本發明涉及干細胞技術領域，尤其是涉及一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法。

背景技術：

間充質干細胞分化再生軟骨是一種優良的組織工程方法，間充質干細胞是一種能接受天然微環境信號而多向分化的多能干細胞。當提供合適的生長因子，間充質干細胞在細胞球狀培養和多種生物材料中能生成軟骨和分泌軟骨特有基質。

在牙源性間充質干細胞中，牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞因其易從口腔和牙科操作廢棄的生物組織中獲取而擁有獨特優勢，且通過體內體外試驗均驗證了這些牙源性間充質干細胞的多向分化能力。

間充質干細胞有效分化為軟骨細胞需要核實的微環境和信號分子，如tfg-β1、bmp-4和fgf-2等生長因子。干細胞載體對于干細胞體內活動和再生過程也具有重要作用。

因此，通過改造干細胞外基質的理化性質來設計一種合適的微環境，以創造合適的干細胞環境，而引導干細胞分化為特定表型。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，為實現上述方法本發明提供如下技術方案：

牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

步驟a.祖細胞提取和培養

選擇并提取第三磨牙的牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞，要求：18-25歲的健康男性成人，無牙周病史。

為評估克隆形成，在培養皿中植入0.1*10⁶個細胞并培養14天，再用甲苯胺藍染色，將超過50個細胞數的克隆作為一個陽性cfu-f。實驗組選用第四代細胞，人骨髓間充質干細胞作為陽性對照組。

步驟b.細胞流式分析

選取數量約為5*10⁵個第四代細胞，用pe或者fitc鼠單克隆抗人cd34和cd45流式抗體孵育，以及cd73、cd105、cd146、cd166(間充質干細胞表面標志物)或lggs作為同型對照。

步驟c.生物材料的制備

采用高濃度古羅糖醛酸的rgd-coupled藻酸鹽，對其進行處理以提高降解性，并與tgf-β1混合。

步驟d.細胞的包被

選取pdlsc和gmsc以及作為陽性對照的hbmmsc以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中以形成微球。

所述步驟c中的生物材料的制備還包括以下分步驟：

分步驟1：選取高濃度古羅糖醛酸的rgd-coupled藻酸鹽；

分步驟2：為提高上述藻酸鹽的生物降解性，將其進行純化處理，以及部分氧化(2％)處理；

分步驟3：將上述經過處理后的藻酸鹽與tgf-β1(500ug/ml)充分攪拌混合，濃縮、真空凍干。

所述步驟d中的細胞包被還包括以下分步驟：

分步驟1：將pdlsc和gmsc以及陽性對照的hbmmsc以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中；

分步驟2：采用注射器將藻酸鹽(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流體裝置，藻酸鹽被大豆油分離成液滴；

分步驟3：將上述液滴逐滴滴入裝有100mmcacl2溶液的petri盤中進而形成微球；

分步驟4：將上述微球置于37℃環境下孵育45分鐘從而完成交聯；

分步驟5：采用dmem清洗上述微球，清洗三遍。

本發明所提供的方法有益效果是：利用rgd修飾的藻酸鹽所具有的獨特的三維支架結構，并添加有tfg-β1配體，包被著牙源性間充質干細胞，產生最佳的軟骨再生效果，有望應用于顳下頜關節盤的重建和四肢骨骼修復。這種材料能夠支持pdlscs和gmscs在體內和體外的存活、新陳代謝和成軟骨分化，有望將其運用于顳下頜關節盤的軟骨再生種子細胞。本系統包埋牙源性間充質干細胞容易操作，是一個三維可注射可生物降解的軟骨組織工程細胞運載支架。

附圖說明

圖1是本發明的步驟流程示意圖。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

實施例：參照圖1所示，本發明所提供的一種牙源性間充質干細胞實現軟骨再生的方法包括以下步驟：

步驟1.祖細胞提取和培養

選擇并提取第三磨牙的牙周膜干細胞和牙齦間充質干細胞，要求：18-25歲的健康男性成人，無牙周病史。

為評估克隆形成，在培養皿中植入0.1*10⁶個細胞并培養14天，再用甲苯胺藍染色，將超過50個細胞數的克隆作為一個陽性cfu-f。實驗組選用第四代細胞，人骨髓間充質干細胞作為陽性對照組。

步驟2.細胞流式分析

選取數量約為5*10⁵個第四代細胞，用pe或者fitc鼠單克隆抗人cd34和cd45流式抗體孵育，以及cd73、cd105、cd146、cd166(間充質干細胞表面標志物)或lggs作為同型對照。

步驟3.生物材料的制備

選取高濃度古羅糖醛酸的rgd-coupled藻酸鹽，為提高上述藻酸鹽的生物降解性，將其進行純化處理，以及部分氧化(2％)處理；將上述經過處理后的藻酸鹽與tgf-β1(500ug/ml)充分攪拌混合，濃縮、真空凍干。

步驟4.細胞的包被

將pdlsc和gmsc以及陽性對照的hbmmsc以2*10⁶cells/ml的密度包被在上述藻酸鹽中；采用注射器將藻酸鹽(200ul/h)和大豆油(100ml/h)注入微流體裝置，藻酸鹽被大豆油分離成液滴；將上述液滴逐滴滴入裝有100mmcacl2溶液的petri盤中進而形成微球；將上述微球置于37℃環境下孵育45分鐘從而完成交聯；采用dmem清洗上述微球，清洗三遍。

步驟5.體外釋放研究

加載有tgf-β1(50ug/ml)的藻酸鹽微球在含雙抗(100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素)高糖dmem培養基的中孵育1周(搖床，37℃，48孔板)。在選擇的時間點，使用抗人重組tgf-β1免疫沒臉檢測盒來檢測培養基中釋放的tgf-β1。最后，通過使用10％檸檬酸鈉溶解微球支架，釋放微球中殘留的tgf-β1，然后檢測總的含量。

步驟6.細胞存活率試驗

對包被的mscs染色，鈣黃綠素染活細胞，溴化乙錠染死細胞。活細胞百分比由imagej軟件測量而得。此外，使用mtt試驗檢測mscs的新陳代謝活性。

步驟7.體外成軟骨試驗

將包被的pdlss、gmscs和hbmmscs(每ml藻酸鹽中2*10⁶個細胞)在含有15％fbs，2mml-谷氨酰胺，1％its，100nmdex，100um維生素c，2mm丙酮酸鈉，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素的dmem成軟骨誘導培養基中培養。

經過4周的誘導，4％多聚甲醛固定樣本，制備石蠟切片。成軟骨分化表現為軟骨基質的形成，使用番紅o和甲苯胺藍可以使其陽性著色。因為藻酸鹽的多聚離子會使背景著色增強，所以需先用不含ca²⁺的pbs溶液洗片以在染色前去除交聯的ca²⁺而游離藻酸鹽。

然后使用sox9和二型膠原的一抗免疫標記切片(4℃過夜)，然后用alexa熒光標記的二抗檢測(200倍稀釋率)并用dapi復染。每組包括三個獨立樣本，從每個樣本中隨機選出五個區域，然后用nihimage-j軟件計算這些區域中陽性著色的面積及其所占面積比例。

步驟8.rna提取、逆轉錄和擴增

分別將上述含有tgf-β1和三種細胞的藻酸鹽用人重組bmp-4(100ng/ml)或fgf2(50ug/ml)處理或者不處理。兩周成軟骨誘導后，提取10個藻酸鹽凝膠中所有細胞的rna，使用含50mm檸檬酸鈉脫水劑和80mm氯化鈉的無菌解聚液裂解15-20分鐘，配合輕微攪拌。裂解后，將其在9400g下離心10分鐘，用pbs洗滌離心沉淀，再9400g條件下離心3分鐘。根據trizolreagent試劑說明書的方法，提取總rna。使用superscriptiiicdnasynthesiskit試劑 盒將100ng總rna合成為單鏈cdna。

步驟9.牙源性間充質干細胞介導的體內組織再生

將分別含有上述三種細胞的凝膠系統(約4*10⁶個細胞)植入5個月大的灰黃色裸鼠(nudexidiii(nu/nu))背部皮下(每組n＝5)。8周后處死小鼠，外科取出植入結構及其周圍組織，并通過組織學，組織化學，免疫熒光染色分析樣本。

步驟10.組織學和組織化學評估

將取材樣本用10％福爾馬林溶液固定，升濃度乙醇中脫水，石蠟包埋。制作6um切片。h&e染色每個移植物中隨機選取的4個橫斷面。此外，甲苯胺藍和番紅o染色觀察其新生成的軟骨外基質粘多糖。然后用image-j軟件計算每個切片中隨機5個區域的陽性著色面積及其占總面積百分比。

步驟11.免疫組化和免疫熒光染色

在植入材料3周后處死小鼠，按照上述方法取材，進行免疫組化試驗。切片脫蠟后洗滌干凈，用3％h2o2/methanol浸泡15分鐘以滅活非特異性內生過氧化氫酶。然后一抗孵育1小時(200-300倍稀釋率)。然后使用抗bmp4和抗fgf-2進行免疫組化染色，并配合蘇木素復染。

選取植入后8周的樣本進行免疫熒光染色，先用3％h2o2處理然后用封閉劑封閉抗原(1％bsaand0.25％tritonx-100inpbs)。然后用鼠抗兔二型膠原抗體和sox9抗體在100倍稀釋率下孵育，然后用alexafluor熒光二抗孵育，并配合dapi復染。

步驟12.數據分析

獨立雙尾student’st檢驗或方差分析處理數據，數值均用均值+標準差表示。

結果分析：

1.牙源性間充質干細胞的體外特征

cfu-f實驗用于評估新提取干細胞的克隆形成能力。結果顯示pdlscs和gmscs較hbmmscs有顯著更多的單克隆細胞群。然后，流式細胞分析用于檢測提取的細胞是否為干細胞，結果表明，人pdlscs和gmscs均表達間充質干細胞特異性標記物如cd73，cd105，cd146和cd166，而且不表達造血干細胞特異性標記物比如cd34和cd45。證明上述三種牙源性間充質干細胞均有干細胞特性。

2.藻酸鹽微球載體能保持間充質干細胞活性

本實驗開發的藻酸鹽微膠囊系統能誘導pdlscs和gmscs的成軟骨分化，并使用hbmmscs作為陽性對照。現今研究中，rgd耦合藻酸鹽微膠囊中包被的干細胞平均直徑為327um，顯微成像顯示其有統一的微球大小和細胞分布。在發揮功能的時間段內，兩種材料釋放的tgf-β1沒有明顯差異，且兩種釋放都屬于一級藥動曲線型。

細胞活性試驗顯示在體外培養4周后，微球中的間充質干細胞仍具有較高的存活率。而且，定量檢測細胞毒性和活性的mtt試驗也顯示了微球中的間充質干細胞有較高的mtt吸收率，證明這些干細胞在2周的常規介質中培養后仍有較高的代謝率和細胞活性。這些結果顯示了我們的生物可降解藻酸鹽微球能很好地維持上述三種細胞的活性。而且，在有rgd耦合的材料中，常規介質培養14天后，比沒有rgd耦合的材料，干細胞有更高的活性。

3.牙源性間充質干細胞的體內成軟骨分化

4周成軟骨誘導后，番紅o和甲苯胺藍染色能檢測到上述三種細胞外蛋白多糖的沉積。符合預期的是，有rgd耦合的材料中能看到更多的蛋白多糖沉積(甲苯胺藍染色)。此外，與組化染色結果符合的是，免疫熒光染色結果也顯示了上述三種干細胞均分泌二型膠原。有趣的是，半定量分析顯示pdlscs相比hbmmscs和gmscs有更多的軟骨生成，而且在后兩種細胞中沒有顯著差異。

然后，用rt-pcr鑒定和比較成軟骨基因(sox9和二型膠原)的表達水平。sox9是成軟骨分化通路中必需因子，并誘導了colii基因表達的上調。在增殖的軟骨細胞中能看到sox9基因大量表達。試驗結果顯示三種干細胞均豐富表達colii和sox9。pdlscs比其余兩種干細胞有顯著更高的表達，后兩種細胞之間的colii和sox9表達無統計差異。并且，補充了bmp-4或fgf2后的微球系統能使sox9和colii表達輕微上調。

4.源性間充質干細胞對軟骨組織再生的作用

本研究的藻酸鹽凝膠材料的促間充質干細胞成軟骨分化能力是通過在裸鼠皮下植入材料后異位成軟骨來評估。甲苯胺藍和番紅o染色證明了此三種間充質干細胞均能成軟骨分化。在材料中的這些細胞均表現了典型的軟骨細胞樣的圓形形態。作為對照，僅有藻酸鹽凝膠的材料無任何成軟骨陽性特征。移植后8周，colii和sox9免疫熒光染色顯示了軟骨組織大量產生和沉積。pdlscs材料組中colii的產量更多，gmscs和hbmmscs較少且無差異。h&e染色結果顯示，在有間充質干細胞的材料中，人軟骨細胞形態的圓形細胞群存在，而在無細胞的材料中未發現。后期為了更加深入地鑒定間充質干細胞介導的成軟骨，采用了免疫熒光技術，結果顯示在早期成軟骨分化時期(移植后3周)生長因子bmp-4和fgf2陽性表達，意味著tgf-β1在軟骨形成中扮演著重要的角色。