xing)能(neng)優異。