專利名稱：受體選擇性淋巴毒素衍生物的制作方法
技術領域：
本發明屬蛋白質工程和制藥領域，具體涉及一種受體選擇性淋巴毒素衍生物及其 制法和用途。
背景技術：
淋巴毒素a (LTa)，也被稱為TNFii，是TNF超家族成員之一，是一類重要的細胞因 子。與TNF相比，LT α的結構和功能與TNF相似，具有相同的受體TNFRI、TNFRII, LTa的 抑制的腫瘤細胞類型略少于TNF，對某些腫瘤細胞的殺傷作用也不盡相同。LT α由有活性的淋巴細胞產生，是25KD的分泌型糖蛋白，LT前體含有205個氨基 酸殘基，其中34個氨基酸殘基編碼信號肽，成熟的LT有171個氨基酸殘基(18kD) (SEQID NO 3)，沒有二硫鍵，第62位為N-連接的糖基化位點(糖基化對其細胞毒活性是非必要 的)，LTa與TNFRI、TNFRII的作用位點集中在三聚體底端的兩個套索區。LTa同三聚體 與TNFRI和TNFRII作用，從而引發信號傳導。TNFRI和TNFRII在細胞分布、分子量、結合配基的親和力和介導的生物學活性等 方面都不相同。TNFRI和TNFRII存在于除紅細胞外的所有類型的細胞中，TNFRI的存在更 普遍。TNFRI受體主要表達于上皮細胞，TNFRII受體主要表達于骨髓細胞，大多數的細胞都 表達這兩種受體，但比例有所不同。TNFRI由455個氨基酸組成，TNFRII由461個氨基酸組 成，都是I型跨膜糖蛋白，均由信號肽、胞外結構區、跨膜結構區和胞漿結構區組成。TNFRI 胞漿區326-413位為死亡區域(death domain，DD)。TNFRI可通過DD結合TNFR相關蛋白， 傳導細胞毒信號，引發細胞調亡。TNFRII的胞漿結構區沒有DD，TNFRII所傳遞的信號主要 局限于免疫系統細胞中，與病毒感染的免疫反應高度相關。TNFRI和TNFRII的胞內部分的 同源性極低，也說明它們有著不同的信號轉導路徑，有著不同的生物功能。兩種受體介導的TNF的生物活性有很大的差異。鼠的TNFa與鼠的TNFRI和TNFRII 的結合力相似，然而人的TNFa只結合鼠的TNFRI，不結合鼠的TNFRII。在致死實驗中，人的 TNFa比鼠的TNFa顯示了較低的致死率，這提示TNFRII對全身毒性有很大的影響。研究證明TNFRII信號對胰島素信號傳導有抑制作用，用抗TNFRII抗體阻斷 TNFRII信號會緩解該信號對胰島素信號傳導的抑制作用。TNFRII信號還在調節血管通透性方面有重要作用。抗TNFRII抗體可以抑制成神 經細胞瘤細胞的增殖，同時對TNF的細胞殺傷活力無影響。在鼠實驗中發現，TNFRII參予 順鉬介導的腎損傷。通過改造TNF與受體的結合區域，獲得對TNFRI具有選擇性的TNF突變體，從而即 保持其對腫瘤細胞的細胞殺傷活性，同時減輕了 TNFRII引起的毒副作用，得到了很好的效 果。LT與TNF體內、體外的抗腫瘤活性不相上下，且毒性更小，半衰期更長，此外LT還有明 顯的化療增敏和放療增敏作用。因此，LT治療腫瘤的臨床應用前景可能會比TNF更好。缺失LT α的N端序列1-27的淋巴毒素衍生物LT α 28_171，目前處于II期臨床階段，顯示出明 確的抗腫瘤作用。然而LT仍然具有一定的毒副作用，治療指數不高，而且對某些腫瘤細胞 的殺傷活力不高，這些都限制了淋巴毒素在醫藥領域的應用。研究證明LT的毒副作用與TNFRII信號相關，TNFRII信號可以激活NFk B，而 NF κ B是重要的炎癥因子，直接引起炎癥反應，同時還能夠激活多重耐藥基因，影響藥物對 腫瘤細胞的療效。TNFRII也能夠與TNFRI競爭配體，導致LT對TNFRII高表達的腫瘤細胞 不敏感，抑制了 LTa的細胞毒活性。目前，臨床上迫切需要具有TNFRI選擇性的淋巴毒素，即保持了淋巴毒素的腫瘤 細胞殺傷活性，同時降低了 LT的毒副作用；使得LT對TNFRII高表達的腫瘤細胞敏感度提 高，能夠應用于更多種類的腫瘤治療；在LT與化療藥物聯合治療中，會有更好的治療效果， 更低的毒副作用。然而，目前尚無令人滿意的對TNFRI具有高選擇性的淋巴毒素。因此，本領域迫切 需要開發新的對TNFRI具有高選擇性且對TNFRII的選擇性極低的淋巴毒素突變體。

發明內容
本發明的目的就是提供一種TNFRI具有高選擇性且對TNFRII的選擇性極低的淋 巴毒素突變體。在本發明的第一方面，提供了一種受體選擇性淋巴毒素突變體，所述突變體在對 應于淋巴毒素天然序列中106-113位的106-113套索結構中，第106、107、109、110、111、 112、或113位氨基酸殘基至少一個氨基酸被替換，和/或在106-113套索結構中插入至少
一個氨基酸，附加條件是108位Y殘基不變；并且所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人 TNFRII的結合能力之比大于10。在另一優選例中，該淋巴毒素突變體與TNFRI的結合能力與野生型LT與人TNFRI 的結合能力之比大于0.1。在另一優選例中，該淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力與野生型LT與人 TNFRII的結合能力之比小于0. 01。在另一優選例中，所述的氨基酸替換是106、107、109、110、111、112或113位氨基
酸被其它氨基酸所替換。在另一優選例中，在106-113位插入1-3個氨基酸(優選酸性或 堿性氨基酸)。在另一優選例中，所述的突變體具有選自下組的突變Q107E ；Q107D ；S106E ；S106D ；Q107R ；Q107N ；Q107E/S106E ；Q107E/S106D ；Q107D/ S106E ；或 Q107D/S106D。在另一優選例中，所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突 變體與人TNFRII的結合能力之比大于100，更佳地大于200。在本發明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它包含安全有效量的人淋巴毒素 突變體和藥學上可接受的載體。在另一優選例中，所述的藥物組合物還含有選自下組的化療劑⑶DP、5_FU、ADM、
4VCR或其組合。在本發明的第三方面，提供了本發明人淋巴毒素突變體的用途，用于制備治療以 下疾病的藥物(a)腫瘤；(b)體內寄生蟲病。在本發明的第四方面，提供了一種制備TNFRI受體選擇性人淋巴毒素突變體的 方法，在天然淋巴毒素序列108位殘基不變，替換106-113位中至少一個氨基酸；或者在 106-113位插入1-3個氨基酸。在本發明的第五方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發明的淋巴毒素突 變體。還提供了一種含有所述的DNA序列的表達載體。還提供了所述表達載體或所述的 DNA序列所轉化的宿主細胞。在本發明第六方面，還提供了一種生產本發明的淋巴毒素突變體的方法，該方法 包括步驟(a)在適合表達的條件下，培養上述的宿主細胞，從而表達出所述的淋巴毒素突變 體；(b)分離純化出所述的淋巴毒素突變體。在本發明的第七方面，提供了一種治療腫瘤或體內寄生蟲病的方法，包括步驟給 需要治療的對象施用安全有效量的本發明的淋巴毒素突變體。


圖1顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Jurkat (白血病)細胞。圖2顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Lovo (結腸癌)細胞。圖3顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷MCF-7 (乳腺癌)細胞。圖4顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷A549 (肺癌)細胞。圖5顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷A375 (黑色素瘤)細胞。圖6顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Hela(宮頸癌)細胞。圖7顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷U937 (組織細胞淋巴瘤)細胞。圖8顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷HL-60 (白血病)細胞圖9顯示了 rhLT突變體對化療藥物⑶DP的增敏作用。圖10顯示了 rhLT突變體對化療藥物5_FU的增敏作用。圖11顯示了 rhLT突變體對化療藥物ADM的增敏作用。圖12顯示了 rhLT突變體對化療藥物VCR的增敏作用。
具體實施例方式本發明人借助分子模擬技術研究LT與TNFRI、TNFRII的作用。經過廣泛而深入的 研究發現，LT序列106-113位套索結構是LT與其受體TNFRI、TNFRII作用緊密但有差異的 結構區域，通過在該套索結構區引入突變，可獲得具有TNFRI選擇性的LT突變體，受體阻斷 實驗證實這些LT突變體與TNFRI的結合能力保持，而結合TNFRII的能力下降至少10倍， 通常至少20倍，較佳地至少100，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000 倍)。細胞學試驗證實，這種TNFRI選擇性LT對多種腫瘤細胞殺傷活力優于野生型rhLT， 對TNFRII高表達的腫瘤細胞敏感性增強，還能夠提高腫瘤細胞對化療藥物如CDDP等的敏感性。如本文所用，術語“淋巴毒素”、“LT”、“LTa ”、“TNFi3 ”可互換使用，意指淋巴毒素 LTa，包括來源于人、鼠、豬、馬或牛的淋巴毒素。較佳地，是人淋巴毒素。此外，淋巴毒素可 以是具有天然野生型序列的LT，也可以是具有突變序列(相對野生型序列而言)的衍生型 或重組的LT。天然的野生型人淋巴毒素TNF α的氨基酸序列示于SEQ ID Ν0:3中。如本文所用，淋巴毒素的氨基酸編號基于野生型的人淋巴毒素(SEQ ID NO 3)。例如，106-113位的套索結構就是淋巴毒素天然序列即SEQ ID NO 3中106-113位的 SQYPFHVP，或相當于天然序列106-113的氨基酸的區域。如本文所用，術語“TNFRI選擇性LT”或“本發明的LT突變體”指這樣的LT突變 體，它與TNFRI的結合能力保持，而結合TNFRII的能力下降至少10倍，通常至少20倍，較 佳地至少100倍，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000倍)。本發明的 LT突變體可含有或不含有起始的甲硫氨酸。如本文所用，Q107E表示107位Gln — Glu突變；Q107D表示107位Gln — Asp ； S106E 表示 106 位 Ser — Glu ；S106D 表示 106 位 Ser — Asp,依此類推。Q107E/S106E 表示 107位Gln — Glu突變且106位Ser — Glu,依此類推。本發明的所述人淋巴毒素突變體包括編碼人淋巴毒素突變體的DNA、RNA或人淋 巴毒素突變體蛋白。在一優選例中，通過氨基酸替換，對106-113區域結構進行微調。例如，用酸性氨 基酸谷氨酸或天冬氨酸替換原有的氨基酸。在另一優選例中，通過在106-113區域，保持108位殘基不變，插入1_3個氨基酸。 例如，在106-113區域插入酸性或堿性氨基酸，尤其是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、天冬酰氨 中的一個氨基酸。在另一優選例中，可用化學修飾方法，在106-113區域引入帶有負電荷的基團。本發明的LT突變蛋白可以這樣進行制備根據已公開的人淋巴毒素的序列來合 成引物，通過PCR法擴增出人淋巴毒素的編碼序列。也可以人工合成人TNFa的編碼序 列。此外，可以對編碼序列進行堿基替換，以利于高表達(例如為了在大腸桿菌中表達，可 以用編碼相同氨基酸的大腸桿菌優選密碼子替換天然密碼子)。然后，以人淋巴毒素的DNA 序列，按本發明中指出的突變形式進行遺傳修飾，進行遺傳修飾的技術是本領域中已知的， 例如可參見“Mutagenesis :a Practical Approach，，，Μ. J. McPherson, Ed. , (IRL Press, Oxford, UK. (1991)，其中例如包括定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(PCR)誘變。在獲得了定點突變后的編碼本發明新突變蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的 表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發 明的新的突變蛋白。在本發明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載 體，然后將編碼本發明新突變蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋 白表達載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影 響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的 分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置 時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動 物細胞。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是大腸桿菌。在本發明的一個實例中，制備本發明LT突變體的方法包括如下步驟i.修飾LT的編碼序列，使其在保持天然淋巴毒素序列108位殘基不變的情況下， 用其它氨基酸替換106-113位中至少一個氨基酸；或者在106-113位插入1_3個氨基酸(如 酸性或堿性氨基酸，優選的是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、或天冬酰氨)；ii.將上述改造的淋巴毒素基因克隆到表達質粒；iii.用上述攜帶淋巴毒素基因的表達質粒轉化宿主細胞；iv.培養被轉化的宿主細胞；v.收集宿主細胞及培養液，分離純化淋巴毒素突變體。本發明的LT突變體適用于治療腫瘤和體內寄生蟲病。代表性的腫瘤包括(但并不 限于)白血病、組織細胞淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、宮頸癌、黑色素瘤、膀胱癌。 代表性的體內寄生蟲病包括(但并不限于)弓漿蟲病。本發明的淋巴毒素突變體可以單獨使用，也可與化療藥物等其他藥物聯合使用， 以便增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。本發明還提供了藥物組合物，它包括有效量的一種或幾種本發明的LT突變蛋白， 以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成 分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起 稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因 此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例 子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、 水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。在另一優選例中，本發明的藥物組合物中還含有額外的化療藥物，如⑶DP、5_FU、 ADM、VCR或其組合。組合物可制成單元或多元劑型。各劑型包含為了產生所期望的治療效應而計算出 預定量的活性物質，以及合適的藥劑學賦形劑。本發明的LT突變體和藥物組合物的給藥方式沒有特別限制，可以通過口服、局 部、非腸道給藥，例如肌肉、靜脈、或皮下注射，或吸入噴霧等方式給藥。優選方式是靜脈注 射給藥。當本發明中的LT突變體以片劑或膠囊形式口服時，劑量對于平均體重60-70公 斤的成人而言在約Iug到IOOOug范圍內，或以注射劑方式非腸道給藥，劑量約為Iug到 500ug，可以每天一次或分幾次給藥。藥物組合物的單元劑量通常包括范圍為lug-500ug的 活性成分，典型地是 lug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、200ug、300ug、400ug、500ug。用本發明組合物治療具體病癥時所用的治療活性成分的數量和給藥方案，取決于 多種因素，包括體重、年齡、性別、必然的醫學癥狀、疾病輕重、給藥途徑及頻率。這可以由醫務人員確定。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如 Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。通用方法(a)突變體的評價1.酶聯免疫吸附測定TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶標板上，將待測LT突變體稀釋至相同濃度上樣與 之結合后，加兔抗LT的酶聯抗體，顯色讀數。比較計算，與野生型LT進行比較，求百分率，推測LT突變體與受體的結合能力變 化，初步篩選與TNFRI:Fc結合力強的突變體進行進一步評價。2. rhLT突變體在體外對L929細胞系的細胞毒活性測定L929細胞作為靶細胞，野生型LT做對照，測定rhLT突變體的體外殺傷腫瘤細胞活 性。每單位活力指淋巴毒素誘導了 50%接種細胞調亡時用的淋巴毒素或淋巴毒素突變體的用里。3.受體結合能力測定L929細胞作為靶細胞，加入淋巴毒素或淋巴毒素衍生物進行殺傷，分別用TNFRI 和TNFRII中和淋巴毒素的殺傷作用，以TNFRI :Fc阻斷待測淋巴毒素突變體對L929細胞殺 傷的IC50與阻斷野生型淋巴毒素對L929細胞殺傷的IC50之比定義為LT與TNFRI受體結 合能力；以TNFRII :Fc阻斷待測淋巴毒素突變體對L929細胞殺傷的IC50與阻斷野生型淋 巴毒素對L929細胞殺傷的IC50之比定義為LT與TNFRII受體結合能力。(b)淋巴毒素突變體的腫瘤殺傷活性在體外檢測各種淋巴毒素突變體對腫瘤細胞的殺傷活性，所使用的腫瘤細胞系包 括Jurkat (白血病)、U937 (組織細胞淋巴瘤)、MKN_45/MGC_863 (胃癌)、MCF_7 (乳腺癌)、 A549 (肺癌)、A375 (黑色素瘤)、T-24 (膀胱癌)細胞等。實施例1野生型LT、LT24_171、LT28_171的制備表達載體構建根據GENBANK中人LT序列(BAA00064)，委托上海生工生物技術服務公司分別全基 因合成編碼LT成熟蛋白第1位至171位、第24位至171位、第28位至171位的野生型LT、 LT24_171、LT28_171 氨基酸序列，并克隆于 pET32a(+)載體(購自 Novagen)的 NdeI 和 HindIII 位點上，獲得重組表達質粒 LT/pET32a(+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)。在大腸桿菌中的表達重組表達質粒LT/pET32a (+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)分別轉化大 腸桿菌BL21 (DE3)，轉化液涂布LB (含氨芐青霉素IOOng/ μ 1)平板。從轉化平板上挑取單 克隆接種于ImL LB培養基中，37°C、250rpm培養3h后，加入IPTG至終濃度0. 5mM，繼續培 養3h。取IOOul表達后的菌液離心收集菌體沉淀，加入50ul SDS樣品制備液，在12. 5%的 PAGE膠中進行電泳檢測。蛋白純化
分別取 LT/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT24_171/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT28_171/ pET32a(+)/BL21(DE3)重組工程菌Iml接種IOOOmlLB (含氨芐青霉素lOOng/μ 1)培養基 中，37°C、250rpm培養5h后，加入IPTG至終濃度0. 5mM，繼續培養4h。收集濕重為5g的菌 體沉淀用PBS洗滌后超聲破碎，離心收集包涵體。用尿素增溶包涵體，用Tri s緩沖液復性。 相繼用Q-S印harose FF離子交換柱層析、Phenyl-S印harose FF疏水層析和CM-S印harose FF離子交換柱層析進行純化。將洗脫液稀釋至蛋白濃度為lmg/ml。分別獲得野生型LT、LT24_171、LT28_171 蛋白 1· 0、3· 5、4· 2 毫克。實施例2突變體rhLT008的制備rhLT008突變體表達載體的構建(I)PCR擴增突變體基因以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107E-R為一對引物進行擴增，獲 得LT008-AB片段，同時以LT-P32D和Q107E-F —對引物進行擴增，獲得LT008-⑶片段。再 取LT008-AB和LT008-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得 含Q107E突變的LT008片段。LT-P32U :5，ACACATATGATG CAC TCT ACC CTG AAA CCG 3，(SEQ ID NO 4)LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO 5)Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 6)Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 7)PCR產物純化后與pMD-18T載體連接，轉化大腸桿菌DH5a，提取LT008/pMD-18T質 粒，正反向進行序列測定。(2)構建rhLT突變體的原核表達載體測序正確的克隆，其質粒用限制酶NdeI和HindIII雙酶消化，亞克隆至pET32a(+) 表達載體的相同位點上，獲得LT008/pET32a(+)重組表達質粒。rhLT突變體在大腸桿菌中的表達重組表達質粒LT008/pET3a (+)轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉化液涂布LB (含氨芐 青霉素lOOng/μ 1)平板。從轉化平板上挑取單克隆接種于ImL LB培養基中，37°C、250rpm 培養3h后，加入IPTG至終濃度0. ImM，繼續培養3h。取IOOul表達后的菌液離心收集菌體 沉淀，加入50ul SDS樣品制備液，在12. 5%的PAGE膠中進行電泳檢測。按實施例1同樣方法純化LT008，獲得LT008蛋白3. 6毫克。實施例3LT006的制備以LT24_171/pET32a(+)質粒為模板，以 LT-P32U 和 S106E-Q107E-R 為一對引物進 行擴增，獲得LT006-AB片段，同時以LT-P32D和S106E-Q107E-F —對引物進行擴增，獲得 LT006-CD片段。再取LT006-AB和LT006-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對 引物進行擴增，獲得全長的含S106E-Q107E突變的LT006片段。PCR引物序列為S106E-Q107E-F :5，CTCTTCTCCGAAGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 8)S106E-Q107E-R :5，GAAGGGGTATTCTTCGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 9)按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT006，獲得LT006蛋白3. 1毫克。實施例4LT009的制備
以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107D-R為一對引物進行擴增，獲 得LT009-AB片段，同時以LT-P32D和Q107D-F —對引物進行擴增，獲得LT009-⑶片段。再 取LT009-AB和LT009-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得 全長的含Q107D突變的LT009片段。PCR引物序列為Q107D-F 5' CTCTTCTCCTCCGACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 10)Q107D-R 5' GAAGGGGTAGTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 11)按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT009，獲得LT009蛋白4. 2毫克。實施例5突變體rhLT057的制備以LT28_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT28_P32U和Q107E-R為一對引物進行擴增， 獲得LT057-AB片段，同時以LT-P32D和Q107E-F —對引物進行擴增，獲得LT057-⑶片段。 再取LT057-AB和LT057-CD混合后為模板，以LT28_P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增， 獲得含Q107E突變的LT057片段。LT28-P32U :5，ACACATATG AAA CCG GCT GCT CAC 3，(SEQ ID NO 12)LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO 5)Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 6)Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 7)按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT057，獲得LT057蛋白3. 1毫克。實施例6LT090的制備以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107R-R為一對引物進行擴增，獲 得LT090-AB片段，同時以LT-P32D和Q107R-F —對引物進行擴增，獲得LT090-⑶片段。再 取LT090-AB和LT090-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得 全長的含Q107R突變的LT090片段。PCR引物序列為Q107R-F 5' CTCTTCTCCTCCCGTTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 13)Q107R-R 5' GAAGGGGTAACGGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 14)按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT090，獲得LT090蛋白3. 3毫克。實施例7LT092的制備以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107N-R為一對引物進行擴增，獲 得LT092-AB片段，同時以LT-P32D和Q107N-F —對引物進行擴增，獲得LT092-CD片段。再 取LT092-AB和LT092-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得 全長的含Q107N突變的LT092片段。PCR引物序列為Q107N-F 5' CTCTTCTCCTCCAACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 15)Q107N-R 5' GAAGGGGTAGTTGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 16)按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT092，獲得LT092蛋白4. 5毫克。實施例8.酶聯免疫吸附測定受體結合狀況TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶標板上，將待測LT突變體稀釋至相同濃度上樣與 之結合后，加兔抗LT的酶聯抗體，顯色讀數。
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比較計算，與野生型LT進行比較，求百分率，推測LT與受體的結合能力表1 與受 體的結合能力評價 結果表明，與LT相比，LT006、LT008、LT009與受體TNFRI的結合力基本保持，而與 TNFRII的結合力極大降低。實施例9. rhLT突變體在體外對L929細胞系的細胞毒活性測定對本實施例中對突變體LT006、008、009進一步測定細胞毒活性。L929細胞1. 5 X IO4細胞/孔接種96孔板，37°C、5 % CO2培養24h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品和放線菌素D (lmg/L)，繼續培養24h后用結晶紫染色法檢測細胞存活情 況。檢測樣品分別為LT國際標準品、N端缺失27個氨基酸的第一代LT原液(LT28_171)、N端 缺失 23 個氨基酸的 LT(LT24_171)和 LT 突變體 LT006、LT008、LT009。一個單位指誘導50%的檢測細胞調亡所需要的LT的量。rhLT突變體在體外對L929細胞系的細胞毒活性測定結果見表2 表2細胞毒性 實施例10. TNFRI和TNFRII活性中和法檢測LT突變體的結合受體能力(1)細胞種板取對數生長期的L929細胞1. 5 X 105/ml，接種96孔培養板中，每孔 IOOul，培養 24h。 (2)樣品稀釋種板次日，將LT突變體和LT標準品配成lng/ml 2倍稀釋TNFRI， 從250ng/ml起稀釋13個稀釋度。將LT突變體和LT標準品配成lng/ml 4倍稀釋TNFRII， 從500，000ng/ml起稀釋13個稀釋度每孔含1放線菌素DIOOOng/ml。繼續培養24h。(3)樣品讀數將96孔板取出，棄去培養液并盡量拍干，用結晶紫染色法檢測細胞 存活情況，酶標儀570nm處比色。(4)結果分析采用PraphPad Prism4. O數據處理軟件的四參數方程進行自動分 析LT標準品濃度的對數值為X軸，0D490值為Y軸，軟件將給出樣品和標準品的半數有效 濃度(IC50)，并繪制“S”形曲線。以阻斷待測淋巴毒素突變體對L929細胞殺傷的IC50與 阻斷野生型淋巴毒素對L929細胞殺傷的IC50之比定義LT的受體結合能力。結果見表3。表3LT各突變體結合TNFRI、TNFRII的能力 表3 的中和實驗結果表明 LT006、LT008、LT009、LT057、LT090、LT092 結合與 TNFRI 的結合能力保持，表明LT006、LT008、LT009與TNFRI的結合力略高于LT ；而與TNFRII的結 合能力降低了 200-40000倍以上，具有了對TNFRI受體的高度選擇性。實施例11. rhLT突變體的體外抑瘤譜rhLT突變體LT008體外殺傷Jurkat (白血病)、U937 (組織細胞淋巴瘤)、MKN_45/ MGC-863 (胃癌)、MCF-7 (乳腺癌)、A549 (肺癌)、A375 (黑色素瘤)、T_24 (膀胱癌)細胞的 能力優于LT。(l)rhLT突變體LT008體外殺傷Jurkat (白血病)細胞Jurkat細胞以1. 0 X IO4細胞/孔接種96孔板，37 °C、5 % CO2培養24h，每孔加 IOOul不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為25ng/ml，繼續培養48h后用MTS染色法檢 測細胞存活情況。檢測的樣品分別為LT、rhLT突變體LT008。結果如圖1 所示，LT 的 EC50 = 8. 385ng/ml, LT008 的 EC50 = 1. 390ng/ml。(2) rhLT突變體LT008體外殺傷Lovo (結腸癌)細胞Lovo細胞以2. 0父104細胞/孔接種96孔板，371、5% CO2培養4h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為2000ng/ml，繼續培養24h后用結晶紫染色法檢測 細胞存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果如圖2 所示，LT 的 EC50 = 5. 171ng/ml ；LT008 的 EC50 = 1. 845ng/ml。(3) rhLT突變體LT008體外殺傷MCF-7 (乳腺癌)細胞MCF-7細胞以1.0X104細胞/孔接種96孔板，37°C、5% CO2培養24h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為20ng/ml，繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞 存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果如圖3 所示，LT 的 EC50 = 1. 773ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 889ng/ml(4) rhLT突變體LT008體外殺傷A549 (肺癌)細胞A549細胞以1. 0X IO4細胞/孔接種96孔板，37°C>5% CO2培養24h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為20ng/ml，繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞 存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果如圖4 所示，LT 的 EC50 = 6. 010ng/ml ；LT008 的 EC50 = 3. 886ng/ml。(5) rhLT突變體LT008體外殺傷A375 (黑色素瘤)細胞A375細胞以1. OX IO4細胞/孔接種96孔板，37°C>5% CO2培養24h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為lOng/ml，繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞 存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果圖5 所述，LT 的 EC50 = 2. 128ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 621ng/ml。(6) rhLT突變體LT008體外殺傷HeLa (宮頸癌)細胞
HeLa細胞以2. 0 X IO4細胞/孔接種96孔板，37°C、5% CO2培養4h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為2000ng/ml，繼續培養24h后用結晶紫染色法檢測 細胞存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果圖6 所述，LT 的 EC50 = 3. 024ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 945ng/ml。(7) rhLT突變體LT008體外殺傷U937 (組織細胞淋巴瘤)細胞U937細胞以2. 5 X IO4細胞/孔接種96孔板，37°C、5% CO2培養24h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為20ng/ml，繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞 存活情況。檢測的樣品分別為LT、LT突變體LT008。結果如圖7 所示，LT 的 EC50 = 2. 174ng/ml ；LT008 的 EC50 = 0. 562ng/ml。(8) rhLT突變體LT008體外殺傷HL-60 (白血病)細胞HL-60細胞以1.0X105細胞/孔接種96孔板，37°C>5% CO2培養4h，每孔加IOOul 不同稀釋度的樣品，放線菌素D終濃度為300ng/ml，繼續培養24h后用MTS染色法檢測細胞 存活情況。檢測的樣品分別為LT、rhLT突變體LT008。結果如圖8 所示，LT 的 EC50 = 2. 263ng/ml ；LT008 的 EC50 = 1. 034ng/ml。實施例12. rhLT突變體對化療藥物的增敏作用(l)rhLT突變體LT008增加K562 (慢性髓原白血病)、U937 (組織細胞淋巴瘤)、 A549 (肺癌)、MCF-7 (乳腺癌)、SW-626 (卵巢癌)細胞對烷化劑類化療藥物CDDP (順鉬) 和CTX (環磷酰胺)的敏感性。K562、U937、A549、MCF-7 和 Sff-626 細胞以 1. OXlO4 細胞 / 孔接種 96 孔板，37°C、 5% CO2培養24h。加藥方案為(a)單加0. lng/ml的LT、LT突變體LT008 ；(b)單加不同濃度CDDP和CTX ； (c)0. lng/ml的LT、LT突變體LT008分別與不同 濃度CDDP和CTX聯合同時加藥；和(d)空白對照價組加等量培養液。繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞存活情況。根據濃度反應曲線，求出加或 不加LT、TNF和LT008化療藥物的半數抑制濃度IC50，并求出增敏倍數(T) = IC50 (單用 化療藥)/IC50 (LT、TNF和LT008聯用化療藥物)結果如圖9 所示，CDDP 組的 IC50 = 7. 96mg/ml ；LT+CDDP 組的 IC50 = 0. 89mg/ml, T = 8. 94 ；LT008+CDDP 組的 IC50 = 0. 12mg/m, T = 66. 33。(2) rhLT突變體LT008增加SW480 (結直腸癌)、MKN-45/MGC-863 (胃癌)細胞對 抗代謝類化療藥物5-FU(5-氟尿嘧啶)和MTX(氨甲蝶呤)的敏感性。SW480 和 MKN-45/MGC-863 細胞以 1. 0 X IO4 細胞 / 孔接種 96 孔板，37 °C、5 % CO2 培養24h。加藥方案為(a)單加不同濃度LT、LT突變體LT008 ； (b)單加不同濃度5-FU和 MTX ； (c)不同濃度LT、LT突變體LT008分別與不同濃度5-FU和MTX聯合同時加藥(d)空 白對照價組加等量培養液。繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞存活情況。結果如圖10 所示，5-FU 組的 IC50 = 40mg/ml ；LT+5-FU 組的 IC50 = 21. 5mg/ml, T = 1. 86 ；LT008+5-FU 組的 IC50 = 2. 3mg/m, T = 17. 39。(3) rhLT突變體LT008增加Jurkat (白血病)、HL-60 (原髓細胞白血病)細胞對 抗生素類化療藥物ADM (阿霉素)的敏感性。Jurkat、HL-60 細胞以 1. 0 X IO4 細胞 / 孔接種 96 孔板，37°C、5% CO2 培養 24h。加 藥方案為(a)單加不同濃度LT、LT突變體LT008 ； (b)單加不同濃度ADM ； (c)不同濃度LT、LT突變體LT008分別與不同濃度ADM聯合同時加藥；(d)空白對照價組加等量培養液。繼 續培養48h后用MTS染色法檢測細胞存活情況。結果如圖11 所示，ADM 組的 IC50 = 1. 07mg/ml ；LT+ADM 組的 IC50 = 0. 98mg/ml, T = 1. 09 ；LT008+ADM 組的 IC50 = 0. 450. 013mg/ml, T = 2. 38。(4)rhLT突變體LT008增加A375 (黑色素瘤),HeLa (宮頸癌)、T_24(膀胱癌)細 胞對植物類化療藥物VCR (長春新堿)的敏感性。A375、HeLa、T_24 細胞以 1. 0 X IO4 細胞 / 孔接種 96 孔板，37°C、5% CO2 培養 24h。 加藥方案為(a)單加不同濃度LT、LT突變體LT008 ； (b)單加不同濃度VCR ； (c)不同濃度 LT、LT突變體LT008分別與不同濃度VCR聯合同時加藥；(d)空白對照價組加等量培養液。 繼續培養48h后用MTS染色法檢測細胞存活情況。結果如圖12 所示，VCR 組的 IC50 = 0. 437mg/ml ；LT+VCR 組的 IC50 = 0. 141mg/ ml, T = 3. 10 ；LT008+VCR 組的 IC50 = 0. 073mg/m, T = 5. 99。上述結果表明，rhLT突變體LT008可顯著增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。討論LT108Y是LT與受體的重要作用殘基。該108Y殘基是高度保守的，該位點的任何 單點突變都會產生LT與TNFR的結合力急劇下降，受體結合能力下降100倍以上。本發明 人對LT108Y所在的套索結構進行了大量的突變研究，證實LT106-113形成的套索結構是 LT與TNFRI和TNFRII的作用緊密且有差異的位置，在此區域的突變可能造成LT對TNFRI 和TNFRII的親和力的發生重大變化，是獲得受體選擇性突變體的理想的研究區域，特別是 LT107位的氨基酸對LT與兩個受體的結合力影響巨大。當LT107位殘基Q突變為E、D、N、R 時就表現出高度的TNFRI的選擇性，受體中和實驗證明了這一點，LT與TNFRII的結合力下 降200-40000倍，而與TNFRI的結合能力基本保持不變；說明此區域的氨基酸性質很重要， LTS106M突變體與TNFRI的結合力有所下降，而與TNFRII的結合力保持，LT109位110位的 突變也對LT與兩個受體的結合產生不同影響，也證明了此區域是獲得受體選擇性LT的重 要研究區域。通過對此區域的改造，可以設計出與兩個受體結合力有差異的LT突變體。與天然rhLT相比，本發明的rhLT具有對TNFRI的選擇性結合，與TNFRII結合能 力降低可高達200-40000倍以上。TNFRI選擇性LT降低了 TNFRII可能引起的毒副作用，具 有更低的全身性毒性；避免了 TNFRII與TNFRI對LT的競爭作用以及sTNFRII對LT的中和 作用，從而對TNFRII高表達的腫瘤細胞的敏感性提高，抑瘤譜系更廣，研究表明TNFRI選擇 性的LT對多種腫瘤細胞的殺傷作用增強，而且與化療藥物聯用治療效果更佳。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
權利要求
一種淋巴毒素在制備增加腫瘤對化療藥物敏感性的藥物的用途，其特征是，所述的腫瘤選自非小細胞肺癌、乳腺癌、喉癌、結直腸癌、子宮頸癌、黑色素瘤或胃癌中的一種。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素包括來源于人、鼠、豬、 馬或牛的淋巴毒素。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的淋巴毒素為來源于人的淋巴毒素及 其衍生物。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素選自LT1-171、 LT24-171、LT28-171、LT008、LT006、LT009 中的一種。
5.如權利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述的淋巴毒素是LT1-171。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化療藥物選自鉬類藥物、蒽環類藥 物、5-FU或絲裂霉素中的一種或其組合。
7.如權利要求6所述的用途，其特征在于，所述的化療藥物為鉬類抗腫瘤藥物。
8.如權利要求6所述的用途，其特征在于，其中所述的化療藥物選自順鉬、環磷酰胺、 5-FU、氨甲喋呤、長春新堿或阿霉素。
全文摘要
本發明公開了一種受體選擇性淋巴毒素突變體，所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力之比大于10。本發明還公開了所述淋巴毒素衍生物的制法和用途。本發明的LT突變體對TNFRI有選擇性結合，與TNFRII結合則大幅降低，因而可減低TNFRII可能引起的毒副作用。
文檔編號A61P35/00GK101890156SQ20101018945
公開日2010年11月24日 申請日期2004年12月24日 優先權日2004年12月24日
發明者劉彥君, 吳勁松, 吳芳, 曹峰, 楊彤, 沈毅珺, 王征, 王海波, 許燕, 譚靖偉 申請人:上海復旦張江生物醫藥股份有限公司;泰州復旦張江藥業有限公司