一種人工硬脊膜及其制備方法和使用方法
【專利摘要】本發明提供了一種人工硬脊膜及其制備方法和使用方法。所述人工硬脊膜具有雙層結構，包括內層和外層，所述內層是有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，所述外層是無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，所述內層和所述外層連接。屬于生物醫學【技術領域】。采用本發明提供的人工硬脊膜，能夠實現硬脊膜再生以及達到預防硬膜外瘢痕及粘連的目的，并且能夠顯著減少術后腦脊液漏發生率。
【專利說明】一種人工硬脊膜及其制備方法和使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫學【技術領域】，具體涉及一種人工硬脊膜及其制備方法和使用方法。
【背景技術】
[0002]硬脊膜損傷在脊柱外科及神經外科手術中較為常見。創傷、椎管內腫瘤切除、硬脊膜發育不良、硬膜骨化、累及椎管內的手術等均可造成硬脊膜的破裂或缺損，導致腦脊液外滲，處理不當會引發腦脊液漏、低顱內壓綜合征、急性氣道阻塞、腦脊液囊腫、粘連性蛛網膜炎、椎管感染及顱內感染等多種嚴重并發癥，甚至可危及生命。此外，對于涉及椎板開窗或切除減壓等可造成術后硬脊膜裸露的手術，術后硬膜外瘢痕形成將導致硬膜外粘連，尤其是合并硬脊膜破裂或缺損時，將會進一步加重瘢痕形成及粘連程度，極不利于二次翻修手術，且可形成新的壓迫而誘發神經癥狀。目前臨床上治療的重點仍然是硬脊膜損傷或缺損后如何能減少腦脊液漏的發生，以及腦脊液漏發生后的治療。治療的方法很多，但治療療程長，患者痛苦大，痊愈的標準也僅僅是腦脊漏停止，組織愈合的形式也以疤痕組織為主，而非主動的修復。因此，尋求理想的硬脊膜修復材料，對硬脊膜缺損進行“高質量”修復，實現硬脊膜再生以及預防硬膜外瘢痕及粘連，是目前亟待解決的問題。
[0003]目前已有一些人工硬脊膜,其中一種PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜的制備方法是:將分子量為50000的PLGA多聚物溶解于氯仿中，加入粒徑為80-100微米的氯化鈉晶體，干燥后，雙蒸水浸泡脫去氯化鈉晶體，再真空干燥至恒重。得到多孔PLGA膜，再將I型膠原和殼聚糖混合溶液復合到多孔的PLGA膜表面，得到PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜。在進行修復缺損的硬脊膜時，采用α-氰基丙烯酸酯作為膠黏劑。由于其為PLGA鹽析膜，生物支架孔徑大、有致密層、不透氣，不利于營養物質和代謝產物的交換，且PLGA鹽析膜無取向性，不利于新生膠原的排列，修復并改建后的缺損處硬脊膜三維結構與天然硬脊膜不同，會導致瘢痕及粘連。采用膠原，具有抗原活性及潛在致病原傳染等風險，手術中采用的膠黏劑α-氰基丙烯酸酯粘度低耐水性差`，且有一定的毒性。并且PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜為單層設計，在植入體內修復硬脊膜缺損時，膠黏劑在涂抹以及粘貼過程中，膠黏劑與腦脊液有直接接觸以及人為封閉膜體的風險。因此，這種方法制備得到的人工硬脊膜僅可實現修復硬脊膜缺損，而不能實現硬脊膜的再生，且容易產生硬膜粘連及瘢痕。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種人工硬脊膜，用于解決硬脊膜的再生以及硬膜外瘢痕及粘連的問題。
[0005]所述人工硬脊膜具有雙層結構，包括內層和外層，所述內層是有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，所述外層是無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，所述內層和所述外層連接。天然硬脊膜具有特定的空間結構，是由有序排列的膠原纖維束組成，本發明提供的人工硬脊膜的所述內層采用有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，與天然硬脊膜空間結構具有相似性，用作組織工程支架促使種子細胞(成纖維細胞)接種后所合成的膠原束也呈取向性分布，使新生組織接近天然硬脊膜；所述外層起強化力學性能作用，并預防硬脊膜外粘連及瘢痕形成。并且聚乳酸/乙醇酸共聚物是一種可降解的生物高分子材料，具有易于加工成形、生物相容性好以及力學性能佳等優點。
[0006]進一步地，所述內層和所述外層采用膠黏劑粘合，所述膠黏劑采用生物膠黏劑。有些部位的硬脊膜缺損，直接縫合修復很困難，采用膠黏劑粘合能夠解決此問題。生物膠黏劑具有生物相容性好的特點，使人工硬脊膜在植入體內時排異作用較小。
[0007]進一步地，所述生物膠黏劑采用貽貝粘蛋白，貽貝粘蛋白的粘合力及防水性能極強且無毒性，能將外層和內層牢固粘合成一體。
[0008]進一步地，所述無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜是在無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜表面涂上殼聚糖涂層。殼聚糖作為一種可吸收的生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，無刺激性、無免疫原性、無熱原反應，具有抑制成纖維細胞聚集的作用。利用殼聚糖作為功能性涂層，可預防或減輕術后的硬脊膜外粘連及瘢痕形成。
[0009]進一步地，所述有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和所述無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是用靜電紡絲技術制備的。靜電紡絲技術是一種新型的組織工程多孔支架制備方法，可以制成直徑在微米、甚至納米尺度的超細纖維，用此方法制備得到的有取向性的以及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是是由納米級別的纖維絲組成，具有多孔的結構，極高的表面積，有利于細胞的粘附和生長。
[0010]本發明還提供了一種上述人工硬脊膜的制備方法，包括以下步驟: [0011](a)分別制備有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜；
[0012](b)將所述步驟(a)中的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜加上殼聚糖涂層，得到無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜；
[0013](C)用膠黏劑將步驟(a)得到的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜與步驟(b)得到的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜粘合到一起。
[0014]進一步地，所述步驟(a)中制備有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是采用靜電紡絲技術，所述靜電紡絲技術采用聚乳酸乙醇酸共聚物溶液作為紡絲液制備聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜。靜電紡絲技術具有如下優點:對設備和環境要求不高，易于實現；溶劑在紡絲過程中揮發較徹底；可在常溫下進行，可避免高溫引起的支架變形、聚合物降解等情況，且有利于一些生物活性因子的復合；制備過程中不需使用致孔劑，不會出現致孔劑去除不全的問題，且空隙間貫通性好。靜電紡絲技術是一種新型的組織工程多孔支架制備方法，可以制成直徑在微米、甚至納米尺度的超細纖維，用此方法制備得到的有取向性的和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是由納米級別的纖維絲組成，具有多孔的結構，極高的表面積，有利于細胞的粘附和生長。
[0015]進一步地，所述聚乳酸乙醇酸共聚物是乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物，此種比例的聚乳酸乙醇酸共聚物降解速度較合適，用此比例聚乳酸乙醇酸共聚物制備得到人工硬脊膜更適于在體內應用。[0016]進一步地，所述紡絲液的溶質質量與溶液體積比為1: 5，紡絲液的濃度較合適，制備出來的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜力學性能較好，且組成所述聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的纖維絲直徑與天然硬脊膜膠原直徑相當，更適于使用。
[0017]本發明還提供了上述的人工硬脊膜的使用方法，用于解決人工硬脊膜在使用時膠黏劑在涂抹以及粘貼過程中，膠黏劑與腦脊液可能會直接接觸以及人為封閉膜體，以及需要嚴格控制人工硬脊膜的修剪形狀，操作困難的問題，包括以下步驟:
[0018](a)在缺損口區先覆蓋一層比缺損口大的所述的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜；
[0019](b)再剪一塊比步驟(a)中大的所述的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，涂抹粘合劑，然后覆蓋在先前有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的表面。
[0020]相對于將人工硬脊膜修剪后，周邊涂抹膠黏劑，直接與缺損口周緣硬膜粘成一體，實現有效封閉硬脊膜囊的方法，本發明提供的方法可操作性更強，不需要嚴格控制人工硬脊膜的修剪形狀，更易操作，并且膠黏劑不會與腦脊液直接接觸且不會人為封閉膜體。
[0021 ] 本發明提供了一種人工硬脊膜，具有雙層結構，包括內層和外層，所述內層是有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，所述外層是無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，所述內層和所述外層采用膠黏劑粘合。采用本發明提供的人工硬脊膜，其有益效果是:能夠實現硬脊膜再生以及達到預防硬膜外瘢痕及粘連的目的。
[0022]本發明還提供了一種上述人工硬脊膜的制備方法，制備得到的人工硬脊膜較好，適于使用。
[0023]本發明還提供了一種上述人工硬脊膜的使用方法，本發明提供的方法可操作性更強，不需要嚴格控制人工硬脊膜的修剪形狀，更易操作，并且膠黏劑不會與腦脊液直接接觸且不會人為封閉膜體。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1是本發明實施例提供的靜電紡絲裝置示意圖；
[0025]圖2是本發明實施例提供的人工硬脊膜的結構示意圖；
[0026]圖3是本發明實施例1提供的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的掃描電鏡放大1200倍的圖片；
[0027]圖4是本發明實施例1提供的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的掃描電鏡放大4000倍的圖片；
[0028]圖5是本發明實施例1提供的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的掃描電鏡放大1200倍的圖片；
[0029]圖6是本發明實施例1提供的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的掃描電鏡放大4000倍的圖片；
[0030]圖7是本發明實施例6山羊硬脊膜術后三個月硬脊膜修復區采用蘇木精-伊紅染色的光鏡放大20倍的圖片；
[0031]圖8是本發明實施例6山羊硬脊膜術后三個月硬脊膜修復區采用蘇木精-伊紅染色的光鏡放大40倍的圖片；[0032]圖9是本發明實施例6山羊硬脊膜術后三個月新生硬脊膜腦脊液側掃描電鏡圖；
[0033]圖10是本發明實施例6山羊硬脊膜術后三個月新生硬脊膜背離腦脊液側掃描電鏡圖；
[0034]圖11是本發明實施例6山羊硬脊膜術后三個月硬脊膜修復區的透射電鏡圖；
[0035]圖12是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月硬脊膜修復區采用蘇木精-伊紅染色的光鏡放大20倍的圖片；
[0036]圖13是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月硬脊膜修復區采用蘇木精-伊紅染色的光鏡放大40倍的圖片；
[0037]圖14是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月新生硬脊膜腦脊液側掃描電鏡圖；
[0038]圖15是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月新生硬脊膜背離腦脊液側掃描電鏡圖；
[0039]圖16是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月新生硬脊膜硬膜外腔外層內膜掃描電鏡圖；
[0040]圖17是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月新生硬脊膜的橫截面的透射電鏡圖；
[0041]圖18是本發明實施例6山羊硬脊膜術后六個月新生硬脊膜的縱截面的透射電鏡圖。
【具體實施方式】
[0042]下面通過具體的實施例并結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。
[0043]實施例1:
[0044]參閱圖1，有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的制備:
[0045]根據配方稱取聚乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物，分子量100000，購買于山東濟南岱罡生物材料有限公司)，配制體積比為1:1的THF和DMF混合溶液，用上述5mL混合溶液溶解聚乳酸/乙醇酸共聚物配成溶質質量與溶液體積比為1:5的聚乳酸/乙醇酸共聚物溶液，攪拌一晝夜后作為紡絲液。將制備得到的紡絲液裝入注射器6中，高壓電源I的正極3和紡絲溶液相連，高壓電源I的負極2和接收板4相連，紡絲電壓穩定在13-15kV。接收板4和針頭7之間的距離固定在12cm，接收板4用錫箔包被。溶液推進速度為0.6mL/h，用動力裝置5控制接收板4的水平移動和旋轉，接收板4的水平移動速度為0.00147mm/s。紡絲時接收板4旋轉速度設置為2500r/s，使收集的纖維取向性一致，可制成有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜。有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜與天然硬脊膜的空間結構相似。
[0046]無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的制備:
[0047]根據配方稱取聚乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物，分子量100000，購買于山東濟南岱罡生物材料有限公司)，配制體積比為1:1的THF和DMF混合溶液，用上述5mL混合溶液溶解聚乳酸/乙醇酸共聚物配成溶質質量與溶液體積比為1:5的聚乳酸/乙醇酸共聚物溶液，攪拌一晝夜后作為紡絲液。將制備得到的紡絲液裝入注射器6中，高壓電源I的正極3和紡絲溶液相連，高壓電源I的負極2和接收板4相連，紡絲電壓穩定在13-15kV。接收板4和針頭7之間的距離固定在12cm，接收板4用錫箔包被。溶液推進速度為0.6mL/h，用動力裝置5控制接收板4的水平移動，接收板4的水平移動速度為0.00147mm/s。紡絲時固定接收板4，即靜置下制備靜電紡絲膜片，使收集的纖維任意雜向，可制成無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜。
[0048]無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜的制備:
[0049]配制20g/L的殼聚糖溶液，高溫滅菌。取無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，放置于培養皿底部，紫外線消毒30分鐘，75%的酒精中浸泡消毒20min。用負壓吸引器將材料中的培養液吸干后將殼聚糖溶液均勻滴于無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜上，置于真空干燥箱晾干后用4°C的磷酸鹽緩沖液和去離子水反復沖洗，晾干后待用。膜片用Co60照射滅菌，劑量為20kGy。殼聚糖作為一種可吸收的生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，無刺激性、無免疫原性、無熱原反應，已廣泛用于人體內植入，具有抑制成纖維細胞聚集的作用。利用殼聚糖作為功能性涂層，可預防或減輕術后的硬脊膜外粘連及瘢痕形成。
[0050]實施例2:制備有取向性以及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，采用乳酸與乳酸與乙醇酸的物質的量之比為70:30、分子量為80000的共聚物，其余操作同實施例I。
[0051]實施例3:制備有取向性以及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，采用乳酸與乳酸與乙醇酸的物質的量之比為85:15、分子量為120000的共聚物，其余操作同實施例I。
[0052]實施例4:制備有取向性以及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，根據配方稱取聚乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物，分子量100000，購買于山東濟南岱罡生物材料有限公司)，配制體積比為1:1的THF和DMF混合溶液，用上述5mL混合溶液溶解聚乳酸`/乙醇酸共聚物配成溶質質量與溶液體積比為3:20的聚乳酸/乙醇酸共聚物溶液，攪拌一晝夜后作為紡絲液，其余同實施例1。
[0053]實施例5:制備有取向性以及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，根據配方稱取聚乳酸/乙醇酸共聚物(乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物，分子量100000，購買于山東濟南岱罡生物材料有限公司)，配制體積比為1:1的THF和DMF混合溶液，用上述5mL混合溶液溶解聚乳酸/乙醇酸共聚物配成溶質質量與溶液體積比為5:20的聚乳酸/乙醇酸共聚物溶液，攪拌一晝夜后作為紡絲液。其余同實施例1。
[0054]如圖3、4、5、6所示，用掃描電鏡觀察實施例1提供的有取向性的及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜。有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜是由有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維絲組成,纖維絲直徑介于500nm-1200nm之間，平均直徑為835±102nm。無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜是由無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維絲組成,纖維絲取向具有隨機性,纖維絲直徑介于300nm-800nm之間，平均直徑為512±85nm。天然硬脊膜膠原的纖維直徑在400nm-1000nm之間，與本發明實施例I提供的有取向性的及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜所含纖維絲的直徑相接近。
[0055]通常情況下，吸水性越高，親水性越好，生物相容性也越好。實施例1提供的有序及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜吸水率分別為48.5±4.3%和46.5±3.1%，PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜的吸水率要小于30.70±5.51%，而且殼聚糖的吸水率為77.8%，因此本發明實施例1提供的人工硬脊膜的吸水率要大于原有的PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜的吸水率，從而生物相容性也要比原有的PLGA/I型膠原/殼聚糖人工硬脊膜要好。
[0056]用腰椎穿刺測定人臥位時腦脊液壓范圍是:7.84-11.8kPa，站立位時腦脊液壓用正常的腦脊液壓+頭顱及椎管高度的靜水壓來代替，頭顱及椎管的高度用正常人的坐高即身高的一半來代替，算出一米八高的成年男子站立位時的最大腦脊液壓力為11.8 + 88.2=IOOkPa0實施例1提供的有取向性的及無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜抗
拉強度測試結果如下表:
[0057]
【權利要求】
1.一種人工硬脊膜，其特征在于:所述人工硬脊膜具有雙層結構，包括內層和外層，所述內層是有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜，所述外層是無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，所述內層和所述外層連接。
2.根據權利要求1所述的人工硬脊膜，其特征在于:所述內層和所述外層采用膠黏劑粘合，所述膠黏劑采用生物膠黏劑。
3.根據權利要求2所述的人工硬脊膜，其特征在于:所述生物膠黏劑采用貽貝粘蛋白。
4.根據權利要求1所述的人工硬脊膜，其特征在于:所述無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜是在無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜表面涂上殼聚糖涂層。
5.根據權利要求4所述的人工硬脊膜，其特征在于:所述有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和所述無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是用靜電紡絲技術制備的。
6.根據權利要求1所述的人工硬脊膜的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: Ca)分別制備有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜； (b)將所述步驟(a)中的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜加上殼聚糖涂層，得到無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜； (C)用膠黏劑將步驟(a)得到的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜與步驟(b)得到的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜粘合到一起。
7.根據權利要求6所述的人工硬脊膜的制備方法，其特征在于:所述步驟(a)中制備有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜和無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜都是采用靜電紡絲技術，所述靜電紡絲技術采用聚乳酸乙醇酸共聚物溶液作為紡絲液制備聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜。
8.根據權利要求7所述的人工硬脊膜的制備方法，其特征在于:所述聚乳酸乙醇酸共聚物是乳酸與乙醇酸的物質的量之比為80:20的共聚物。
9.根據權利要求7所述的人工硬脊膜的制備方法，其特征在于:所述紡絲液的溶質質量與溶液體積比為1:5。
10.一種根據權利要求1所述的人工硬脊膜的使用方法，其特征在于:包括以下步驟: Ca)在缺損口區先覆蓋一層比缺損口大的所述的有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜； (b)再剪一塊比步驟(a)中大的所述的無取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物-殼聚糖納米纖維膜，涂抹粘合劑，然后覆蓋在先前有取向性的聚乳酸/乙醇酸共聚物納米纖維膜的表面。
【文檔編號】A61F2/44GK103480042SQ201310473263
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月11日 優先權日:2013年10月11日
【發明者】于鳳賓, 岑蓮, 陳德玉, 李強, 廖心遠 申請人:于鳳賓, 岑蓮, 陳德玉