本發明涉(she)(she)及生(sheng)物醫藥領域，具體的，本發明涉(she)(she)及提(ti)高細胞活性的方法。

背景技術：

皮(pi)(pi)(pi)膚可(ke)分(fen)表(biao)皮(pi)(pi)(pi)、真(zhen)皮(pi)(pi)(pi)及(ji)皮(pi)(pi)(pi)下組織(zhi)三(san)層，其中真(zhen)皮(pi)(pi)(pi)層是(shi)由細(xi)(xi)胞(bao)和(he)細(xi)(xi)胞(bao)外基(ji)質(zhi)(zhi)共同構(gou)成(cheng)，成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)是(shi)真(zhen)皮(pi)(pi)(pi)層的主(zhu)要(yao)細(xi)(xi)胞(bao)，其正(zheng)常的增(zeng)殖(zhi)、分(fen)化維(wei)系著(zhu)皮(pi)(pi)(pi)膚正(zheng)常的結(jie)構(gou)和(he)生理功(gong)能；細(xi)(xi)胞(bao)外基(ji)質(zhi)(zhi)是(shi)由細(xi)(xi)胞(bao)合(he)成(cheng)并分(fen)泌、圍繞(rao)細(xi)(xi)胞(bao)相互(hu)作(zuo)用(yong)的一類(lei)大(da)分(fen)子(zi)物質(zhi)(zhi)，主(zhu)要(yao)由四大(da)類(lei)分(fen)子(zi)組成(cheng)：膠(jiao)原、彈性(xing)蛋(dan)白、糖(tang)蛋(dan)白及(ji)蛋(dan)白多糖(tang)。膠(jiao)原纖(xian)維(wei)、網狀纖(xian)維(wei)和(he)彈性(xing)纖(xian)維(wei)通過(guo)(guo)一定(ding)方式相互(hu)作(zuo)用(yong)，交(jiao)織(zhi)成(cheng)網，埋于以透明質(zhi)(zhi)酸為(wei)主(zhu)要(yao)成(cheng)分(fen)形成(cheng)的凝膠(jiao)狀基(ji)質(zhi)(zhi)中。在皮(pi)(pi)(pi)膚創(chuang)傷愈(yu)合(he)的過(guo)(guo)程(cheng)中，成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)會大(da)量增(zeng)殖(zhi)并分(fen)泌膠(jiao)原等細(xi)(xi)胞(bao)外基(ji)質(zhi)(zhi)以及(ji)細(xi)(xi)胞(bao)因子(zi)成(cheng)分(fen)，進一步復合(he)血管結(jie)構(gou)形成(cheng)類(lei)似真(zhen)皮(pi)(pi)(pi)層的組織(zhi)。因此在皮(pi)(pi)(pi)膚創(chuang)傷愈(yu)合(he)的過(guo)(guo)程(cheng)中，成(cheng)纖(xian)維(wei)細(xi)(xi)胞(bao)的活化將對創(chuang)面(mian)修復起到重要(yao)的調控(kong)作(zuo)用(yong)。

皮(pi)膚作為(wei)人(ren)體的(de)(de)(de)最大器(qi)官(guan)，具有屏(ping)障、保護、調(diao)節(jie)體溫(wen)和感覺的(de)(de)(de)功能(neng)。由于炎癥、潰瘍、燙傷(shang)(shang)、燒(shao)傷(shang)(shang)等因素造(zao)成的(de)(de)(de)皮(pi)膚缺(que)損(sun)，嚴重的(de)(de)(de)可(ke)危及生命(ming)。目前臨(lin)床通常采用自體皮(pi)瓣或皮(pi)膚移(yi)植的(de)(de)(de)方法治療缺(que)損(sun)創(chuang)(chuang)面，但面臨(lin)供皮(pi)區新(xin)的(de)(de)(de)創(chuang)(chuang)傷(shang)(shang)缺(que)陷以及供皮(pi)區來源不足等問(wen)題；此外移(yi)植物與移(yi)植部位(wei)臨(lin)近的(de)(de)(de)皮(pi)膚也存在顏色(se)、質地(di)、功能(neng)上的(de)(de)(de)差異。因此，如何有效開(kai)展皮(pi)膚損(sun)傷(shang)(shang)創(chuang)(chuang)面的(de)(de)(de)修復仍是人(ren)們不斷探求(qiu)和解決的(de)(de)(de)問(wen)題。

技術實現要素：

本發(fa)明旨(zhi)在(zai)至(zhi)少在(zai)一(yi)定程度上解決(jue)相(xiang)關技(ji)(ji)術中(zhong)的(de)技(ji)(ji)術問題(ti)之一(yi)。為此，本發(fa)明提(ti)(ti)出(chu)了一(yi)種可以用于(yu)創傷修復的(de)提(ti)(ti)高細胞活性(xing)的(de)方(fang)法(fa)，該方(fang)法(fa)具(ju)有免(mian)疫原性(xing)低、見效快、自然性(xing)、效果持久、風險低的(de)優勢。

在本發明的(de)(de)(de)第(di)一方(fang)面，本發明提出了(le)(le)一種提高(gao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)。根(gen)(gen)據本發明的(de)(de)(de)實施(shi)例(li)，該方(fang)法(fa)包(bao)括：將目(mu)標細(xi)(xi)(xi)胞(bao)與間充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)以(yi)及填(tian)(tian)充(chong)(chong)劑(ji)進行接觸，其(qi)中，所述填(tian)(tian)充(chong)(chong)劑(ji)包(bao)括選自(zi)膠原蛋(dan)白(bai)、透明質(zhi)酸、鈣(gai)羥基磷灰石(微(wei)晶瓷)、聚乳酸和富(fu)血小板血漿的(de)(de)(de)至少之一。利用根(gen)(gen)據本發明實施(shi)例(li)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)提高(gao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)，如成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)、創傷修復，相比于現有(you)(you)技術(shu)，克服了(le)(le)自(zi)體(ti)皮膚移植見效(xiao)慢、效(xiao)果不穩(wen)定的(de)(de)(de)缺陷。此外(wai)，根(gen)(gen)據本發明實施(shi)例(li)的(de)(de)(de)提高(gao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)，填(tian)(tian)充(chong)(chong)劑(ji)與間充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)聯合(he)使(shi)用，填(tian)(tian)充(chong)(chong)劑(ji)可以(yi)將間充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)維持(chi)在一定的(de)(de)(de)空間和體(ti)積范圍內，不僅(jin)可以(yi)起到保(bao)護和潤滑細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)作用，還(huan)能夠提高(gao)該范圍內有(you)(you)效(xiao)因子的(de)(de)(de)作用濃(nong)度，更高(gao)效(xiao)的(de)(de)(de)促進目(mu)標細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)增加。根(gen)(gen)據本發明實施(shi)例(li)的(de)(de)(de)提高(gao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)具有(you)(you)免(mian)疫原性(xing)低、見效(xiao)快、自(zi)然性(xing)、效(xiao)果持(chi)久(jiu)、風險低的(de)(de)(de)優(you)勢。

根(gen)據本發明的實施例，上述(shu)方法還可以進(jin)一(yi)步包括如下附加技術特征至少(shao)之(zhi)一(yi)：

根據本發(fa)(fa)明的(de)(de)實(shi)施例，所(suo)述間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)為臍帶(dai)(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。臍帶(dai)(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)來源廣(guang)泛，免疫原(yuan)性更低，用(yong)藥更加安全(quan)，且臍帶(dai)(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)自身能夠分(fen)泌膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)白并進(jin)一(yi)步分(fen)泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在內的(de)(de)因(yin)子，刺激真(zhen)皮(pi)(pi)層(ceng)中成(cheng)纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)存活與增(zeng)殖并進(jin)一(yi)步分(fen)泌膠(jiao)原(yuan)蛋(dan)白、透明質(zhi)(zhi)(zhi)酸和(he)彈性纖維(wei)。此外，臍帶(dai)(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)還可以(yi)進(jin)一(yi)步以(yi)旁(pang)分(fen)泌方(fang)式(shi)產生(sheng)多(duo)種血(xue)管生(sheng)成(cheng)因(yin)子，促進(jin)形成(cheng)新(xin)的(de)(de)毛細(xi)(xi)(xi)血(xue)管網；不僅(jin)如此，臍帶(dai)(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)在一(yi)定條件下也(ye)可轉化為內皮(pi)(pi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)參與微血(xue)管的(de)(de)形成(cheng)，起到(dao)營養真(zhen)皮(pi)(pi)及皮(pi)(pi)下相(xiang)關(guan)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)作用(yong)，本發(fa)(fa)明實(shi)施例的(de)(de)方(fang)法用(yong)于提高細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活性更加持久、有效(xiao)。

根據本發明的實施例，所述間(jian)充質(zhi)干細(xi)胞(bao)為P1～P6代間(jian)充質(zhi)干細(xi)胞(bao)。發明人通(tong)過實驗(yan)發現，大于P6代的間(jian)充質(zhi)干細(xi)胞(bao)細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態不(bu)如早代次的細(xi)胞(bao)、分泌的細(xi)胞(bao)因子(zi)量(liang)也有所減少，P1～P6代間(jian)充質(zhi)干細(xi)胞(bao)本身(shen)狀(zhuang)態良好、細(xi)胞(bao)活(huo)性和因子(zi)分泌較強，用于提高細(xi)胞(bao)活(huo)性效果(guo)更佳。

根據本發(fa)明的(de)實施(shi)例(li)，所(suo)述(shu)間(jian)充(chong)質干細(xi)(xi)胞(bao)以懸(xuan)浮于(yu)培養基、懸(xuan)浮于(yu)生理(li)鹽(yan)水(shui)或貼壁培養于(yu)培養基中(zhong)的(de)形(xing)(xing)式(shi)提供的(de)。根據本發(fa)明的(de)實施(shi)例(li)，所(suo)述(shu)間(jian)充(chong)質干細(xi)(xi)胞(bao)以上述(shu)三種形(xing)(xing)式(shi)的(de)其中(zhong)一種提供，可保(bao)持間(jian)充(chong)干細(xi)(xi)胞(bao)的(de)良好細(xi)(xi)胞(bao)狀態。

根據本發明的實施例，所述間充質干細胞以懸浮于培養基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質干細胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml。發明人通過實驗發現，間充質干細胞在培養基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml，可(ke)進一步保證間充質干細胞的(de)良好狀態并提(ti)供合(he)適大(da)小(xiao)的(de)體(ti)積比，進而使得本發(fa)明實施例(li)的(de)方法(fa)用于提(ti)高細胞活(huo)性(xing)的(de)效(xiao)果更佳。

根據本發明的實施例，所述培養基或所述生理鹽水與所述填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發明人發現，間充質干細胞在培養基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml，培養基(ji)或生理鹽(yan)水與(yu)填充劑的體(ti)積比為1:0.5～1:5，使得本發明實施例的用于提高細胞活性的方(fang)法的效(xiao)果更佳(jia)。

根據本發明的實施例，所述間充質干細胞以貼壁培養于培養基中的形式提供，所述間充質干細胞的貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個/cm²。發明人通過實驗發現，間充質干細胞貼壁培養于培養基中，貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個/cm²，可進一步保證間充質干細胞(bao)的良好狀態，進而使得本發明實施例的方法用(yong)于提高(gao)細胞(bao)活性的效(xiao)果更佳。

根據(ju)本發明(ming)的(de)實施例，所(suo)述(shu)培養基與所(suo)述(shu)填充劑的(de)體積比為1:0.5～1:5。發明(ming)人發現，培養基與填充劑的(de)體積比在(zai)1:0.5～1:5范圍內，所(suo)述(shu)方(fang)法(fa)在(zai)提高(gao)細胞的(de)活性上(shang)效果更(geng)加顯(xian)著。

根據本發(fa)明(ming)的(de)實施例，所述(shu)目標(biao)(biao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)、所述(shu)間充(chong)質干細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數比為1：0.1～1：10。發(fa)明(ming)人發(fa)現，目標(biao)(biao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)、間充(chong)質干細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數比在1:0.1～1：10范圍(wei)內，對提高目標(biao)(biao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)活性更加快速、有效。

附圖說明

圖1是根據本發明實施例(li)的臍帶間充質干細胞的形(xing)態圖；以及

圖2是根據本發明實(shi)施例的通過流式(shi)細胞檢測鑒定所選擇的臍帶間(jian)充質干細胞的表面標志(zhi)物的結果圖。

具體實施方式

下(xia)面詳細描述本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)實(shi)施例(li)。下(xia)面描述的(de)(de)(de)實(shi)施例(li)是示(shi)例(li)性的(de)(de)(de)，僅用(yong)于解釋本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)，而不能理解為(wei)對本(ben)發(fa)(fa)(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)限(xian)制。

提高細胞活性的方法

在本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)第一(yi)(yi)方(fang)(fang)面(mian)，本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)提出了(le)一(yi)(yi)種提高(gao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)。根據(ju)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實(shi)施例(li)(li)(li)，該(gai)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)包(bao)括：將(jiang)目(mu)標細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)與(yu)(yu)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)以(yi)(yi)及(ji)填充(chong)(chong)(chong)劑進(jin)行接觸，其(qi)中(zhong)，所述(shu)填充(chong)(chong)(chong)劑包(bao)括選自(zi)(zi)膠原(yuan)蛋白、透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)、鈣(gai)羥基磷(lin)灰(hui)石(shi)(微晶瓷)、聚乳酸(suan)和(he)(he)富血(xue)小板(ban)血(xue)漿的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)至少之(zhi)(zhi)一(yi)(yi)。利用(yong)根據(ju)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)實(shi)施例(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)提高(gao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)，以(yi)(yi)用(yong)來創(chuang)傷修復(fu)(fu)，相(xiang)比于(yu)現(xian)有(you)(you)技術(shu)，克服了(le)自(zi)(zi)體(ti)成(cheng)纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)移植見(jian)效慢、效果(guo)不(bu)(bu)穩(wen)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺陷。根據(ju)本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)實(shi)施例(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)采用(yong)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)，免(mian)疫原(yuan)性(xing)低。填充(chong)(chong)(chong)劑，以(yi)(yi)透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)為例(li)(li)(li)，具(ju)有(you)(you)吸水(shui)性(xing)、高(gao)負(fu)電(dian)荷性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、生(sheng)(sheng)物相(xiang)容性(xing)及(ji)在創(chuang)傷愈合(he)(he)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)物活(huo)性(xing)等(deng)，逐漸應用(yong)于(yu)創(chuang)面(mian)敷(fu)料和(he)(he)組織工程等(deng)皮膚(fu)創(chuang)傷治療領(ling)域。透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)參(can)與(yu)(yu)皮膚(fu)創(chuang)傷愈合(he)(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)炎(yan)癥、增(zeng)殖(zhi)和(he)(he)重建期(qi)。其(qi)中(zhong)在增(zeng)殖(zhi)期(qi)，短鏈透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)(含6～20個單糖)可(ke)促進(jin)成(cheng)纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)遷(qian)移至創(chuang)傷組織，成(cheng)纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)產生(sheng)(sheng)膠原(yuan)和(he)(he)糖胺(an)聚糖(GAG)，構建新的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)外基質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(ECM)；此外，透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)還可(ke)促進(jin)血(xue)管(guan)生(sheng)(sheng)成(cheng)和(he)(he)角質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)形(xing)成(cheng)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)殖(zhi)和(he)(he)遷(qian)移，進(jin)一(yi)(yi)步促進(jin)皮膚(fu)創(chuang)傷的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)愈合(he)(he)。間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)包(bao)括膠原(yuan)蛋白、透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)、鈣(gai)羥基磷(lin)灰(hui)石(shi)(微晶瓷)、聚乳酸(suan)和(he)(he)富血(xue)小板(ban)血(xue)漿的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)至少之(zhi)(zhi)一(yi)(yi)復(fu)(fu)合(he)(he)使用(yong)，可(ke)修復(fu)(fu)創(chuang)傷，不(bu)(bu)破壞(huai)皮膚(fu)原(yuan)本(ben)(ben)結構。利用(yong)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)分泌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)長因子激活(huo)自(zi)(zi)體(ti)成(cheng)纖(xian)維細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能，并進(jin)一(yi)(yi)步增(zeng)加(jia)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)數量，達到(dao)修復(fu)(fu)皮膚(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功效狀態，具(ju)有(you)(you)自(zi)(zi)然性(xing)。最后，該(gai)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)規(gui)避了(le)手術(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)失敗風險(xian)，是一(yi)(yi)種非常安全的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)。另外，發(fa)明(ming)(ming)人發(fa)現(xian)，本(ben)(ben)發(fa)明(ming)(ming)公開(kai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)提高(gao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)(fa)(fa)(fa)具(ju)有(you)(you)明(ming)(ming)顯優(you)于(yu)二者(zhe)單獨(du)使用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)優(you)勢(shi)——填充(chong)(chong)(chong)劑可(ke)以(yi)(yi)將(jiang)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)維持在一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)空間(jian)和(he)(he)體(ti)積范(fan)(fan)圍內(nei)，不(bu)(bu)僅可(ke)以(yi)(yi)起(qi)到(dao)保護和(he)(he)潤(run)滑(hua)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)，還能夠(gou)提高(gao)該(gai)范(fan)(fan)圍內(nei)有(you)(you)效因子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)濃(nong)度(du)，更高(gao)效的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)促進(jin)目(mu)標細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)。以(yi)(yi)透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)為例(li)(li)(li)，其(qi)與(yu)(yu)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聯合(he)(he)使用(yong)除(chu)了(le)有(you)(you)上述(shu)優(you)勢(shi)之(zhi)(zhi)外，透(tou)(tou)明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酸(suan)還可(ke)以(yi)(yi)起(qi)到(dao)保持間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)水(shui)分，保護間(jian)充(chong)(chong)(chong)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)(gan)(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(bao)不(bu)(bu)受病原(yuan)菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)侵害等(deng)作用(yong)。

根據本(ben)發明的另一具體實施例，所述間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞為臍(qi)(qi)帶(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞。臍(qi)(qi)帶(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞來源(yuan)廣(guang)泛(fan)，它可采(cai)用從(cong)(cong)醫療(liao)廢棄物(wu)——臍(qi)(qi)帶(dai)中分離間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞，不(bu)需要從(cong)(cong)患(huan)者身上取材，免(mian)去(qu)患(huan)者手(shou)術的風險和(he)痛苦，且臍(qi)(qi)帶(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞免(mian)疫原性更低，更加安全，臍(qi)(qi)帶(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞可進一步(bu)(bu)分泌包括SCF、bFGF、VEGF、IGF等(deng)在內的因子，刺激真皮(pi)層中成纖維細胞存活與增殖并進一步(bu)(bu)分泌膠原蛋(dan)白、透明質酸和(he)彈性纖維，不(bu)僅如此臍(qi)(qi)帶(dai)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細胞還可以(yi)進一步(bu)(bu)促進血管化的發生，進一步(bu)(bu)起(qi)到營養真皮(pi)及(ji)皮(pi)下相關細胞的作用，藥(yao)效更加有力(li)。

根據(ju)本發明的具(ju)體示(shi)例，所述間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細胞(bao)為P1～P6代(dai)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細胞(bao)。發明人通過實驗發現，P6代(dai)以上的間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細胞(bao)的細胞(bao)狀態不(bu)如早(zao)代(dai)次的細胞(bao)、分泌的細胞(bao)因子量也有所減少，P1～P6代(dai)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干(gan)(gan)細胞(bao)的細胞(bao)狀態佳，細胞(bao)活性(xing)和因子分泌能(neng)力(li)較強(qiang)，用于(yu)提高細胞(bao)的活性(xing)的效果更(geng)加(jia)顯著。

根據本發明的(de)具體示例(li)，所(suo)述間(jian)充質干(gan)(gan)細(xi)胞以懸(xuan)浮(fu)于培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)、懸(xuan)浮(fu)于生(sheng)理(li)(li)鹽水(shui)或貼(tie)壁培(pei)(pei)養(yang)(yang)于培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中(zhong)的(de)形式(shi)提(ti)供(gong)的(de)。發明人通過實(shi)驗(yan)意外(wai)地發現(xian)，間(jian)充質干(gan)(gan)細(xi)胞以懸(xuan)浮(fu)于培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)、懸(xuan)浮(fu)于生(sheng)理(li)(li)鹽水(shui)或貼(tie)壁培(pei)(pei)養(yang)(yang)于培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中(zhong)的(de)形式(shi)提(ti)供(gong)，可保證間(jian)充質干(gan)(gan)細(xi)胞良(liang)好的(de)狀(zhuang)態。

根據本發明的具體實施例，所述間充質干細胞以懸浮于培養基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質干細胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml。有利(li)于(yu)保持間充質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)的(de)活(huo)性(xing)，有利(li)于(yu)保持間充質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)較高(gao)的(de)分泌(mi)生長(chang)因子(zi)以及膠原蛋白，進(jin)而(er)使得(de)本發明實施例的(de)方法用(yong)于(yu)提(ti)高(gao)細(xi)(xi)胞(bao)活(huo)性(xing)的(de)效果更(geng)加顯著。

根據本發明的實施例，所述培養基或所述生理鹽水與所述填充劑的體積比為1:0.5～1:5。發明人發現，間充質干細胞的在培養基或生理鹽水中的懸浮密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml，培(pei)養(yang)基(ji)或(huo)生(sheng)理鹽(yan)水與(yu)填充(chong)(chong)(chong)劑的(de)(de)體積(ji)比為1:0.5～1:5，既(ji)可以保(bao)證間充(chong)(chong)(chong)質干細胞(bao)良好的(de)(de)細胞(bao)狀態，又可以保(bao)證填充(chong)(chong)(chong)劑有力的(de)(de)正向生(sheng)理效應。培(pei)養(yang)基(ji)或(huo)生(sheng)理鹽(yan)水與(yu)填充(chong)(chong)(chong)劑的(de)(de)體積(ji)比為1:0.5～1:5，使得本發明(ming)實施例的(de)(de)用于提高(gao)細胞(bao)活性的(de)(de)方法的(de)(de)效果更佳。

根據本發明的一些具體實施例，所述間充質干細胞以貼壁培養于培養基中的形式提供，所述間充質干細胞在所述培養基中的密度為1*10⁴～3*10⁴個/cm²。發明人發現，細胞生長有密度依賴效應，過密或者過稀都會影響細胞狀態，密度小于1*10⁴個/cm²時，細胞狀態差；高于3*10⁴個/cm²時，細胞沒有足夠的空間生長，培養基的過度消耗，細胞狀態差。根據本發明的具體實施例，間充質干細胞貼壁培養于培養基中，其貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個/cm²，有利(li)于(yu)保(bao)持(chi)間(jian)充(chong)質干細胞(bao)的(de)活性，有利(li)于(yu)保(bao)持(chi)間(jian)充(chong)質干細胞(bao)較高的(de)分泌生長因子以及膠原蛋白，進而(er)使得本發(fa)明(ming)實施例的(de)方法用于(yu)提高細胞(bao)活性的(de)效果(guo)更加顯著。

根據(ju)本發(fa)明的一些具體實施例，所述培養基(ji)與所述填充(chong)劑的體積比(bi)為1:0.5～1:5。發(fa)明人發(fa)現，培養基(ji)與填充(chong)劑的體積比(bi)在1:0.5～1:5范(fan)圍內(nei)，所述方法在提(ti)高細胞的活(huo)性上效果更加顯著。

根據本發(fa)明的(de)實施(shi)例，所述目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、所述間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數(shu)比為(wei)1:0.1～1:10。發(fa)明人發(fa)現(xian)，目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數(shu)比高于(yu)1:0.1，間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)數(shu)量(liang)(liang)相(xiang)對較少，其分(fen)泌的(de)因(yin)子量(liang)(liang)低，不足以促進大量(liang)(liang)的(de)目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性的(de)增加(jia)；目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數(shu)比低于(yu)1:10，目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)數(shu)量(liang)(liang)過少，造成間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)泌因(yin)子的(de)飽和(he)(he)，在一定程度上造成一定的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)和(he)(he)因(yin)子的(de)浪費。目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)、所述間(jian)充質(zhi)(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)個數(shu)比為(wei)1:0.1～1:10內，對提高目(mu)標(biao)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)活性更加(jia)快速、有效(xiao)。

藥物組合物

在(zai)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)另一(yi)(yi)方(fang)面(mian)，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)提(ti)出了(le)一(yi)(yi)種藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，該藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)用(yong)(yong)(yong)(yong)于提(ti)高細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)性(xing)，為(wei)用(yong)(yong)(yong)(yong)于創(chuang)傷修(xiu)復(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)新型藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)。根(gen)據(ju)(ju)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)實施例(li)(li)，該藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)包括：間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)；以(yi)及填充(chong)(chong)劑，其(qi)中，所述填充(chong)(chong)劑包括選自膠原(yuan)蛋白(bai)、透明(ming)(ming)(ming)(ming)質(zhi)酸(suan)、鈣羥基磷灰石(微晶瓷(ci))、聚乳酸(suan)和富(fu)血(xue)小(xiao)板血(xue)漿的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)至(zhi)少之一(yi)(yi)。利(li)用(yong)(yong)(yong)(yong)根(gen)據(ju)(ju)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)實施例(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)提(ti)高細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)性(xing)、創(chuang)傷修(xiu)復(fu)，相比于現(xian)有(you)技(ji)術(shu)，克服了(le)自體皮(pi)(pi)膚(fu)(fu)移植見效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)慢(man)、效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)果(guo)不(bu)穩定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)缺(que)陷。根(gen)據(ju)(ju)本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)實施例(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)采用(yong)(yong)(yong)(yong)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，免疫(yi)原(yuan)性(xing)低；間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)和膠原(yuan)蛋白(bai)、透明(ming)(ming)(ming)(ming)質(zhi)酸(suan)、鈣羥基磷灰石(微晶瓷(ci))、聚乳酸(suan)、富(fu)血(xue)小(xiao)板血(xue)漿復(fu)合(he)(he)(he)使用(yong)(yong)(yong)(yong)，見效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)快；利(li)用(yong)(yong)(yong)(yong)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)分泌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)生長因子激活(huo)自體成纖維(wei)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)功能，并(bing)進(jin)(jin)一(yi)(yi)步增(zeng)加細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數量(liang)，通過進(jin)(jin)一(yi)(yi)步促進(jin)(jin)血(xue)管化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)形成，從(cong)而達到改(gai)善皮(pi)(pi)膚(fu)(fu)活(huo)性(xing)狀(zhuang)態，具(ju)有(you)自然(ran)性(xing)。此外，輸注到皮(pi)(pi)膚(fu)(fu)缺(que)損處的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)透明(ming)(ming)(ming)(ming)質(zhi)酸(suan)或膠原(yuan)蛋白(bai)本(ben)身具(ju)有(you)一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)修(xiu)復(fu)效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)果(guo)；最后，該藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)可采用(yong)(yong)(yong)(yong)涂抹、注射等(deng)方(fang)式，規(gui)避了(le)手術(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)失(shi)敗風險，是一(yi)(yi)種非(fei)常安全(quan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)。另外，發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)人發(fa)(fa)現(xian)，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)(ming)(ming)(ming)公開的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，填充(chong)(chong)劑可以(yi)將間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)維(wei)持(chi)在(zai)一(yi)(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)空間(jian)(jian)和體積范圍(wei)內(nei)，不(bu)僅可以(yi)起到保(bao)護和潤(run)滑細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)(yong)，還能夠提(ti)高該范圍(wei)內(nei)有(you)效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)因子的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)(yong)濃度，更高效(xiao)(xiao)(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)促進(jin)(jin)目標細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)活(huo)性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加。以(yi)透明(ming)(ming)(ming)(ming)質(zhi)酸(suan)為(wei)例(li)(li)，其(qi)與間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聯合(he)(he)(he)作為(wei)藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)(he)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)使用(yong)(yong)(yong)(yong)，除了(le)有(you)上(shang)述優勢之外，透明(ming)(ming)(ming)(ming)質(zhi)酸(suan)還可以(yi)起到保(bao)持(chi)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)水分，保(bao)護間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)不(bu)受病原(yuan)菌的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)侵害等(deng)作用(yong)(yong)(yong)(yong)。

根(gen)據本發明(ming)的具體實(shi)施例，所(suo)述間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)為(wei)臍(qi)帶(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)。臍(qi)帶(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)來源廣泛，它可采用從(cong)醫療(liao)廢棄物——臍(qi)帶(dai)中分離間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，不(bu)需要從(cong)患者(zhe)身(shen)上取(qu)材，免去患者(zhe)手術(shu)的風(feng)險和(he)痛(tong)苦(ku)，且(qie)臍(qi)帶(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)免疫原性更(geng)低，用藥更(geng)加安全，臍(qi)帶(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)則能夠(gou)分泌(mi)膠原蛋白并進(jin)一(yi)步分泌(mi)包(bao)括SCF、bFGF、VEGF、IGF等在內的因子，刺激真皮(pi)層中成纖維細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)存活與增殖并進(jin)一(yi)步分泌(mi)膠原蛋白、透明(ming)質(zhi)酸和(he)彈性纖維，不(bu)僅如此臍(qi)帶(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)還可以(yi)進(jin)一(yi)步促進(jin)血(xue)管化的發生，進(jin)一(yi)步起到營養真皮(pi)及皮(pi)下相關細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)的作(zuo)用，藥效(xiao)更(geng)加有力(li)。

根(gen)據本發明的(de)(de)具體示例，所(suo)述間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)為P1～P6代間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)。發明人發現，P6代以上的(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)狀(zhuang)態(tai)不如(ru)早代次的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)、分泌的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)因子量(liang)也有(you)所(suo)減少，使用P1～P6代間(jian)充(chong)(chong)(chong)質干(gan)細(xi)胞(bao)(bao)，所(suo)述藥(yao)物(wu)組合物(wu)用于提高細(xi)胞(bao)(bao)活性(xing)效果更加顯著。

根據本(ben)發明的(de)具體示(shi)例，所(suo)述(shu)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)胞以(yi)懸(xuan)浮(fu)于(yu)(yu)培(pei)(pei)養基、懸(xuan)浮(fu)于(yu)(yu)生理鹽水或貼壁(bi)培(pei)(pei)養于(yu)(yu)培(pei)(pei)養基中(zhong)的(de)形式(shi)(shi)提供(gong)的(de)。發明人通(tong)過(guo)實驗發現，間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)胞以(yi)懸(xuan)浮(fu)于(yu)(yu)生理鹽水中(zhong)、以(yi)懸(xuan)浮(fu)于(yu)(yu)培(pei)(pei)養基或貼壁(bi)培(pei)(pei)養于(yu)(yu)培(pei)(pei)養基中(zhong)形式(shi)(shi)供(gong)，可保持間(jian)(jian)充(chong)(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)(xi)胞的(de)良好(hao)狀態。

根據本發明的另一具體實施例，所述間充質干細胞以懸浮于培養基或懸浮于生理鹽水中的形式提供，所述間充質干細胞的密度為0.1*10⁶-10*10⁶個/ml。間充干細胞以0.1*10⁶-10*10⁶個/ml的(de)密度懸浮于培(pei)養(yang)基或(huo)懸浮于生理鹽水中，有(you)利于保持間充質干(gan)細(xi)胞的(de)活性(xing)(xing)，有(you)利于保持間充質干(gan)細(xi)胞分泌生長因子(zi)以(yi)及(ji)膠原蛋白(bai)，也可(ke)提(ti)供(gong)合適大(da)小的(de)體(ti)積(ji)(ji)(ji)比(細(xi)胞懸液體(ti)積(ji)(ji)(ji)：填(tian)充劑的(de)體(ti)積(ji)(ji)(ji))，進而使(shi)得本(ben)發明實(shi)施例(li)的(de)藥物組合物用于提(ti)高細(xi)胞活性(xing)(xing)的(de)效果(guo)更(geng)加顯著。

根據本發明的另一具體實施例，所述間充質干細胞以貼壁培養于培養基中的形式提供，所述間充質干細胞的貼壁密度為1*10⁴～3*10⁴個/cm²。間充質干細胞以1*10⁴～3*10⁴個/cm²濃度貼壁培養(yang)培養(yang)于培養(yang)基中，有(you)(you)利于保持間充質干細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的活性，有(you)(you)利于保持間充質干細(xi)胞(bao)(bao)(bao)較高的分泌生(sheng)長因子以(yi)及(ji)膠原(yuan)蛋白，進(jin)而使(shi)得本發明實施例(li)的藥物(wu)(wu)組合物(wu)(wu)用(yong)于提高細(xi)胞(bao)(bao)(bao)活性的效果更加顯著。

根據(ju)本發明(ming)的(de)一些具(ju)體實施例，所述(shu)培(pei)(pei)養(yang)基與所述(shu)填(tian)充劑(ji)(ji)的(de)體積比為1:0.5～1:5。發明(ming)人發現，培(pei)(pei)養(yang)基與填(tian)充劑(ji)(ji)的(de)體積比在(zai)1:0.5～1:5范圍內，包括(kuo)間充質干(gan)細(xi)胞與填(tian)充劑(ji)(ji)的(de)藥(yao)物組合物在(zai)提高細(xi)胞的(de)活性(xing)上效果更加顯著。

根據本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)實施例，所述(shu)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)的(de)劑(ji)型(xing)為涂抹劑(ji)和注射(she)(she)劑(ji)。本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)可(ke)(ke)以(yi)通過(guo)任何常見的(de)途徑被給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)(yao)，只要它可(ke)(ke)以(yi)到(dao)達預期的(de)組織，主要通過(guo)涂抹、注射(she)(she)的(de)途徑給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)(yao)。給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)(yao)的(de)各種(zhong)方式是(shi)可(ke)(ke)以(yi)預期的(de)，包(bao)括皮(pi)下，皮(pi)層，局部，但是(shi)本(ben)發(fa)明(ming)(ming)不(bu)限于這些已(yi)舉(ju)例的(de)給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)(yao)方式。優選(xuan)地，本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)組合物(wu)以(yi)注射(she)(she)劑(ji)的(de)劑(ji)型(xing)提供，本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)能(neng)夠更加(jia)精準地抵達待治療(liao)位(wei)點，藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)的(de)治療(liao)效(xiao)果會(hui)更加(jia)有效(xiao)、持久。此(ci)外，本(ben)發(fa)明(ming)(ming)的(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)組合物(wu)可(ke)(ke)以(yi)使用將活性成分傳送(song)到(dao)靶(ba)細胞的(de)特(te)定(ding)器械來給(gei)(gei)(gei)藥(yao)(yao)(yao)。

本(ben)發(fa)明的(de)藥(yao)物(wu)組合物(wu)的(de)給藥(yao)頻率和(he)劑量可(ke)以(yi)通過多個相關因(yin)(yin)素被(bei)確定，該因(yin)(yin)素包括要被(bei)處理的(de)人的(de)年齡(ling)，性別(bie)，體重(zhong)和(he)創傷等的(de)嚴(yan)重(zhong)程(cheng)度以(yi)及作為活性成分(fen)(fen)的(de)藥(yao)物(wu)類(lei)型。根據本(ben)發(fa)明的(de)一(yi)些實(shi)施例，劑量可(ke)分(fen)(fen)為適宜(yi)形式的(de)1劑、2劑或(huo)(huo)多劑，以(yi)在整個時間段(duan)內以(yi)1次(ci)、2次(ci)或(huo)(huo)多次(ci)給藥(yao)，只要達到創傷修復有效量即可(ke)。

術語“創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)有效(xiao)量(liang)”是(shi)(shi)指藥(yao)物(wu)組合物(wu)足(zu)以(yi)(yi)顯著改(gai)善(shan)某些(xie)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)量(liang)，也即為給定癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)提(ti)供創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)效(xiao)果的(de)(de)量(liang)。例如(ru)，在創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)中，減少、預(yu)(yu)防(fang)、延緩(huan)、抑制或阻滯任何癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)藥(yao)物(wu)應當是(shi)(shi)創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)有效(xiao)的(de)(de)。創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)有效(xiao)量(liang)的(de)(de)藥(yao)物(wu)不需(xu)要(yao)消除癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)，但(dan)將為癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)提(ti)供創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)，使得(de)個體(ti)(ti)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)發作被延緩(huan)、阻止(zhi)或預(yu)(yu)防(fang)，或者(zhe)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)得(de)以(yi)(yi)緩(huan)解(jie)，或者(zhe)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)期限(xian)(xian)被改(gai)變。術語“創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)”用(yong)(yong)于指獲得(de)期望(wang)的(de)(de)藥(yao)理學和/或生理學效(xiao)果。所(suo)(suo)述效(xiao)果就完全或部(bu)分預(yu)(yu)防(fang)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)而(er)言可以(yi)(yi)是(shi)(shi)預(yu)(yu)防(fang)性(xing)的(de)(de)。本文(wen)使用(yong)(yong)的(de)(de)“創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)”涵(han)蓋哺乳動物(wu)、特別是(shi)(shi)人(ren)的(de)(de)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)。本文(wen)使用(yong)(yong)的(de)(de)“創(chuang)(chuang)傷(shang)修復(fu)”涵(han)蓋將藥(yao)物(wu)給予個體(ti)(ti)以(yi)(yi)治(zhi)愈、緩(huan)解(jie)、改(gai)善(shan)、減輕或抑制個體(ti)(ti)的(de)(de)癥(zheng)(zheng)(zheng)狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)任何用(yong)(yong)藥(yao)，包括但(dan)不限(xian)(xian)于將含(han)本文(wen)所(suo)(suo)述藥(yao)物(wu)組合物(wu)給予有需(xu)要(yao)的(de)(de)個體(ti)(ti)。

根據本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)實(shi)施例，本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)可(ke)與(yu)常規(gui)創傷(shang)(shang)修復方法(fa)和/或(huo)療法(fa)相(xiang)結合(he)(he)使用(yong)，或(huo)者(zhe)可(ke)與(yu)常規(gui)創傷(shang)(shang)修復方法(fa)和/或(huo)療法(fa)分開使用(yong)。當本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)在采用(yong)與(yu)其它(ta)(ta)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)的(de)(de)聯(lian)合(he)(he)療法(fa)中給藥(yao)(yao)(yao)時，它(ta)(ta)們可(ke)序貫地或(huo)同時地給予個體。或(huo)者(zhe)，本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)組(zu)合(he)(he)物(wu)(wu)可(ke)包含藥(yao)(yao)(yao)學上可(ke)接(jie)受的(de)(de)載體或(huo)藥(yao)(yao)(yao)學上可(ke)接(jie)受的(de)(de)賦形劑以及本(ben)領(ling)域已知的(de)(de)其它(ta)(ta)創傷(shang)(shang)修復藥(yao)(yao)(yao)的(de)(de)組(zu)合(he)(he)。

藥物組合物的用途

在本(ben)發明(ming)(ming)的(de)(de)(de)(de)(de)再一(yi)(yi)方面，本(ben)發明(ming)(ming)提(ti)出了前面所述藥物(wu)組合物(wu)在制備藥物(wu)中的(de)(de)(de)(de)(de)用(yong)途，所述藥物(wu)用(yong)于(yu)創(chuang)傷(shang)(shang)修(xiu)(xiu)復(fu)(fu)。本(ben)發明(ming)(ming)實(shi)施例(li)的(de)(de)(de)(de)(de)藥物(wu)組合物(wu)中的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)胞可以(yi)分(fen)泌(mi)包(bao)括(kuo)SCF、bFGF、VEGF、IGF等(deng)在內的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞因(yin)子，發揮營(ying)養、刺激真皮層中成纖維細(xi)胞存(cun)活(huo)與(yu)增殖(zhi)，使得成纖維細(xi)胞進一(yi)(yi)步分(fen)泌(mi)膠(jiao)原蛋白(bai)、透明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)酸和(he)(he)彈(dan)性(xing)(xing)纖維，填補(bu)凹陷、修(xiu)(xiu)復(fu)(fu)創(chuang)傷(shang)(shang)部位；另外間(jian)充(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)胞還可以(yi)促進血管化的(de)(de)(de)(de)(de)形成，進一(yi)(yi)步起到(dao)(dao)營(ying)養的(de)(de)(de)(de)(de)效(xiao)(xiao)果；不(bu)僅如此，間(jian)充(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)胞本(ben)身可以(yi)分(fen)泌(mi)產(chan)生膠(jiao)原蛋白(bai)，進一(yi)(yi)步增加皮膚的(de)(de)(de)(de)(de)厚度和(he)(he)彈(dan)性(xing)(xing)，使凹陷部分(fen)得到(dao)(dao)舒展，填平缺損，恢(hui)復(fu)(fu)皮膚的(de)(de)(de)(de)(de)彈(dan)性(xing)(xing)和(he)(he)光(guang)澤。間(jian)充(chong)質(zhi)(zhi)干細(xi)胞進一(yi)(yi)步復(fu)(fu)合包(bao)括(kuo)膠(jiao)原蛋白(bai)、透明(ming)(ming)質(zhi)(zhi)酸、鈣羥基磷(lin)灰石(微晶瓷)、聚乳酸和(he)(he)富血小(xiao)板血漿的(de)(de)(de)(de)(de)至少之(zhi)一(yi)(yi)涂抹(mo)、注射到(dao)(dao)患者皮膚缺陷處(chu)可進行有(you)效(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)修(xiu)(xiu)復(fu)(fu)創(chuang)傷(shang)(shang)等(deng)。本(ben)發明(ming)(ming)實(shi)施例(li)的(de)(de)(de)(de)(de)藥物(wu)用(yong)于(yu)修(xiu)(xiu)復(fu)(fu)創(chuang)傷(shang)(shang)，具有(you)見效(xiao)(xiao)快(kuai)、藥效(xiao)(xiao)持(chi)久、免疫原性(xing)(xing)低(di)、自然性(xing)(xing)和(he)(he)風險低(di)的(de)(de)(de)(de)(de)優勢。

需要說明的是(shi)，本(ben)申請所述的方法或藥物組合(he)物的應(ying)用包括但不限于(yu)“創傷(shang)修復”。”

需要說明(ming)的(de)(de)是，本申請中所(suo)述(shu)的(de)(de)“目(mu)標細胞(bao)(bao)與間充質干細胞(bao)(bao)以及(ji)(ji)填(tian)(tian)充劑(ji)進行接觸(chu)(chu)”，既可以是細胞(bao)(bao)個體(ti)與填(tian)(tian)充劑(ji)之間的(de)(de)接觸(chu)(chu)，也可以是間充質干細胞(bao)(bao)分泌的(de)(de)細胞(bao)(bao)因子與目(mu)標細胞(bao)(bao)及(ji)(ji)填(tian)(tian)充劑(ji)之間的(de)(de)接觸(chu)(chu)。

需要說明的(de)(de)是，本申請中所述的(de)(de)“細胞活(huo)(huo)性”是指細胞的(de)(de)生理狀態和功能，包括細胞基本狀態、細胞增殖能力(有時稱為活(huo)(huo)力)、分泌(mi)因子(zi)的(de)(de)能力以及常規細胞功能的(de)(de)維持。

需要說明的(de)是(shi)，本申(shen)請(qing)所述的(de)“細胞狀態(tai)良好(hao)”是(shi)指(zhi)細胞維持正(zheng)常(chang)培養時的(de)形態(tai)好(hao)(以間充(chong)質干(gan)細胞為例，細胞貼壁(bi)，細胞呈梭形，片狀生(sheng)長)，細胞透亮、邊(bian)緣清(qing)楚，細胞折光性較好(hao)，整個細胞培養過(guo)程中無(wu)污染物(wu)(包括(kuo)支原體、細菌、真菌、黑膠(jiao)充(chong)、原蟲等)出現(xian)。

下面詳細描(miao)(miao)述(shu)本發(fa)(fa)明(ming)的(de)(de)(de)實(shi)(shi)施例。下面描(miao)(miao)述(shu)的(de)(de)(de)實(shi)(shi)施例是示(shi)例性的(de)(de)(de)，僅用于解釋本發(fa)(fa)明(ming)，而不能理解為對本發(fa)(fa)明(ming)的(de)(de)(de)限制(zhi)。實(shi)(shi)施例中未注明(ming)具體技術(shu)(shu)或條(tiao)件的(de)(de)(de)，按照(zhao)(zhao)本領(ling)域(yu)內的(de)(de)(de)文獻所描(miao)(miao)述(shu)的(de)(de)(de)技術(shu)(shu)或條(tiao)件或者按照(zhao)(zhao)產(chan)品說明(ming)書進行。所用試劑或儀(yi)器(qi)未注明(ming)生產(chan)廠商者，均為可以通過市購(gou)獲得(de)的(de)(de)(de)常規(gui)產(chan)品。

實施例1

在(zai)本實施例中(zhong)，發(fa)(fa)明(ming)人篩選了(le)包括不同(tong)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)與(yu)(yu)膠原蛋白或(huo)(huo)(huo)透(tou)明(ming)質(zhi)酸(suan)或(huo)(huo)(huo)鈣羥基(ji)磷(lin)(lin)灰石(shi)(微(wei)晶(jing)瓷(ci))或(huo)(huo)(huo)聚(ju)乳(ru)酸(suan)或(huo)(huo)(huo)富(fu)血(xue)小板血(xue)漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)對提高細(xi)(xi)胞(bao)活性的(de)(de)(de)(de)(de)影響，在(zai)本實施例中(zhong)，所(suo)待提高活性的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)為成纖維細(xi)(xi)胞(bao)，不同(tong)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)包括：臍帶(dai)血(xue)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、外周血(xue)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、臍帶(dai)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、胎盤來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、羊膜來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、骨髓來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、骨膜來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、脂肪來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)、牙齒(chi)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)等。發(fa)(fa)明(ming)人發(fa)(fa)現，臍帶(dai)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)相(xiang)比于其他(ta)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)，本身(shen)屬(shu)于醫療廢(fei)棄物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)，細(xi)(xi)胞(bao)免疫(yi)原性更(geng)低，具有一(yi)定的(de)(de)(de)(de)(de)通用性，所(suo)獲得的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)質(zhi)量高、數量多、純度也較高。進(jin)而在(zai)后(hou)續實驗中(zhong)，發(fa)(fa)明(ming)人選擇包括臍帶(dai)來(lai)(lai)源(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)(de)(de)間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)與(yu)(yu)膠原蛋白或(huo)(huo)(huo)透(tou)明(ming)質(zhi)酸(suan)或(huo)(huo)(huo)鈣羥基(ji)磷(lin)(lin)灰石(shi)(微(wei)晶(jing)瓷(ci))或(huo)(huo)(huo)聚(ju)乳(ru)酸(suan)或(huo)(huo)(huo)富(fu)血(xue)小板血(xue)漿(jiang)的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)進(jin)行后(hou)續檢測。以下，以間(jian)充(chong)(chong)質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞(bao)與(yu)(yu)透(tou)明(ming)質(zhi)酸(suan)的(de)(de)(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)組合物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)為例，進(jin)行詳細(xi)(xi)分析和描述。

實施例2

在本實施(shi)例中，發明人對所選用的臍(qi)帶間充(chong)質(zhi)干(gan)細胞的形態(tai)和表型進(jin)行了(le)觀(guan)察和鑒定。結果如下所述：

臍帶(dai)(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)的形(xing)(xing)態(tai)表現為細(xi)胞(bao)貼壁，呈(cheng)梭(suo)形(xing)(xing)，片(pian)狀生(sheng)(sheng)長。具體形(xing)(xing)態(tai)如圖1所示(shi)。臍帶(dai)(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)在如圖1的生(sheng)(sheng)長狀態(tai)下，臍帶(dai)(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)的增(zeng)殖能(neng)力(li)強(qiang)，分(fen)泌包括bFGF、VEGF、IGF等在內的細(xi)胞(bao)因子以及膠原蛋白(bai)的增(zeng)殖能(neng)力(li)強(qiang)，適于選擇作為本發(fa)明藥物組合物的臍帶(dai)(dai)間(jian)(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)。

發明人通過流式細(xi)胞檢測鑒(jian)定(ding)所選擇(ze)的臍帶間充質干細(xi)胞表達CD90(陽(yang)(yang)性(xing)細(xi)胞率：99％)、CD105(陽(yang)(yang)性(xing)細(xi)胞率：99％)，CD73(陽(yang)(yang)性(xing)細(xi)胞率：99％)，不(bu)表達HLA-DR，CD14，CD19，CD34和(he)CD45，結果如圖(tu)2所示。

實施例3

在本實施例(li)中，發明(ming)人(ren)對所選(xuan)用的臍帶來源的間充(chong)質干細胞與透明(ming)質酸的用量上進行了篩(shai)選(xuan)。

發(fa)明人(ren)進行了(le)間(jian)充質(zhi)干細胞的細胞活率實驗，實驗過程如下所(suo)述：

1、消(xiao)化臍帶間充(chong)質干(gan)(gan)細胞(bao)：將一瓶生長(chang)至80％～90％的(de)臍帶間充(chong)質干(gan)(gan)細胞(bao)使用胰酶消(xiao)化，培養基中和后(hou)，在1200rpm的(de)條件下(xia)離心(xin)5min：

2、重懸細胞：離心后棄上清，使用臍帶間充質(zhi)干(gan)細胞培養基進行重懸：

3、接種細胞：將細胞按照同樣的體積(100ul)進行接種(每孔2000個間充質干細胞)，每個孔重復5次，一共開展實驗3天，即每個孔有15個重復樣。之后將接種后的細胞于37℃，5％CO₂培養箱中過夜培養。

4、添加(jia)(jia)透(tou)明(ming)質酸(suan)/膠原(yuan)蛋白：待細(xi)胞過夜(ye)培養貼壁后棄舊的(de)(de)培養基(ji)，并(bing)添加(jia)(jia)入新(xin)鮮的(de)(de)培養基(ji)。其中，對照組只添加(jia)(jia)培養基(ji)，實驗組按照如下(xia)體(ti)積(ji)(ji)比(bi)添加(jia)(jia)透(tou)明(ming)質酸(suan)，其中培養基(ji)：透(tou)明(ming)質酸(suan)的(de)(de)體(ti)積(ji)(ji)比(bi)為：1：0.01，1：0.1，1：0.5，1：1，1：5，1：10，總(zong)體(ti)積(ji)(ji)為100ul。

5、檢測：24小時、48小時和72小時后用槍頭丟掉培養基和透明質酸/膠原蛋白，之后PBS洗一次，加入100ul新鮮的培養基，并加入10ul CCK8，輕柔混勻，避免氣泡的產生，之后37℃，5％CO₂培養(yang)箱中靜(jing)置3-4小(xiao)時(shi)，之(zhi)后(hou)于OD560處檢(jian)測吸(xi)光(guang)光(guang)度值(zhi)。全部時(shi)間點檢(jian)測完畢后(hou)，進(jin)行統計數據的分析(xi)。

實驗結果顯示，培養(yang)基與透(tou)明質(zhi)酸(suan)的(de)(de)(de)體(ti)積(ji)比(bi)在1:0.5-1:5的(de)(de)(de)范圍內均可保持間(jian)(jian)充質(zhi)干(gan)細胞的(de)(de)(de)基本活性(xing)，間(jian)(jian)充質(zhi)干(gan)細胞的(de)(de)(de)活性(xing)佳。在體(ti)積(ji)比(bi)為1：0.01和1：0.1時，透(tou)明質(zhi)酸(suan)過釋，影響(xiang)透(tou)明質(zhi)酸(suan)的(de)(de)(de)效果的(de)(de)(de)發揮(hui)；體(ti)積(ji)比(bi)為1：10，則間(jian)(jian)充質(zhi)干(gan)細胞的(de)(de)(de)細胞狀態(tai)變(bian)差(cha)，間(jian)(jian)充質(zhi)干(gan)細胞死亡率明顯上(shang)升。故優選培養(yang)基與透(tou)明質(zhi)酸(suan)的(de)(de)(de)體(ti)積(ji)比(bi)為1：0.5-1:5。

實施例4

在本實施例中(zhong)，發明(ming)人(ren)利(li)用(yong)所選用(yong)的臍帶(dai)來源的間(jian)充質干細胞(bao)與透(tou)明(ming)質酸與成纖(xian)維細胞(bao)共培(pei)養(yang)，并對成纖(xian)維細胞(bao)的活性進行了檢(jian)測。

實驗過程如下所述：

1、消(xiao)化(hua)成纖維細胞：將一瓶生長(chang)至80％～90％的(de)成纖維細胞使用胰酶消(xiao)化(hua)，培養(yang)基中(zhong)和(he)后，在1200rpm的(de)條件(jian)下離心5min。

2、在(zai)消(xiao)(xiao)化(hua)成纖維(wei)細(xi)胞(bao)的(de)同時，消(xiao)(xiao)化(hua)臍帶間充(chong)質干細(xi)胞(bao)。具體操作如下(xia)所述：將一瓶(ping)生(sheng)長至80％～90％的(de)臍帶間充(chong)質干細(xi)胞(bao)使用(yong)胰酶消(xiao)(xiao)化(hua)，培養基中(zhong)和后，在(zai)1200rpm的(de)條件下(xia)離(li)心5min。

3、重懸細胞：離心后棄上清，使用培養基將細胞按照1*10⁵個/ml的密度進行重懸。

4、接種細胞：將1*10⁴個成纖維細胞接種到24孔板中，每個孔重復3次(一共有3個檢測時間點，即每個孔有9個重復樣)，之后放置孔徑為1μm的Transwell小室(懸掛式細胞培養皿)并將0.7*10⁴個間充質干細胞接種于小室，培養基總體積為接近小室上沿為最佳，之后將接種后的細胞于37℃，5％CO₂培養箱中過夜培養。

5、添加透明質酸(suan)：待細胞過夜培(pei)(pei)養貼壁后棄舊的培(pei)(pei)養基，PBS洗1次后加入新鮮的無(wu)血清培(pei)(pei)養基。其中，對照(zhao)組只添加培(pei)(pei)養基，實驗(yan)組按照(zhao)Transwell小室(懸掛式細胞培(pei)(pei)養皿)培(pei)(pei)養基體(ti)積與透明質酸(suan)體(ti)積比(bi)為1：1添加透明質酸(suan)。

6、檢測：12小時、24小時和48小時后僅保留成纖維細胞并使用PBS洗一次，加入1ml新鮮的無血清培養基，并加入100ul CCK8，輕柔混勻，避免氣泡的產生，之后37℃，5％CO₂培(pei)養箱中靜置3-4小(xiao)時(shi)(shi)，之后于OD560處檢測吸光(guang)光(guang)度值(zhi)。全部時(shi)(shi)間點檢測完畢后，進(jin)行(xing)統計數據的分(fen)析。

實驗(yan)結果顯示，細(xi)胞(bao)培養12和(he)24小(xiao)(xiao)時后(hou)(hou)有間(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)以(yi)及(ji)填充(chong)(chong)劑(ji)所在的(de)實驗(yan)組，細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態(tai)和(he)檢測的(de)OD值要明顯優(you)于(yu)單(dan)獨使用(yong)無血(xue)清培養基(ji)組；48小(xiao)(xiao)時后(hou)(hou)，由于(yu)細(xi)胞(bao)長(chang)期處于(yu)無血(xue)清培養的(de)狀(zhuang)態(tai)下(xia)，整(zheng)體狀(zhuang)態(tai)均(jun)不如12小(xiao)(xiao)時和(he)24小(xiao)(xiao)時，但是也可(ke)觀(guan)察(cha)到實驗(yan)組的(de)結果優(you)于(yu)對照組。上述實驗(yan)結果證(zheng)明，間(jian)充(chong)(chong)質干細(xi)胞(bao)以(yi)及(ji)填充(chong)(chong)劑(ji)可(ke)以(yi)提高(gao)目(mu)標細(xi)胞(bao)的(de)活性，例如成纖(xian)維細(xi)胞(bao)。

實施例5

在(zai)本(ben)實(shi)(shi)(shi)施(shi)例中，發明(ming)人進一步通過動(dong)物實(shi)(shi)(shi)驗驗證了本(ben)發明(ming)實(shi)(shi)(shi)施(shi)例的(de)藥物組合物的(de)用藥效果(guo)。

將臍帶間充質干細胞以1×10⁶/mL的密度(懸浮于生理(li)鹽(yan)水)與(yu)透(tou)明(ming)質(zhi)(zhi)酸(suan)按照1：2的比例在(zai)進(jin)行實(shi)驗之(zhi)(zhi)前進(jin)行混合(he)，混合(he)均勻后(hou)形成細(xi)胞(bao)-透(tou)明(ming)質(zhi)(zhi)酸(suan)復合(he)物(wu)。之(zhi)(zhi)后(hou)開展(zhan)動物(wu)實(shi)驗，具體(ti)操作為將對照組(zu)材料和臍(qi)帶間充質(zhi)(zhi)干(gan)細(xi)胞(bao)-透(tou)明(ming)質(zhi)(zhi)酸(suan)復合(he)物(wu)涂抹于雄性BLAB/c裸鼠(體(ti)量約(yue)20g，購自維通(tong)利華，生產許可證號：SCXK(京(jing))2012-0001)創面處(chu)(前期處(chu)理(li)形成)，每(mei)組(zu)老鼠各5只(zhi)。具體(ti)結果如(ru)下：

(1)未開(kai)展(zhan)實(shi)驗(yan)之前的(de)(de)觀察(cha)：包括(kuo)對(dui)照組和實(shi)驗(yan)組在(zai)內(nei)的(de)(de)準備開(kai)展(zhan)動物(wu)實(shi)驗(yan)的(de)(de)雄性BLAB/c裸(luo)鼠，其背部(bu)創面(mian)(mian)皮膚為全層皮膚缺損創面(mian)(mian)，整體(ti)為直徑為1cm的(de)(de)接近圓形(xing)的(de)(de)創面(mian)(mian)區域(yu)。

(2)開(kai)展治療：將對(dui)照組(透(tou)(tou)明質(zhi)酸)和實驗(yan)組(臍帶間充質(zhi)干細胞-透(tou)(tou)明質(zhi)酸復合物)材(cai)料均勻涂(tu)抹于裸(luo)鼠背(bei)部創面區，然后(hou)以(yi)不粘紗布包(bao)扎創面，每(mei)日換(huan)藥一次(ci)，10天后(hou)停止換(huan)藥，術區加壓(ya)包(bao)扎，外加腹帶固定，防止位移。

(3)完成注射(she)后的1、3、7、10天(tian)換藥時(shi)觀察創面(mian)(mian)的愈合(he)情況并(bing)測定創面(mian)(mian)大小，結果提示，治療后1天(tian)并(bing)無差(cha)異，3天(tian)開始出(chu)現(xian)差(cha)異并(bing)且隨著時(shi)間的增加，差(cha)異更為明顯。實(shi)驗組的愈合(he)情況較好(hao)，并(bing)且創面(mian)(mian)面(mian)(mian)積相對(dui)對(dui)照組而言有(you)明顯變小的趨勢。

(4)完成治療后3-4周的(de)觀察：實(shi)驗(yan)(yan)開展3-4周后，再次觀察動物創(chuang)(chuang)面形態。對照組有一(yi)定(ding)面積的(de)創(chuang)(chuang)面發生愈合(he)，實(shi)驗(yan)(yan)組已基本(ben)愈合(he)。同(tong)對照組相(xiang)比(bi)，實(shi)驗(yan)(yan)組的(de)創(chuang)(chuang)傷(shang)愈合(he)速度和愈合(he)的(de)面積明顯優于對照組，這(zhe)與同(tong)前期觀察結果相(xiang)一(yi)致。這(zhe)表明臍帶間充質干細胞-透明質酸復合(he)物對皮(pi)膚創(chuang)(chuang)傷(shang)修復的(de)效果更好。

在本(ben)(ben)說明書的(de)(de)描述中(zhong)，參考術語“一個實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)”、“一些實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)”、“示(shi)(shi)例(li)(li)(li)”、“具(ju)(ju)體示(shi)(shi)例(li)(li)(li)”、或“一些示(shi)(shi)例(li)(li)(li)”等的(de)(de)描述意(yi)指結合(he)(he)(he)該實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)描述的(de)(de)具(ju)(ju)體特(te)征、結構、材料(liao)或者特(te)點(dian)包含于本(ben)(ben)發明的(de)(de)至少一個實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)中(zhong)。在本(ben)(ben)說明書中(zhong)，對上述術語的(de)(de)示(shi)(shi)意(yi)性表述不(bu)必須針(zhen)對的(de)(de)是(shi)相同的(de)(de)實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)。而且，描述的(de)(de)具(ju)(ju)體特(te)征、結構、材料(liao)或者特(te)點(dian)可以(yi)在任一個或多個實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)中(zhong)以(yi)合(he)(he)(he)適的(de)(de)方式結合(he)(he)(he)。此外，在不(bu)相互矛盾的(de)(de)情況下(xia)，本(ben)(ben)領(ling)域的(de)(de)技術人員可以(yi)將(jiang)本(ben)(ben)說明書中(zhong)描述的(de)(de)不(bu)同實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)以(yi)及(ji)不(bu)同實施(shi)(shi)例(li)(li)(li)或示(shi)(shi)例(li)(li)(li)的(de)(de)特(te)征進行結合(he)(he)(he)和(he)組(zu)合(he)(he)(he)。

盡管(guan)上(shang)(shang)面已(yi)經示出(chu)和描述了本(ben)(ben)發(fa)明的實施(shi)例(li)，可(ke)以理解的是(shi)，上(shang)(shang)述實施(shi)例(li)是(shi)示例(li)性的，不能(neng)理解為對本(ben)(ben)發(fa)明的限制(zhi)，本(ben)(ben)領域的普通技術人員在本(ben)(ben)發(fa)明的范圍內(nei)可(ke)以對上(shang)(shang)述實施(shi)例(li)進行變化、修(xiu)改、替換和變型。