專利名稱：治療疼痛的活性劑和方法
治療疼痛的活性劑和方法相關申請的交叉參考本申請要求于2008年9月3日提交的美國臨時申請號61/094，0 的權益，該美國臨時申請在此以其整體引入作為參考，用于所有目的。
背景技術：
疼痛是一種包括感官感受的復雜現象，其通常涉及意識到有害刺激或機體傷害。 個體通過各種原因經歷疼痛，從各種日常傷害和疼痛，到更嚴重的損傷或疾病。盡管它引起不愉快，但疼痛是人類和其它動物存在的重要部分；實際上，其對于健康存活是非常關鍵的。疼痛是身體防御系統的一部分，引發精神和生理行為以終止疼痛體驗。其促進了學習，因此將更少地重復疼痛刺激。疼痛激勵生物避開與疼痛相關的有害刺激。初始的疼痛表明傷害在逼近，諸如來自很快即將斷裂的骨頭的疼痛。疼痛還能促進康復過程，因為多數生物將保護受傷區域以避免進一步的疼痛。已發現許多分子介質與疼痛感知相關聯，包括鈉、鉀和鈣離子通道。當今正在使用許多不同的鎮痛藥。實例包括非留體抗炎劑(NSAID)諸如水楊酸鹽、麻醉藥諸如嗎啡、具有麻醉特性的合成藥諸如曲馬朵，以及其他各種藥物。發明概述本發明尤其提供了緩解疼痛的活性劑，其例如包括含有YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)的氨基酸序列，或具有少于10個缺失、替換或插入的該序列的變體，或該序列或變體的擬肽。本發明還包括治療疼痛的方法，包括以有效治療或有效預防疼痛的方案給正在經歷疼痛或有疼痛風險的患者施用本發明的活性劑。任選地，該劑量為lmg/kg以下。任選地，劑量為10_5至lO^g/kg。任選地，該患者沒有經歷選自以下的至少一種疾病或病癥 中風、癲癇、缺氧、CNS的外傷性損傷、阿爾茨海默病以及帕金森病。任選地，該患者沒有或確信沒有罹患這些疾病的任一種。任選地，疼痛位于外周部位。任選地，疼痛位于CNS。任選地，外周地施用該肽或擬肽。任選地，鞘內地施用該肽或擬肽。任選地，通過使該肽或擬肽與N型鈣通道結合實現疼痛的治療或預防。本發明還包括包含tat肽或由tat肽組成的活性劑，其中所述的tat肽具有包含 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2)的氨基酸序列，或具有該序列的少于4個缺失、替換或插入的其變體，或該tat肽或變體的擬肽，治療疼痛的方法，包括以有效治療或有效預防疼痛的方案給正在經歷疼痛或有疼痛風險的患者施用此類肽。任選地，該tat肽沒有與NMDAR 2B 9C 連接。任選地，該tat肽沒有與PSD95-NMDAR相互作用的抑制劑連接。任選地，該tat肽與 NMDAR 2B 9C連接。任選地，所施用的tat肽沒有以可檢測的量進入CNS中。任選地，該方案主要導致N型鈣通道的抑制，而不是PSD-95與NMDAR或NOS相互作用的抑制。附圖簡述

圖1A、B、C 受體結合/抑芾岍究的結果，其評估肽iTat-NI^Bgc (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV, SEQ ID NO 1)抑制多種放射性標記的配體與細胞受體結合的能力。圖2 施用各種肽對DRG神經元的N型鈣離子電流(上圖)或全細胞電流(下圖)的振幅的影響。“之前”即將施用肽之前的鈣電流的常態振幅；Tat-NR2B9c: YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 1) ；1990 =Tat 肽 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)； 1991 肽 2B9c (KLSSIESDV, SEQ ID NO 3)；肽 Tat_NR2B9c :YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1) ；1992 肽 Tat_NR2B9c_AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA，SEQ ID NO :4) ；1993 肽 F-Tat-NR2B9c(FGRKKRRQRRRKLSSIESDV，SEQ ID NO 5) ；1994 肽 Tat_NR2B9c K 至 A :YGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :6) ；1995 肽 F_Tat_NR2B9c K 至 A (FGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :7) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-異構體；1976 : YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中X =正纈氨酸(SEQ ID NO 9) ；1977 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX， 其中X = L-叔丁基-甘氨酸(SEQ ID NO 10)。圖3 :Tat-NR2B9c以劑量依賴的方式逆轉了外周神經受傷后大鼠的疼痛超敏感性。圖3A:與僅用鹽水溶媒治療的大鼠(n = 9只動物，空心柱)相比，用低劑量 Tat-NR2B9c (每只動物IOOpmol ；η = 15只動物；實心柱)治療的動物顯示出疼痛超敏感性的降低(即，升高的縮爪閾值)。星號表明與溶媒對照相比P < 0. 05 ；柱表示平均值士 SEM。 圖3Β 在施用I~at-NR2B9C后0和2小時，Tat-NR2B9c緩解疼痛效果的持續時間(以逆轉疼痛超敏感性的方式測得)，如通過平均縮爪閾值(士SEM)所測得的那樣。在即將施用 Tat-NR2B9c之前(時間=0)測量縮爪閾值，然后在60,90和120分鐘后測量(*表示與t =0相比ρ < 0. 05)。圖3C 靜脈內施用更高劑量的Tat-NR2B9c (10mg/kg i. v.)顯示出對外周神經損傷后的疼痛超敏感性沒有效果。在即將施用Tat-NR2B9c之前(時間=0)測量縮爪閾值，然后在60、90和120分鐘后測量(*表示與t = 0相比ρ < 0. 05)。圖4 各種肽對背根神經節(DRG)神經元N型鈣電流的IC5tl的確定。1990 Tat 肽 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO 2) ；1991 肽 2B9c (KLSSIESDV，SEQ ID NO 3) ； 1992 :T at-NR2B9c-AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA, SEQ ID NO :4) ； 1993 :F-Tat_NR2B9c(FGRKKRRQ RRRKLSSIESDV, SEQ ID NO :5) ；1994 :Tat_NR2B9c K 至 A:YGRKKRRQRRRALSSIESDV，SEQ ID NO 6) ； 1995 :F-Tat-NR2B9cK 至 A(FGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO :7) ；1976 YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中X =正纈氨酸(SEQ ID NO :9) ；1977 YGRKKRRQRRRKLSSIESDX, 其中 X = L-叔丁基-甘氨酸(SEQ ID NO :10) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-異構體。圖5A和5B 在DRG神經元中，Tat_NR2B9c對N型鈣電流的與L型電流相比的選擇性。圖5A顯示Tat-NR2B9c (100 μ Μ)和ω -芋螺毒素(1 μ Μ)對培養的DRG神經元鈣電流的影響。圖5Β顯示在Tat-NR2B9c的存在下(細胞內100 μ Μ), DRG鈣電流的硝苯地平抑制。圖6 :Tat-NR2B9c對N型鈣電流的抑制沒有功能依賴性。通過不同的頻率(0. 07、10、20、50Hz)在一個代表性DRG神經元中記錄電流。如指出的那樣施用Tat-NR2B9c (100 μ M)。電流顯示出強的頻率依賴性減少，并且頻率的升高未增加 Tat-NR2B9c的抑制效果。圖7 通過Tat_NR2B9c對鈣電流的抑制不是電壓依賴性的。在培養的DRG神經元中Ca2+的I-V關系。在存在或不存在10 μ M硝苯地平的情況下施用Tat-NR2B9c(10， 100 μ Μ)。應用50ms電壓鉗逐步地從-40至+50mV從_60mV的保持電位來激發電流。發明詳述I.定義
“融合多肽”指由正常情況下不作為融合肽的氨基酸序列中融合在一起的兩種(或多種)不同的異源多肽組成的復合多肽，即單條連續的氨基酸序列。術語“PDZ結構域”指具有約90個氨基酸的模塊蛋白質結構域，其特征在于與腦突觸蛋白質PSD-95、果蠅分隔連接蛋白質Discs-Large(DLG)、以及上皮緊密連接蛋白質 ZOl(ZOl)的顯著的序列同一性(例如，至少60% )。PDZ結構域也稱為Discs-Large同源重復(“DHR”)和GLGF重復。PDZ結構域一般表現為維持核心共有序列(Doyle, D. Α. , 1996, Cell 85 :1067-76)。示例性的含PDZ結構域的蛋白質和PDZ結構域序列公開于US申請號 10/714，537中，其整體引入本文作為參考。術語“PL蛋白質”或“PDZ配體蛋白質”指與PDZ結構域形成分子復合物的天然存在的蛋白質，或指下述蛋白質其羧基末端，當與全長蛋白質分開表達時(例如，作為3-25 個殘基的肽片段，例如3、4、5、8、9、10、12、14或16個殘基)，形成所述分子復合物。分子復合物可以使用例如在US申請號10/714，537中描述的“A測定法”或“G測定法”在體外觀察或在體內觀察。術語“NMDA受體”或“NMDAR”指已知與NMDA相互作用的膜結合蛋白質。該術語因此包括本申請背景部分中描述的各種亞基形式。此種受體可以是人或非人的(例如，小鼠、 大鼠、兔、猴)°“PL 基序”指能與 PDZ 蛋白的 PDZ 結構域結合的 3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20 或25個連續的氨基酸。例如，可在PL蛋白質C端發現的C末端PL序列(例如，PL蛋白至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20或25個連續(末端殘基)。其他PL基序可在蛋白質內部發現(“內部PL序列”)。"PL肽”是包括與PDZ結構域特異性結合的PL基序、或由該PL基序組成、或以其他方式基于該PL基序的肽。“擬肽”指具有與由天然氨基酸組成的肽基本上相同的結構和/或功能特征的合成化學化合物。擬肽可以完全地包含氨基酸的合成的非天然類似物，或是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。擬肽還可以摻入任何數量的天然氨基酸保守替換位點，只要此種替換基本上不改變模擬物的結構和/或抑制活性或結合活性。多肽模擬成分可以含有非天然結構組分的任何組合，所述非天然結構組分一般來自3個結構組a)非天然酰胺鍵(“肽鍵”)連接的殘基連接基團；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；或c)誘導二級結構模擬，即誘導或穩定二級結構例如β轉角、Y轉角、β折疊、α螺旋構象等的殘基。在包含tat肽和第二治療肽的雙功能肽的擬肽中，tat肽或第二肽或兩者都可以是擬肽。此外，多肽可具有擬肽鍵，諸如N-甲基化鍵(-N(CH3)-CO-)；酯鍵(-C(R) H-C-O-O-C(R)-N-)；酮亞甲基鍵(-CO-CH2-)；氮雜鍵(_NH_N(R)-C0-)，其中R是任意的烷基，例如甲基；碳氮鍵(-CH2-NH-)；羥基亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺鍵(-CS-NH-)； 烯族雙鍵(-CH = CH-)；逆酰胺鍵(-NH-C0-)；肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-),其中R是天然存在于碳原子上的“正常”側鏈。這些修飾可發生在沿著肽鏈的任意鍵上，甚至可同時出現在多處處)。例如，肽可包括酯鍵。多肽還可摻入還原肽鍵，即Ii1-CH2-NH-R2，其中R1和 &是氨基酸殘基或序列。還原肽鍵可作為二肽亞單位引入。此類多肽可對蛋白酶活性具抗性，并且在體內可擁有延長的半衰期。親和元件還可以是類肽(N-取代的甘氨酸)，其中側鏈與沿著分子骨架上的氮原子連接，而不是如在氨基酸上那樣的與α -碳連接。
術語“特異性結合”指2種分子例如配體和受體之間的結合，其特征在于一種分子 (配體)即使在許多其他不同分子的存在下也與另一種特定分子(受體)結合的能力，即在異質的分子混合物中顯示出對一種分子優先于其它分子的結合。配體與受體的特異性結合也可以通過在過量未標記配體的存在下，可檢測標記的配體與受體結合的減少得以證明 (即，結合競爭測定法)。術語“試劑”或“活性劑”通常是具有或可能具有期望活性的化合物。除非另外指出，所述期望活性是治療活性或藥理學活性，諸如緩解或預防疼痛。活性劑包括已經為已知藥物的化合物、藥理學活性已得到鑒定但正在經歷進一步的治療評估的化合物、以及作為待篩選藥理學活性的集合和化合物庫的成員的化合物。例如，活性肽是作為肽的活性劑。活性嵌合劑包含與內化肽連接的活性劑。術語“活性劑”意欲不僅包括所指出的活性劑，而且還包括所指出活性劑的功能活性類似物、變體或衍生物。“內化活性劑”不需要具有治療活性，但可使所連接的治療劑通過細胞內遞送至細胞(和/或跨血腦屏障遞送)。“治療”或“藥理學”的活性是指在篩選系統中展示出活性的活性劑，其表明該活性劑是或可能在預防或治療疼痛或疾病(例如，與疼痛相關的疾病)中有用。該篩選系統可以是體外、細胞、動物或人。盡管可能還需要證實其在治療疾病中的實際預防或治療用途， 但仍然可將活性劑描述為具有治療或藥理學活性。“顯著的”是指指ρ值< 0.05、優選< 0.01且最優選< 0.001。II.概述本發明提供了可用于治療疼痛的活性劑。示例性的活性劑包括肽 Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV, SEQ ID NO 1)，或由肽 Tat_NR2B9c 組成。該肽之前作為通過抑制PSD95與NMDA受體和/或NOS的相互作用而抑制中風或類似病癥的損傷效應的活性劑而描述。本申請提供了顯示Tat-NR2B9c肽在疼痛的緩解中有效的數據。可在低于抑制PSD-95與NMDAR或NOS相互作用所需的劑量的肽劑量下獲得疼痛的緩解。盡管對機制的了解不是實現本發明所需的，但Tat_NR2Bc肽在治療或預防疼痛中的效果似乎是通過不同于抑制PSD-95與NMDAR及NOS相互作用的其他機制。一種可能的機制是通過與N型鈣通道結合。非PSD95介導的作用機制在比之前所描述的治療諸如中風和癲癇的神經疾病的方法更低的Tat-NR2Bc治療劑量下有效，其中所述之前描述的方法涉及用Tat-NR2B9c抑制PSD95的相互作用。III.疼痛在其最寬泛的應用中，“疼痛”是指對經歷疼痛的個體而言高度主觀的經驗現象， 并且通常受到該個體的精神狀態、包括環境和文化背景的影響。“物理”疼痛通常與第三方可感知的刺激相關，其引起實際的或潛在的組織損傷。在這一意義上，根據國際疼痛研究協會(IASP)，疼痛可認為是“與實際的或潛在的組織損傷相關的，或依據此類損傷描述的感官或精神體驗”。然而，疼痛的某些例子沒有可感知的原因。例如，精神性疼痛，包括由于心理因素或時斷時續的綜合征而造成現存身體疼痛的加重，患有精神疾病的人在沒有任何可感知的疼痛原因的證據下所感受到的疼痛。1)疼痛類型疼痛包括傷害性疼痛、神經性/神經源性疼痛、穿透痛、異常性疼痛、痛覺過敏、感覺過敏、觸物感痛、感覺異常、痛覺過度、幻肢痛、心因性疼痛、痛性感覺喪失、神經痛、神經炎。其他的分類包括惡性疼痛、心絞痛疼痛和/或特發性疼痛、復雜區域性疼痛綜合征I、 復雜區域性疼痛綜合征II。疼痛的類型和癥狀不必是互斥的。這些術語意圖如同IASP定義。傷害性疼痛由外周神經的特定感覺傷害感受器針對有害性刺激的反應而引起，其將傷害刺激編碼為動作電位。傷害感受器通常位于Α-δ和C纖維上，其為終止于皮下、腱、 關節中以及體內器官中的游離神經末梢。背根神經節(DRG)神經元提供了外周和脊髓之間的連接位點。信號通過脊髓處理，到達腦干和丘腦部位，并最終到達大腦皮層，在這里其通常(但不總是)引發疼痛的感覺。傷害性疼痛可由可能刺激或損傷組織的許多化學、熱、生物(例如，感染)或機械事件所引起，所述事件通常在引起傷害感受器中痛感活性所需的某最小強度閾值之上。神經性疼痛通常是外周或中樞神經系統的異常功能的結果，它們分別導致外周或中樞神經性疼痛。國際疼痛研究協會將神經性疼痛定義為由神經系統的原發損害或功能失調所引發或引起的疼痛。神經性疼痛通常涉及對神經系統的實際損傷，尤其是在慢性情況下。炎癥傷害性疼痛通常是組織損傷及所導致的炎性過程的結果。神經性疼痛可在任何可觀察的對組織的損傷的表觀愈合后(例如，數月或數年)仍然持續。在神經性疼痛的情況下，來自受影響區域的感覺加工可能變得異常，并且通常不引起疼痛的無害刺激(例如，熱、接觸/壓力)可能會引起疼痛(即，異常性疼痛)，或有害刺激可能引起應答正常疼痛刺激的夸張的疼痛感受(即，痛覺過敏)。此外，通過正常刺激可能引發與電刺痛或沖擊或“手腳發麻”類似的感覺(即，感覺異常)和/或具有不愉快性質的感覺(即，觸物感痛)。穿透痛是現有慢性疼痛的加劇。感覺過敏是由對刺激作出的異常疼痛反應所導致的疼痛綜合征。在多數情況下的刺激是伴隨升高的疼痛閾值的重復，其中所述的疼痛閾值可認為是患者可識別為疼痛的最小疼痛體驗。神經性疼痛的實例包括觸覺異常性疼痛(包括神經損傷后誘導的)、神經痛(例如，皰疹之后(或帶狀皰疹之后)的神經痛、三叉神經痛)、反射交感性營養不良/灼痛(神經外傷)、癌癥疼痛的成分(例如，由癌癥本身或與諸如炎癥的相關病癥引起的疼痛，或由諸如化療、手術或放療的治療所引起的疼痛)、幻肢痛、受壓性神經病變(例如，腕管綜合征)、以及神經病變，諸如外周神經病變(例如，由糖尿病、HIV、慢性酒精濫用、暴露于其他毒劑(包括許多化療劑)、維生素缺乏、以及大量其他醫學癥狀所引起的)。神經性疼痛包括由神經系統在神經損傷后的病理性操作的表達所引起的疼痛，其中所述神經損傷由各種原因引起，例如外科手術、受傷、帶狀皰疹、糖尿病神經病變、腿或臂的截肢、癌癥等。與神經性疼痛相關的醫學癥狀包括外傷性神經損傷、中風、多發性硬化、脊髓空洞癥、脊髓損傷和癌癥等。引起疼痛的刺激通常引發炎性反應，炎性反應本身又能引起疼痛經驗。在一些病癥中，疼痛似乎由傷害感受及神經病因素的復雜混合引起。例如，慢性疼痛通常包括炎性傷害感受疼痛或神經性疼痛，或兩者的混合。最初的神經系統功能紊亂或損傷可能引發神經的炎性介質釋放，并且隨后引發神經性炎癥。例如，偏頭痛可能表示神經性和傷害感受疼痛的混合。此外，肌筋膜疼痛可能是繼發于來自肌肉的痛感輸入，但異常的肌肉活性可能是神經性病癥的結果。2)疼痛的癥狀
患者經歷的疼痛癥狀可能或可不伴隨臨床醫生可辨別的疼痛病癥。相反，疼痛可由臨床病癥來證實，而患者沒有感覺到癥狀。疼痛的癥狀可包括對疼痛的反應，例如，以行為改變的形式。對疼痛的示例性反應包括故意避免疼痛刺激，意欲保護身體或身體一部分不受疼痛刺激的保護反應，意欲最小化疼痛及促進愈合的反應、疼痛交流以及生理反應。交流反應可包括疼痛的發聲，或臉部表情或姿勢的改變。生理反應包括由植物性神經系統或內分泌系統介導的反應，例如，升高的腎上腺素和去甲腎上腺素釋放、增加的胰高血糖素和/或激素和/或皮質激素的輸出。可監測的生理改變包括活動的影響，諸如痙攣、抽搐、麻痹、瞳孔散大、發抖、感覺過敏和/或改變的反射。針對疼痛的生理心血管反應包括血壓的改變、脈搏率和質量的改變、外周循環減少、紫紺和充血。增加的肌張力(聲調)也是疼痛的癥狀。對疼痛作出反應的大腦功能的改變可通過各種技術監測，諸如腦電描記法(EEG)、額部肌電圖描記法(FEMG)或正電子成像術(PET)。疼痛的其他癥狀是牽涉性痛，其為位于引起疼痛的刺激的附近部位或遠離實際部位的疼痛感。通常，當神經在其原點或附近受到壓迫或損傷時，會發生牽涉性痛。在這一情況下，通常在神經發揮功能的區域內感受到疼痛感，即使該損害來自其它部位。常見的實例發生在椎間盤突出中，其中源自脊髓的神經根受到相鄰椎間盤物質的壓迫。盡管疼痛可能從受損的椎間盤本身產生，但是在由該受壓迫的神經發揮功能的區域內(例如，大腿、膝蓋或腳)也能感受到疼痛。傷害感受活性是傷害性疼痛的癥狀。甚至在沒有有意識地察覺疼痛的情況下，傷害性疼痛也可能引發撤回反射和各種自主反應，諸如蒼白、發汗、心搏緩慢、低血壓、頭暈、 惡心和昏厥。IV.活性劑本發明的鎮痛劑包括肽和擬肽。本發明的例證性活性劑是其中tat肽在其C端與 NMDAR 2B 9C融合的嵌合多肽。此類嵌合多肽具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO :1)。也可以使用這一序列的變體和模擬物。一些變體在該例證性序列的任一端具有側翼序列。在每一端的側翼序列通常具有少于20、10或5個氨基酸。如果存在側翼序列的話，在N端，側翼序列可以是來自HIV tat蛋白的其他殘基。側翼序列還可以是通常用于連接兩個肽結構域的類型的連接子氨基酸，例如Gly(kr)4(SEQ ID N0:11), T GEK P (SEQ ID NO :12)、GGRRGGGS(SEQ ID NO 13)或 LRQRDGERP (SEQ ID NO :14)(例如，參見 Tang 等(1996)，J. Biol. Chem. 271，15682-15686 ；Hennecke 等(1998)，Protein Eng. 11， 405-410))。例如，側翼氨基酸的數目不超過10。或者，不存在側翼氨基酸。其他變體具有缺失的殘基。例如，一些變體缺失了 NMDAR 2B 9C(KLSSIESDV, SEQ ID NO 3)的一部分或全部。一些變體缺失了 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)序列的少于 2、3、4、5、6、7、8、9、10 或 11 個殘基。一些變體具有 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)序列的氨基酸替換。優選地，任何替換都是保守的替換，諸如在C端第三個位置由T 替換S。在一些變體中，替換的數目少于2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基。一些變體包括插入的內部氨基酸。此類內部插入的數目通常少于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。優選不替換或缺失帶正電的殘基(例如，Y、R和K)，或者如果替換的話，用其他帶正電的殘基替換它們。 其他活性劑是序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 1)的擬肽，其中用非天然氨基酸替換至少一個殘基和/或用非肽鍵替換至少一個肽鍵。擬肽通常具有與基礎肽類似的電荷分布和三維構型，但是具有升高的穩定性或藥物動力學。本發明的一些活性劑在少于2、3、4、 5、6、7、8、9或10個位點與多核苷酸YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 1)有差異，其中的差異可以是缺失、替換，包括非內部替換。本發明的另一例證性的活性劑是tat肽。tat肽是包括過多呈遞堿性殘基的tat 蛋白的片段，其具有促進所連接的分子攝入細胞或跨過屏障(例如，血腦屏障)的能力。 Tat蛋白在HIV-I、HIV-2和SIV病毒中發現。Tat肽約占據HIV-1 tat蛋白的殘基35-70、 40-65或43-60。在HIV-2和SIV中，tat的這一部分一般相應于HIV-2或SIV tat蛋白的殘基 70-100,75-95 或 78-91。來自 HIV-I 的代表性 tat 蛋白作為 GenBank I. D. 9629358 (NP_057853. 1)提供，其具有以下序列MEPVDPRLEPffKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASL SKQPTSQPRGDPTGPKE (SEQID NO :15)。下劃線部分稱為標準tat肽。該標準tat肽是本發明所使用的優選活性劑。還提供了 tat肽的變體和模擬物。一些活性劑包括tat肽，但是缺乏獨立地具有藥理學活性的其他部分(例如，NMDAR 2B 9C肽)或其他已知緩解疼痛的活性劑。一些變體在該例證性序列的任一端具有側翼序列。在每一端的側翼序列通常具有少于20、10或 5個氨基酸。如果存在側翼序列的話，側翼序列可以是來自HIV tat蛋白的其他殘基，諸如上面提供的序列。側翼序列還可增加其他的功能，諸如NMDA 2B 9c或以下討論的其他鎮痛藥。側翼序列還可以是上面討論的連接子。其他變體具有缺失的殘基。一些變體缺失了 YGRKKRRQRR(SEQ ID NO :16)序列的少于2、3、4或5個殘基。一些變體具有YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)序列的氨基酸替換。優選地，任何替換都是保守替換。任選地，替換保持或增加了存在的帶正電殘基數。在一些變體中，替換的數目少于2、3、4或5個。一些變體包括插入的內部氨基酸。此類內部插入的數目通常少于2、3、4或5個。優選地，不替換或缺失帶正電的殘基(例如，Y、R和K)，或者如果替換的話，用其他帶正電的殘基替換它們。其他活性劑是序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2)的擬肽，其中用非天然氨基酸替換至少一個殘基和/或用非肽鍵替換至少一個肽鍵。擬肽通常具有與基礎肽類似的電荷分布和三維構型， 但是具有升高的穩定性或藥物動力學。本發明的一些活性劑在少于2、3、4個位點與多核苷酸YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)有差異，其中的差異可以是缺失、替換，包括非內部替換。 一些活性劑在單個位點上不同。一些變體包含tat蛋白的至少7、8、9、10或12個連續的氨基酸。一些變體基本上由tat蛋白的一部分組成，或包含tat蛋白的一部分，其中至少約 60%、70%、80%、90%或100%的氨基酸是堿性的(例如，組氨酸(H)、賴氨酸(K)和精氨酸 (R)) ο 一些tat肽包含Tat蛋白的至少7、8、9、10、11、12或13個連續殘基。一些活性劑包含 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2)的至少 7、8、9 或 10 個連續殘基，例如 YGRKK (SEQ ID NO: 17)。一些片段保持了如所述片段的N末端那樣的天然存在的酪氨酸殘基(Y)。可針對攝入細胞的保持、跨血腦屏障的能力、抑制N型鈣通道和/或在動物模型中抑制疼痛的能力篩選上述活性劑。此類篩選的實例在以下描述。優選的活性劑至少具有被攝入細胞的能力和在動物模型中抑制疼痛的能力。一些活性劑還具有抑制N型鈣通道的能力和/或跨越血腦屏障的能力。諸如前文所述的那些肽可任選地衍生化(例如乙酰化、磷酸化和/或糖基化)，以促進與抑制劑的親合力，促進抑制劑跨越細胞膜被轉運的能力，或促進穩定性。作為特定的實例，對其中C-端第三個殘基為S或T的抑制劑而言，可在使用肽之前將該殘基磷酸化。本發明肽可以通過固相合成或重組方法進行合成。擬肽可以使用科學和專利文獻中描述的各種操作和方法進行合成，例如Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman 等(編輯)John Wiley & Sons，Inc.，NY, al-0beidi (1998) Mol. Biotechnol. 9 205-223 ；Hruby(1997)Curr. Opin. Chem. Biol. 1 :114-119 ；Ostergaard (1997)Mol. Divers. 3 :17-27 ；Ostresh (1996)Meth ods Enzymo1. 267 :220_234。本發明的活性劑還可與第二治療劑、或諸如治療劑、標記的第二部分、或第二內化活性劑連接。用于與本發明的方法聯合的其他活性劑的實例在下文描述。除tat 之外的其他內化活性劑的實例包括觸角足內化肽SGRQIKIWFQNRRMKWKKC (SEQ ID N0 18) (Bonfanti, Cancer Res. 57，1442-6(1997))(及其變體)、Penetratin、SynBl 和 3、 Transportan, Amphipathic、HSV VP22、gp41NLS、多聚精氨酸，和以下參考文獻中所述的其他內化月太(Temsamani，Drug Discovery Today,9(23) :1012-1019,2004 ；De Coupade, Biochem J. ,390 :407-418,2005 ；Saalik Bioconjugate Chem. 15 :1246—1253，2004 ;Zhao， Medicinal Research Reviews 24(1) :1-12,2004 ；Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62 :1839-49，2005)(均引入本文作為參考)。兩種或多種活性劑的偶聯可以融合蛋白的形式完成，或通過偶聯或綴合活性劑完成。大量這類活性劑是市售的并由S. S. Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)綜述。交聯活性劑的一些實例包含J-琥珀酰亞胺基 3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)或N，N' -(1，3-亞苯基)二馬來酰亞胺；N，N'-亞乙基-雙-(碘乙酰胺)或具有6至11個碳亞甲基橋的其他這種活性劑(其對巰基相對特異)；和1，5_ 二氟-2，4-二硝基苯(其與氨基和酪氨酸基團形成不可逆的連接)。其他交聯活性劑包括P，P' -二氟_m，m' -二硝基二苯基砜(其與氨基和酚基形成不可逆的交聯)；二甲基己二酸(其對氨基特異)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要與氨基反應)；六亞甲基二異氰酸酯或二異硫氰酸酯，或偶氮基苯基-對-二異氰酸酯(其主要與氨基反應)；戊二醛(其與幾種不同的側鏈反應)和雙-重氮基聯苯胺(其主要與酪氨酸和組氨酸反應)。任選地，鎮痛劑(例如，tat肽)不與另一鎮痛劑或另一治療劑連接或綴合。任選地，鎮痛劑與不是鎮痛劑的另一治療劑綴合。任選地將活性劑(例如，tat肽)與未與其綴合或連接的第二活性劑聯合施用。所述活性劑可同時或在不同的時間聯合施用，例如，在彼此間隔的一小時內、一天內或一周內施用。所述活性劑可以單一制劑一起聯合施用或在分開的制劑中聯合施用。或者，該鎮痛劑不與另一鎮痛劑或其他治療劑進行聯合施用。V.所治療的患者本發明的活性劑可施用于患有上述疼痛或有罹患上述疼痛的風險、和/或一種或多種疼痛癥狀的任何個體。所述個體優選為哺乳動物，諸如人。除人之外的哺乳動物包括靈長類(例如，猴)或嚙齒類(例如，小鼠或大鼠)。所述方法可用于治療或預防患有或未患有并發癥或疾病易感性患者的疼痛。在一些方法中，該患者未罹患興奮性中毒引起的病癥，或最近(例如，在前一小時、一天、一周、 一月或一年)未罹患興奮性中毒引起的病癥。在一些方法中，已知或懷疑該患者患有奮性中毒引起的病癥，但是不知道或不懷疑罹患興奮性中毒的發作，或最近(例如，在前一小時、一天、一周、一月或一年)有興奮性中毒的發作。在一些方法中，已知該患者患有興奮性中毒引起的病癥，但不確信當前經歷由興奮性中毒引起的神經變性或損傷。在一些實施方案中，該患者沒有由興奮性中毒引起的病癥，所述病癥由通過谷氨酸受體介導的興奮性中毒引起，諸如NMDA受體介導的興奮性中毒損傷。此類病癥包括脊髓損傷、中風、外傷性腦損傷以及中樞神經系統(CNQ的神經退行性疾病，諸如多發性硬化、 阿爾茨海默病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、帕金森病、酒精中毒和亨廷頓病。在一些方法中，該患者沒有已知的興奮性中毒介導的神經元損傷。在其他方法中， 該患者沒有罹患由于疾病或病癥引起的疼痛，例如，該患者正經歷由外傷引起的疼痛。在其他情況下，該患者未患有無痛或不引起顯著疼痛的其他醫學病癥。VI.治療方法將本發明的活性劑施用于患有疼痛或有疼痛風險的患者。治療是指施用活性劑， 導致緩解、減少、延緩、抑制和/或預防疼痛或疼痛的至少一種體征或癥狀。治療包括任何的疼痛體征或癥狀的強度和/或持續時間的減少，即使其他體征或癥狀沒有改變或甚至由該治療使得其升高。在治療的預防應用中，將至少一種活性劑施用于和普通人群相比處于升高的發展疼痛的風險或疼痛的至少一種癥狀上升的患者。此類患者包括已知將處于疼痛高風險的患者，例如，將進行手術或罹患與嚴重或慢性疼痛相關的疾病的患者，諸如糖尿病和癌癥。可在疼痛發作或上升或加重之前，以緩解疼痛、降低疼痛風險或延緩疼痛發作的有效量施用活性劑。在治療應用中，將至少一種活性劑施用于懷疑罹患或已經罹患疼痛的患者。例如以終止、或至少減輕疼痛或其并發癥的至少一種癥狀的有效量施用該活性劑。本發明的方法可用于治療或有效預防任何類型的疼痛，包括之前描述的那些及其任何組合。一些方法用于治療或有效預防神經性疼痛，包括中樞神經或外周神經或兩者。一些方法用于治療慢性疼痛，例如，持續超過1、3、6或12個月的疼痛。一些方法用于治療嚴重慢性疼痛。在治療性治療當中，任選地在疼痛發生后盡可能快地開始治療。可以1、2、3、4、8、 16、M小時或更大的時間間隔施用多劑量。給藥還可以是每天地或每周地，或以根據疼痛強度加重的不規則間隔。施用還可以基于連續的，諸如通過輸注。對患有與興奮性中毒相關的并發癥的患者進行疼痛治療時，可在該活性劑治療興奮性中毒神經變性的治療時間窗口之外的時間點施用該活性劑以緩解疼痛。例如，在興奮性中毒發作后約4、5、6、8、12、18、24、48或120小時后施用該活性劑以治療疼痛。可通過測定該活性劑對疼痛的作用來監測患者對施用活性劑(例如，本發明的肽或擬肽)的反應。1)聯合治療本發明的活性劑可與用于治療疼痛和/或用于治療與疼痛相關的潛在疾病的常用活性劑聯合施用。可同時或在不同的時間分開施用該兩種活性劑。或者，兩種活性劑可彼此相連形成雙功能活性劑。A)活性劑的聯合可與本發明的活性劑一起施用的鎮痛劑的一些實例包括芋螺毒素和醋酸普蘭林肽。芋螺毒素包括抑制神經和肌肉的乙酰膽堿受體的α-芋螺毒素；抑制電壓依賴性鈉通道失活的S-芋螺毒素；以及鉀通道的κ-芋螺毒素；抑制肌肉中電壓依賴性鈉通道的μ-芋螺毒素；或優選抑制N型電壓依賴性鈣通道的ω-芋螺毒素(阿坎酸)；以及該天然存在的肽的合成衍生物。優選的芋螺毒素包括ω-芋螺毒素-GVIA、ω-芋螺毒素-MVIIA(也成為SNX-111、齊考諾肽和阿坎酸)、具有比阿坎酸更好的治療指數的 AM336 (ω -芋螺毒素-CVID)、以及huwentoxin-I。其他有用的鎮痛劑包括能與各種疼痛相關受體結合的肽配體、或其活性片段或衍生物。實例包括α-內啡肽、內嗎啡肽-1、內嗎啡肽-2、皮啡肽、β-酪朊嗎啡肽(牛或人)、嗎啡感受素、亮氨酸腦啡肽、甲硫氨酸腦啡肽、 DALDA、以及PL107、P物質、速激肽、神經激肽、前列腺素、緩激肽、血清素、神經營養因子、趨化因子、肉毒毒素、prokineticin以及NKl受體拮抗劑；其一部分描述于US 和US6759520中，其在此全文并入本文作為參考。可與本發明的活性劑一起施用的小分子鎮痛劑的實例包括NSAID、COX 2抑制劑、 C0X-3抑制劑、iNOS抑制劑、PAR2受體拮抗劑、精神抑制劑、阿片類、N-乙酰膽堿受體激動劑、甘氨酸拮抗劑、辣椒素受體拮抗劑、神經激肽拮抗劑降鈣素基因相關肽拮抗劑以及環氧合酶(COX)-抑制性一氧化氮供體(CINOD)。其他鎮痛藥包括甲基嗎啡、維柯丁(Vicodin)、 嗎啡、德美羅、羥可酮、鹽酸丙氧酚和丙氧酚。其他鎮痛藥靶向于任意的以下離子通道或受體鈣通道(例如，L-型和/或 N-型)、酸敏感性離子通道家族(ASIC) (Waldmann等，1997) ；P2X家族的ATP-敏感性離子通道(Chen等，1995 ；Lewis等，1995 ；Chessel等，2005)；傷害感受器特異性TTX-不敏感Na 通道(Nav 1. 8 和 Navl. 9) (Akopian 等，1996 ；Dib-Hajj 等，2002)；辣椒素受體諸如 TRPVl ； 煙堿型乙酰膽堿受體；阿片受體(例如μ、S或κ)受體)；阿片樣受體(例如，0RL-1) ；P 物質通過其起作用的NKl受體；以及細胞外疼痛介質的其他受體，所述介質諸如前列腺素、 緩激肽、血清素、腺苷、神經營養因子、ΑΤΡ、蛋白酶、趨化因子和prokineticin，其活化可引起外周傷害感受器的敏化。B)用于疼痛相關疾病的聯合治療本發明的活性劑(例如，tat肽)還可與用于治療疼痛相關疾病的治療劑聯合施用。該治療劑和鎮痛劑可作為分開的藥物或連接在一起(例如，作為融合蛋白)施用。可在此類聯合治療中使用的治療劑包括醋酸亮丙瑞林、胰島素、催產素、exendin-4，、甲狀旁腺激素、降鈣素、恩夫韋肽、依替巴肽antegrilin)、DDAVP、奧曲肽或醋酸普蘭林肽，或其活性片段或衍生物。許多疾病可與疼痛相關。例如，可導致慢性疼痛的疾病包括糖尿病、關節炎(例如，骨關節炎、類風濕關節炎和青少年慢性關節炎)、癌癥或化療的毒性作用、纖維肌痛、帶狀皰疹、腸易激綜合征、血管問題或鐮狀細胞病。與偶發的一般疼痛相關的疾病包括風濕性多肌痛、臆想病、抑郁癥、糖尿病、 惡性貧血、鐮狀細胞病和梅毒。與神經性疼痛相關的疾病包括神經痛(例如，三叉神經痛、不典型面痛以及由帶狀皰疹或皰疹引起的帶狀皰疹神經痛)、外周的神經病、 Charcot-Marie-Tooth病、弗里德賴希共濟失調、糖尿病(例如，糖尿病性神經病變)、飲食缺陷(尤其維生素B-12)、過度的酒精使用(酒精性神經病變)、尿毒癥(來自腎衰竭)、癌、 艾滋病、肝炎、科羅拉多蜱傳熱、白喉、格-巴二氏綜合征、沒有發展為艾滋病的HIV感染、麻風病、萊姆病、多發性結節性動脈炎、類風濕關節炎、結節病、舍格倫綜合征、梅毒、系統性紅斑狼瘡，以及暴露于有毒化合物。與炎性疼痛相關的疾病包括㈧關節炎疾病，例如類風濕關節炎；青少年慢性關節炎；系統性紅斑狼瘡(SLE)；痛風性關節炎；硬皮病；骨關節炎；銀屑病關節炎；強直性脊柱炎；萊特爾氏綜合征(反應性關節炎)；成年斯蒂爾病；來自病毒感染的關節炎；來自細菌傳染的關節炎，例如，淋病性關節炎和非淋病性細菌性關節炎(膿毒性關節炎)；三級萊姆病；結核性關節炎；以及來自真菌感染的關節炎，諸如酵母病；(B)自身免疫疾病，例如格-巴二氏綜合征、橋本甲狀腺炎、惡性貧血、艾迪生病、I型糖尿病、系統性紅斑狼瘡、皮肌炎、舍格倫綜合征、紅斑狼瘡、多發性硬化、重癥肌無力、萊特爾氏綜合征和格雷夫斯病。(C) 結締組織病，例如脊椎關節炎、皮肌炎和纖維肌痛；(D)損傷引起的炎癥；(E)感染，例如結核病或間質性角膜炎；以及(G)關節炎癥，例如滑囊炎或肌腱炎。頭疼的類型包括肌肉的/ 肌源性頭痛、血管性頭痛、牽引性或炎癥性頭痛、叢集性頭痛、激素性頭痛、反跳性頭痛或慢性鼻竇炎頭痛。軀體疼痛可與以下相關過度的肌肉收縮、反復運動疾病、諸如多肌炎的肌肉疾病、皮肌炎、狼瘡、纖維肌痛、風濕性多肌痛，以及橫紋肌溶解、肌痛、感染諸如肌肉膿腫、旋毛蟲病、流行性感冒、萊姆病、瘧疾、落磯山斑疹熱、禽流感、普通感冒、社會獲得性肺炎、腦膜炎、猴痘、嚴重急性呼吸綜合征、中毒性休克綜合征、旋毛蟲病、傷寒，以及上呼吸道感染。 內臟痛可與諸如以下的疾病相關腸易激綜合征、慢性功能性腹痛(CFAP)、功能性便秘、功能性消化不良、非心臟胸痛(NCCP)和慢性腹痛、慢性胃腸炎，例如胃炎、炎性腸病，例如克羅恩病、潰瘍性結腸炎、微觀結腸炎、憩室炎和腸胃炎；間質性膀胱炎；腸局部缺血；膽囊炎；闌尾炎；胃食管反流；潰瘍、腎結石、尿路感染、胰腺炎和疝。與慢性疼痛相關的許多疾病在PCT公開物WO 07/138336中得以公開，其在此全文引入本文作為參考。VII.藥物組合物、劑量和給藥途徑可以以藥物組合物的形式施用本發明的活性劑。通常在GMP條件下制備藥物組合物。可以以包含下文所示的任意劑量的單位劑量形式(即，用于單次施用的劑量)提供藥物組合物。可以利用常規的混合、溶解、制粒、制備糖錠劑、磨細、乳化、包囊、包埋或凍干方法制備藥物組合物。尤其是，可以將本發明的凍干的活性劑用于下文所述的制劑和組合物中。可以使用一種或多種便于將活性劑加工為可藥用制劑的生理學上可接受的載體、 稀釋劑、賦形劑或輔料，以常規方式配制藥物組合物。適合的制劑取決于所選擇的給藥途徑施用可以是胃腸外、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌內施用。優選靜脈內施用。如果期望的話(例如，疼痛位于身體的特定區域)，可局部地或區域性地將本發明的活性劑施用至該區域，例如，通過肌內注射。可任選地將該活性劑施用于CNS，例如靜脈內或鞘內施用，諸如當疼痛是全身性的或涉及CNS組織時即可如此。還可以這樣的方式施用活性劑，使得該活性劑與外周神經系統(例如，背根神經節)接觸。用于腸胃外施用的藥物組合物優選是無菌和基本上等滲的。對于注射，可將活性劑配制在水溶液，優選生理上相容的緩沖液例如漢克氏溶液、林格溶液或生理鹽水或乙酸鹽緩沖液中(以減少注射部位的不適)。該溶液可以含有配制劑，諸如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。或者，該活性劑可以為粉末形式，用于在使用前用合適溶媒例如滅菌的無熱原水重構。對于經粘膜施用，可以在制劑中使用對于待滲透的屏障合適的穿透劑。這種施用途徑可以用于將化合物遞送至鼻腔或用于舌下施用。對于口服施用，可以用可藥用載體將該活性劑配制為例如片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、漿體、混懸劑等，用于由待治療的患者口服攝取。對于口服固體制劑，例如粉劑、膠囊和片劑，合適的賦形劑包括填充劑例如糖類，諸如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纖維素制品諸如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；制粒劑；和粘合劑。 需要時，可以加入崩解劑，諸如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽諸如海藻酸鈉。 需要時，固體劑型可以使用標準技術進行糖包衣或腸包衣。對于口服液體制劑諸如混懸液、 酏劑和溶液，合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括水、甘油、油、醇。另外，可以加入矯味劑、防腐劑、著色劑等。除先前描述的制劑外，還可將該活性劑配制為儲庫型制劑。此種長效制劑可以通過植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射施用。因此，例如化合物可以用合適的聚合或疏水材料(例如，作為在可接受油中的乳劑)或離子交換樹脂進行配制，或配制為微溶的衍生物，例如微溶的鹽。或者，可以采用其他藥物遞送系統。脂質體和乳劑可以用于遞送活性劑。盡管通常以更大的毒性為代價，但是也可以采用某些有機溶劑諸如二甲基亞砜。另外，化合物可以使用持續釋放系統進行遞送，諸如含有治療劑的固體聚合物的半透性基質。根據其化學性質，持續釋放膠囊可以釋放該活性劑數周直至超過100天。根據治療劑的化學性質和生物穩定性，可以采用用于蛋白質穩定化的其它策略。如果本發明的活性劑含有帶電荷的側鏈或末端，它們可以以游離酸或堿或可藥用鹽的形式包含在任何上述制劑中。可藥用鹽是基本上保留游離堿的生物活性并可以通過與無機酸反應而制備的那些鹽。藥用鹽傾向于在水性和其他質子溶劑中比相應的游離堿形式更可溶。本發明的活性劑以有效達到預期目的的量使用。治療有效量意指活性劑的量足以消除、減少目前正在經歷疼痛的體征和/或癥狀的患者中至少一種疼痛的體征和/或癥狀， 或抑制其惡化。例如，如果與對照未治療患者群體比較，某個量顯著減少在治療的患者(人或動物)群體中的至少一種疼痛體征或癥狀，那么它被視為治療有效的。如果治療的患者個體達到比未通過本發明方法治療的可比較患者的對照群體中的平均結果更有利的結果， 那么該量也視為治療有效的。活性劑的預防有效量是指活性劑的量足以延遲、抑制或阻止患者中的至少一種疼痛體征或癥狀的發展，其中所述患者目前尚未經歷體征和/或癥狀， 但相對于一般群體有升高的發展此種體征和/或癥狀的危險。例如，如果相對于未用該活性劑治療的對照群體，用活性劑治療的有發展疼痛癥狀危險的患者群體出現減少的體征或癥狀，那么該量視為預防有效的。提及有效量意指治療或預防有效量。提及有效方案意指達到如上所述的預期目的所需的有效量和給藥頻率的組合。假設平均體重為7^g，對人合適的劑量通常少于300μπιΟ1，例如少于30μπιΟ1。有時劑量為 0. 03nmol 至 30ymol,例如 0. 03nmol 至 3ymol，或 0. 3nmol 至 600ymol,或 3nmol至60 μ mol，或30nmol至30 μ mo 1。有些劑量范圍包括每個體重為75kg的患者0. 05 至500nmol活性劑的總劑量，任選地為0. 5至50nmol/患者，例如約0. 5、1、2、5、10、20或 50nmol/75kg患者。在一些方法中，每75kg患者的總劑量為1-lOnmol，例如1、5或lOnmol。 在一些情況下，每75kg患者的總劑量可以是0. I-Inmol，例如0. 1、0. 2、0. 5或0. 8nmol。在其他情況下，每75kg患者的劑量可以是lO-lOOnmol，例如20、50、80或IOOnmol0任選地， 每75kg患者的劑量少于2250nmol。任選地，每75kg患者的劑量少于75nmol。可調節劑量， 以適應體重的變化。可將上述劑量通過例如除以75kg而轉換為nmol活性劑/kg體重。可通過乘以活性劑的摩爾質量(例如，Tat-NR2B9c為2519)將劑量從摩爾單位轉化為克單位。在人體中使用的治療劑的合適劑量通常少于10mg/kg，例如少于lmg/kg。 劑量有時為 1(Γ4 至 lmg/kg、1(Γ4 至 0. lmg/kg、1(Γ4 至 20μ g/kg、或 1(Γ3 至 2 μ g/kg、或 10_2 至2μ g/kg，例如50、100、150、200、500、1000或1500ng/kg。有些劑量范圍包括每kg體重 10-200ng活性劑的劑量，諸如每個患者約1、5、10、20、50、80、120、160或200ng/kg。在一些方法中，劑量為2-20 μ g/kg,例如2、4、6、8、10、12、16、18或20 μ g/kg。任選地，該劑量為少于75 μ g/kg。任選地，該劑量為少于2. 5 μ g/kg。每位患者的總劑量可通過將每kg體重的劑量乘以患者體重(以kg為單位)計算得到。例如，75kg患者的總劑量可通過將上述劑量乘以75而計算得到。還可以以需要的藥物代謝動力學參數表示劑量，諸如與所指出的劑量方案、施用頻率和途徑相當的Cmax(即，施用藥物后觀察到的藥物在血液中的最大或“峰”濃度)、C〒
(血液中平均穩態濃度)以及AUC(即，血漿(例如血清或血液)濃度-時間曲線下的面積)。所施用的劑量依賴于所治療的患者、患者的體重、痛苦的嚴重度、施用的方式和處方醫師的判斷。可以在可檢測到癥狀時或甚至檢測不到癥狀時間歇地反復治療。可以單獨或與其他藥物組合提供治療。本發明活性劑的治療有效劑量可以提供治療裨益而不引起實質性毒性。可以在細胞培養物或實驗動物中通過標準的藥學方法測定該活性劑的毒性，例如通過測定LD5tl (群體的50%致死劑量)或LD1C1C1(群體的100%致死劑量)。毒性效應和療效間的劑量比是治療指數。優選顯示高治療指數的活性劑，例如肽或擬肽(參見例如Fingl等，1975，The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11 ) °VIII.鈣通道如上所述，對本發明活性劑在治療疼痛中的功效作出至少部分貢獻的一種機制涉及與N型鈣通道結合，尤其是通過ω-芋螺毒素GVIA阻斷的神經N型通道。任選地，該活性劑與VDCC的α工亞單位結合。N型鈣通道位于突觸前神經末端，調節神經遞質釋放，包括來自初級傳入傷害感受性受體的脊髓末端的那些神經遞質。在藥物齊考諾肽(或I^rialt，其為雞心螺肽ω-芋螺毒素M-VII-A前體的合成形式)方面已經很好地表征了與N型通道結合的藥理學作用。已將與N型鈣通道的結合與多種活性聯系起來，包括比由嗎啡誘導的強得多的鎮痛作用。N型鈣通道是由a1B-(Cav2. 2)、β-和α2 δ-亞基和有時還有γ亞基組成的雜寡聚復合物。α1Β-亞基形成主要通道并由單個基因編碼。存在四種023-亞基基因(α 2 δ-1-α 2 δ -4) (Snutch 等，Molecular properties of voltage-gated calcium channels. In :Voltage_gated calcium(Zamponi G 編輯)，第 61-94 頁。New York :Landes Bioscience,2005. Catterall, Biochemical studies ofCa2+channels. In :Voltage-Gated Calcium (Zamponi G H車t)，H 48—60 胃。NewYork =Landes Bioscience，2005) 。
禾中在N型鈣通道的高度保守性。優選將Williams 等，1992 (Science 257 (5068)，389-395 (1992)，Genebank 登錄號 Q00975,物種人類(Homo Sapiens))和 Coppola 等，1994(FEBS Lett. 338(1)， 1-5(1994) ,Genebank 登錄號 055017，物種小鼠(Mus Musculus))和 Dubel 等，1992 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 89(11), 5058-5062 (1992) Genebank 登錄號 Q02294,物種褐鼠 (Rattusnorvegicus))描述的α 1Β-亞基N型鈣通道用于篩選，包括具有與完整蛋白質相似的鈣通道活性的剪接變體及其片段。在本發明的篩選方法中也可以使用與任何上述序列至少具有90%序列同一性的等位基因變體和物種變體。任選地，α 1Β亞基可與α 2(a-e)/ δ、 β 1-4和/或γ亞基組合使用。IX.篩選方法和測試法可通過多種測試法來測試或確認本發明活性劑的期望活性。通常對活性劑與對照比較來進行平行測試，并且從可檢測的且優選為統計學上顯著的差異(例如，相對于對照更強的結合、更強的細胞攝入、更強的疼痛減少或抑制)看出需要的活性。1.測量對靶標(例如，鈣通道)的結合可使用已知結合此類通道的經標記的肽(例如齊考諾肽)，通過競爭結合測試法， 針對與目標靶點(例如，N-型鈣通道)的結合而篩選活性劑。N型鈣通道可以以純化的形式提供，或從細胞中天然表達或重組表達。如果以純化的形式提供，則可任選地將N-型鈣通道固定在珠子上或微量滴定孔中。與經標記的肽和所測試的活性劑溫育后，和鈣通道結合的標簽的量與所測試的活性劑結合鈣通道的能力成反比。可在微量滴定板的孔中，在高通量基礎上進行該測試法。還可以包括陰性對照和陽性對照。陰性對照可以是溶媒。陽性對照可以是已知結合N-型鈣通道的肽的未標記的形式。2.測量靶標的體外抑制可以針對其抑制靶標活性，例如抑制N型鈣通道介導的離子電流的能力來篩選活性劑。抑制表示鈣通道運載的所測量的離子電流的統計學顯著的降低。所測量電流的這類降低應當大于20%降低，更優選大于30%降低，更優選大于40%降低。可以例如在表達鈣電流的背根神經節神經元中進行全細胞膜片鉗記錄來測量抑制。背根神經節(DRG) 的培養物從妊娠13-14天的Swiss小鼠制備。簡言之，將DRG切片并在37°C進行20分鐘胰蛋白酶消化，將其機械解離并接種在用聚-D-賴氨酸涂覆的蓋玻片上。將其在無血清的 MEM(Neurobasal MEM, B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)巾士音#。 3—5 天后，添加10 μ M FUDR溶液來抑制神經膠質增殖。在潮濕的5% CO2空氣中于37°C下維持培養物，并且一周換液兩次。接種10-14天后在室溫下進行全細胞記錄。電生理學記錄用 Axopatch-IB放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)以電壓鉗模式進行全細胞記錄。使用兩階段鉗(PP83 ；Narishige，東京，日本)，從薄壁的硼硅玻璃(直徑1. 5mm ；World Precision Instruments, Sarasota，FL)構建電阻為 3—5ΜΩ 的記錄電極。使用 pClamp 9 (Axon Instruments)程序將數據數字化、過濾QkHz)并在線獲得。向移液管中填充含有(mM) =CsCl 110、MgCl2 3,EGTA 10,HEPES 10,MgATP 3,GTP 0· 6 的溶液。用 CsOH 將 pH 調節至 7. 2。浸浴溶液(bath solution)在 pH(NaOH) 7· 4 下含有(mM) =CaCl2 UBaCl2 10,HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖10、TTX 0. 0002。使用40ms去極化脈沖，將全細胞電流從_60mV的保持電位激發至+20mV，每1 應用一次。為了測試使用依賴性的抑制，使用IOms去極化脈沖， 將電流從-60mV的保持電位激發至+20mV，分別每0. 02s(50Hz)、0· 05s(20Hz)、0· Is(IOHz) 或15s(0. 07Hz)應用一次。可通過檢查使用該靶標的特定抑制劑的其他抑制來鑒定測試活性劑抑制靶標的性質，如在實施例中描述的那樣。3.體內鎮痛活性評估可針對在動物中預防或緩解疼痛來篩選活性劑。人是哺乳動物的優選類型。還可使用除人之外的其他哺乳動物，諸如靈長類(例如，猴)或嚙齒類(例如，小鼠或大鼠)。哺乳動物(例如，嚙齒類動物)的針對疼痛的傷害感受測試包括甩尾(脊椎介導的傷害性反射)測試(D ‘ Amour 等(1941)，J. Pharmacol. Exp. Ther. 72 :74-79)、熱板試驗、Randall-Selitto 測試(Swingle 等(1971)，Proc. Soc. exp. Biol. Med. 137 :536-538) 以及夾尾試驗。此類測試可用于評估對不同種類的有害刺激的傷害感受閾值，諸如對熱 (甩尾測試、熱板試驗、Hargreaves縮爪測試，以及通過將尾或后爪短暫浸入熱水中)的閾值；或對刺穿刺激的觸覺閾值，例如通過用于異常性疼痛的Von Frey測試，J Neurosci Methods. 1999 Mar 1 ；87 (2) 185-93。可通過用棉簽輕擊后爪的跖面評估動態異常性疼痛， 其中如果動物在開始擊打8秒內對棉花刺激作出反應，則認為存在動態異常性疼痛。可測量針對有害化學試劑的疼痛反應，例如通過腹膜內注射稀醋酸后監測腹部蠕動，以及通過將辣椒素添加至飲用水后的厭飲測試(其可用于評估三叉神經傷害感受性)。用于炎性疼痛的測試包括福爾馬林爪測試(Tjolsen等(1992)，Pain 51 :5_17)、 用于福爾馬林誘導的臉部疼痛測試(Clavelou等(1989)，Neurosci. Lett. 103 :349-353)、 以及施用諸如鹿角菜膠、辣椒素或緩激肽的物質后的爪測試。可通過各種模型模擬關節炎癥狀，包括將例如鹿角菜膠、尿酸或芥末油的試劑或佐劑注射至各種關節中。可通過腹膜內注射諸如緩激肽、乙酰膽堿、醋酸或苯醌的物質來構建內臟疼痛模型。鏈佐星 (STZ)-誘導的糖尿病神經病模型在3周內誘導了可重復的機械性異常疼痛(Chen和Pan， J Neurophysiol 87 :2726-2733,2002) 用于外周神經損傷導致的神經性疼痛的測試包括慢性縮窄性損傷(例如，Bennet 和Xie，坐骨神經結扎模型，Pain 33 :87-107)；部分神經結扎(Seltzer等，1990)、脊神經橫切或結扎(Lombard等，1979 ；Kim & Chung，1992)、神經凍傷(deleo等，1994)、坐骨神經缺血(Kupers等，1998)。常用的測試是觸覺異常性疼痛測試(Chaplan等(1994) J. Neurosci. Meth. 53 :55-63)。紫杉醇誘導的神經性疼痛不含有炎性成分。對某些外周神經性病癥特異的模型包括三叉神經痛(Vos和Maciewicz，1994)、糖尿病神經病(Burchiel等，1985)以及長春新堿神經病(Aley等，1996)的動物模型。神經瘤模型(Wall等，1979)可反映截肢造成的幻痛。由脊髓損傷產生的疼痛的動物模型包括脊髓橫切或部分橫切(Levitt &Levitt, 1981)、輻射誘導的局部缺血模型(Hao等.1991)、采用脊柱內注射使君子酸鹽的興奮性中毒模型(Yezeierski & Park, 1993)，以及挫傷模型(Siddall 等，1995)。在人類中，可應用各種測試評估疼痛和測試活性劑對疼痛的效果。可在施用之前及之后評估任意一種或多種疼痛癥狀，包括上面討論的那些。在施用后一種或多種癥狀的任何顯著性降低表明該活性劑是治療有效的。已設計了多種疼痛問卷和評分來評估患者疼痛，其應用了不同的方法。可以單次測量(僅為強度)或應用多次測量(持續時間和強度) 來評估疼痛。可在英國國立衛生圖書館啟動的“Do Once and Siare”(DOaS)的痛覺測定計劃報告草稿的附錄35中找到疼痛評級系統列表，其在此全文引入本文作為參考。有用的疼痛評分包括視覺模擬評分法、McGill疼痛問卷、以及描述詞差別評分法。此類疼痛評級系統和評分法在以下參考文獻中描述，它們各自都全文引入本文作為參考^Measurement of pain”，J. Rheumatol. 9(5) :768-9. PMID 6184474，Melzack R(1975 年 9 月)；"The McGill Pain Questionnaire :major properties and scoring methods", Pain 1(3) :277-99, PMID 1235985,Gracely RH,KwiIosz DM(1988 年 12 月)；“The Descriptor Differential Scale :applying psychophysical principles to clinical pain assessment Pain 35(3) :279-88, PMID 3226757 ；"The subjective experience of acute pain. An assessment of the utility of lOindices”，Clin J Pain 5(2) :153-9, PMID 2520397， Hartrick CT, Kovan JP, Shapiro S (2003 年 12 月)(不完全引用？)。還可應用測痛計測量患者對疼痛的敏感性(疼痛閾)。有用的測痛計包括聲波痛覺計(palpometer)、控壓痛覺計、基于激光的測痛計鎮痛儀(IITC Life kiences)、基線測痛儀(Kom Kare公司)、測量皮膚對疼痛敏感性的畢恩斯特勒姆痛覺計、或測量上腹部敏感性的博阿斯痛覺計。4.測量活性劑的內攝作用可在動物中針對內攝或轉運活性測試活性劑。例如可以標記活性劑(如tat肽)， 然后注射進動物諸如小鼠中。例如，腹膜內或靜脈注射是合適的。注射后約1小時，處死小鼠，用固定液(鹽水中的3%多聚甲醛、0.25%戊二醛、10%蔗糖、10U/mL肝素)灌注。然后取出腦，冷凍并切片。使用共聚焦顯微鏡分析切片的熒光。從熒光測定內攝活性，任選地相對于陽性對照和陰性對照測定。合適的陽性對照是包含標準tat肽序列的活性劑。合適的陰性對照是經熒光標記的沒有tat肽的活性劑。也可以使用未標記的溶媒作為陰性對照。可在細胞培養物中進行類似實驗，以測試tat變體(參見US20030050M;3)。對皮層神經元培養物施用任選地與活性肽連接的、經熒光標記的變體tat肽。施用后使用熒光顯微鏡在數分鐘內測定攝入量。可如同動物攝入實驗所述，相對于陽性和陰性對照來測定提高的攝入量。
實施例實施例1 對Tat_NR2B9c的副作用進行篩選Tat-NR2B9c是標準tat肽和以前顯示出對大鼠中風模型有效的KLSSIESDV (SEQ ID NO 3)的嵌合肽。本實施例針對抑制已知配體與多種受體蛋白質結合的能力篩選肽 Tat-NR2B9c。所篩選的受體的實例包括N型鈣通道。篩選作為競爭性結合測試法進行，其中在存在未經標記的配體以提高靈敏度的情況下，10 μ M濃度的未經標記的Tat-NR2B9c與1125標記的配體競爭結合其受體。在10 μ M 下，Tat-NR2B9c顯示100%抑制放射性標記的ω -芋螺毒素GVIA與N型鈣通道的結合。在該濃度下iTat-NI^Bgc還顯示對IL-8/IL-8RB的80%的抑制。實施例2 標準Tat肽的誘變標準tat肽和有效的鎮痛藥的序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(Tat-NR2B9c)(SEQ ID NO 1)(IGKGAKCSRLMIDCCTGSCRSGIiCG (齊考諾肽)(SEQ ID NO 19)測試了 Tat_NR2B9c變體對N型鈣通道的抑制。這些變體包括在Tat_NR2B9c第1 位上Y殘基突變為F的變體，以及在Tat-NR2B9c的一串堿性殘基上具有修飾的變體。每種肽以ΙΟΟμΜ施用。測試了以下的肽(Ca2+電流被顯示為每種肽后面的百分比)1990 TAT :YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO 2) (57+/-1. 6 % (n = 5)) ；1991 2B9c :KLSSIESDV(SEQ ID NO 3) (94 +/" 1. 7 % (η = 5)) ； 1992 Tat-NR2B9c-AA ；YGRKKRRQRRRKLSSIEADA (SEQ ID NO 4) (74+/-2. 4 % (n = 6)) ； 1993F_Tat_NR2B9c :FGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO :5) (91 +/"I. 6% (n = 5)) ； 1994 Tat_NR2B9c K 至 A :YGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO :6) (77+/-1. 8% (n = 7)) ； 1995 F_Tat_NR2B9c K 至 A :EGRKKRRQRRRALSSIESDV (SEQ ID NO: 7) (97+/-0. 2% (n = 6)) ；1976 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX(SEQ ID NO :9)其中 X =正纈氨酸 (66+/-3. 4 % (η = 6)) ；1977 :YGRKKRRQRRRKLSSIESDX(SEQ ID NO :10)其中 X = L-叔丁基-甘氨酸(65+/-5. 1% (η = 5)) ； 1987 :Tat_NR2B9c 的 D-異構體(82+/-2. 2% (η = 6))。 Tat-NR2B9c (68+/-1. 7% (η = 7)) 0數據被表示為平均值+/_標準誤差。還在以下的膜片鉗測試法中測試了肽。針對其抑制N-型鈣通道介導的離子電流的能力來篩選肽，這通過在表達N-型鈣電流的背根神經節神經元中應用全細胞膜片鉗記錄來進行。背根神經節(DRG)的培養物從妊娠13-14天的Swiss小鼠制備。簡言之，將DRG 切片并在37°C下進行20分鐘胰蛋白酶消化，將其機械解離并接種在用聚-D-賴氨酸涂覆的蓋玻片上。將它們在無血清 MEM(Neurobasal MEM，B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中培養。3-5天后，添加10 μ M FUDR溶液來抑制神經膠質增殖。在潮濕的5% CO2空氣中于37°C下維持培養物，并且一周換液兩次。接種10-14天后在室溫下進行全細胞記錄。電生理學記錄用Axopatch-IB放大器(Axon Instruments,FosterCity,CA)以電壓鉗模式進行全細胞記錄。使用兩階段鉗(PP83 ；Narishige，東京，日本)，從薄壁的硼硅玻璃 (直徑 1. 5mm ;World Preeision Instruments, Sarasota,FL)構建電阻為 3—5ΜΩ 的記錄電極。使用pClamp 9 (Axon Instruments)程序在線將數據數字化、過濾QkHz)并獲取。向移液管中填充含有(mM) :CsCl 110、MgCl23、EGTA 10,HEPES 10,MgATP 3,GTP 0. 6 的溶液。 用 CsOH 將 pH 調節至 7. 2。浸浴溶液在 pH(NaOH) 7. 4 下含有(mM) =CaCl2 UBaCl2 10,HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖10、TTX 0. 0002。使用40ms去極化脈沖，將全細胞電流從_60mV的保持電位激發至+20mV，每1 應用一次。為了測試使用依賴性的抑制，使用IOms去極化脈沖， 將電流從-60mV的保持電位激發至+20mV，分別每0. 02s(50Hz)、0· 05s(20Hz)、0· Is(IOHz) 或 15s (0. 07Hz)應用一次。結果顯示于圖2中。上部分顯示存在所示肽時全細胞鈣電流的平均值+/_標準誤差，其相對于應用所述肽之前該細胞中的全細胞鈣電流進行標準化。圖2的下部分顯示代表性的全細胞示蹤，上部分中的平均值來自于所述代表性全細胞示蹤。數據顯示 Tat-NR2B9c的tat部分可介導N型鈣通道的抑制。Tat_NR2B9c的N-端酪氨酸的突變幾乎完全解除了該嵌合肽抑制N型鈣通道的能力。Tat-NR2B9c的C-端部分(KLSSIESDV (SEQ IDNO 3)), F-Tat-NR2B9c或1994Tat_NR2B9c K至A顯示對N型鈣通道活性無顯著抑制。肽 1992、1994和1987與單獨的tat相比顯示通道活性的顯著提高，但仍然顯示N型鈣通道活性量的一些降低。所有這些肽與單獨的標準Tat相比提供了降低的對N-型鈣通道的結合， 這表明包含這些Tat變體序列之一的藥物的治療指數升高。實施例3 用Tat_NR2B9c對外周神經損傷后疼痛超敏件的劑量依賴件逆轉這一實施例證實了靜脈內施用Tat_NR2B9c如何逆轉成年雄性斯普拉格-道利大鼠在外周神經損傷后的疼痛超敏性，其中以低劑量靜脈內施用Tat-NR2B9c(約IOOpmol/大鼠)。出人意料地，更高劑量靜脈內施用Tat-NR2B9c (約10mg/kg)沒有產生疼痛超敏性的任何明顯逆轉。在這些實驗中，應用聚乙烯套管方法(Mosconi T，Kruger L.，Pain 1996,64 37-57)誘導坐骨神經的慢性縮窄性損傷。在氟烷麻醉下，以中至高水平暴露成年雄性斯普拉格-道利大鼠的左坐骨神經。縱向分開聚乙烯套管(PE90管，2mm長)，并將其植入坐骨神經周圍，并允許動物恢復適當的時間，例如10-14天。將含有溶解的Tat-NR2B9c的無菌等滲鹽水、或僅有鹽水的對照注射至尾靜脈中，其中使動物處于短暫的氟烷麻醉下。通過測試動物的縮爪閾值測量對疼痛的敏感性。應用Von-Frey細絲(Stoelting Co.，Wood Dale, IL, USA)評估對機械刺激的縮爪閾值。將動物置于具有塑料底板的塑料籠中。為測試引起所刺激的爪收縮所需的觸覺閾值，以遞升次序、與后爪跖面垂直地應用von Frey細絲(0. 008-15. 18g)。每一細絲應用5次，并且當在5次施用細絲中有3次陽性反應則確定為縮爪閾值。為避免組織損傷，將截止閾值指定為15. ISgo如圖3A所示，靜脈內施用Tat_NR2B9c看上去逆轉了外周神經損傷后的疼痛超敏性。在用于產生外周神經的手術操作之前(術前)測試縮爪閾值。在手術后10-14天(術后)，以及在即將施用Tat-NR2B9c或鹽水溶媒對照之前，所有動物均顯示出縮爪閾值的顯著降低，這是由外周神經損傷引起的疼痛超敏性的特征。用Tat-NR2B9C(100pmol/動物； η = 15只動物；實心柱)或用鹽水溶媒(n = 9只動物；空心柱)。女與溶媒對照相比較ρ < 0. 05。所述柱是平均值士 SEM。圖:3Β公開了通過Tat_NR2B9c逆轉疼痛超敏性的時間進程。該圖顯示了施用 Tat-NR2B9c后2小時內用Tat_NR2B9c (IOOpmol/動物，i. v.)治療的動物的平均縮爪閾值 (士SEM)。在即將施用Tat-NR2B9c之前(時間=0)，以及在60,90和120分鐘后測量縮爪閾值。* -與t = 0相比較ρ < 0. 05。如圖3C所示，靜脈內施用高劑量的Tat_NR2B9c(10mg/kg i. v.)對外周神經損傷后的疼痛超敏性沒有作用。在用于產生外周神經的手術操作之前(術前)測試縮爪閾值。 在手術后10-14天，以及在即將施用Tat-NR2B9c之前，所有動物(n = 4)均顯示出縮爪閾值的顯著降低(右圖中t = 0)，這是由外周神經損傷引起的疼痛超敏性的特征。與未治療的動物相比，經治療的動物在施用Tat-NR2B9c后60、90或120分鐘后，沒有顯示出縮爪閾值的變化。數據為平均值士SEM。實施例4 :Tat-NR2B9c對N型Ca2i通道介導的離子電流的抑制進一步表征了 Tat_NR2B9c對N型Ca2+通道介導的離子電流的抑制。圖4表征了 Tat-NR2B9c (YGRKKRRQRRRKLSSIESDV，SEQ ID 1)對 Ca2+電流抑制的程度，并與其他變體1990 TAT (YGRKKRRQRRR,SEQ ID NO 2) ； 1992 Tat_NR2B9c AA(YGRKKRRQRRRKLSSIEADA,
20SEQ ID NO 4) ；1994Tat-NR2B9c K 至 A(YGRKKRRQRRRALSSIESDV, SEQ ID NO: 6) ;1987D-Tat-NR2B9c(YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(都為 D-氨基酸)，SEQ ID NO 8) ； 1976 (YGRKKRRQRRRKLSSIESDX,其中 X =正纈氨酸，SEQ ID NO 9)； 1977(YGRKKRRQRRRKLSSIESDX，其中 X = L-叔丁基甘氨酸，SEQ ID NO 10)進行比較。組織培養背根神經節(DRG)的培養物從妊娠13-14天的Swiss小鼠制備。簡言之，將DRG切片并在37°C下進行20分鐘胰蛋白酶消化，將其機械解離并接種在用聚-D-賴氨酸涂覆的蓋玻片上。將它們在無血清的MEM(NeurcAasal MEM，B-27-Gibco Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)中培養。3-5天后，添加10 μ M FUDR溶液來抑制神經膠質增殖。在潮濕的5% CO2空氣中于37°C下維持培養物，并且一周換液兩次。接種10-14天后在室溫下進行全細胞記錄。電生理學記錄用 Axopatch-IB 放大器(Axon Instruments, Foster City, CA)以電壓鉗模式進行全細胞記錄。使用兩階段鉗(PP83 ；Narishige，東京，日本)，從薄壁的硼硅玻璃(直徑 1. 5mm ；World Precision Instruments, Sarasota, FL)構建電阻為 3-5ΜΩ 的記錄電極。使用pClamp9 (Axon Instruments)程序在線將數據數字化、過濾QkHz)以及獲取。向移液管中填充含有(mM) :CsCl 110、MgCl2 3、EGTA 10、HEPES 10、MgATP 3、 GTP0. 6的溶液。用CsOH將pH調節至7. 2。浸浴溶液在pH(NaOH) 7. 4下含有(mM) =CaCl2 1、BaCl2 10、HEPES 10、TEA-Cl 160、葡萄糖 10、TTX 0.0002。使用 40ms 去極化脈沖，將全細胞電流從_60mV的保持電位激發至+20mV，每1 應用一次。為了測試使用依賴性的抑制，使用IOms去極化脈沖，將電流從_60mV的保持電位激發至+20mV，分別每0. 02s (50Hz)、 0. 05s (20Hz)、0. Is (IOHz)或 15s (0. 07Hz)應用一次。數據分析數據被表示為平均值+/_標準誤差。圖4證明了在背根神經節神經元(其主要表達N型Ca2+通道)中，濃度遞增的含完整Tat序列(YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO :2))的所有肽都顯著地抑制Ca2+電流。這表明I^at 序列中的殘基抑制N型Ca2+通道電流的特性。圖5A和B證明了 N型Ca2+通道的Tat_NR2B9c與ω芋螺毒素(1 μ Μ，一種選擇性 N型Ca2+通道阻斷劑)或硝苯地平(選擇性L-型Ca2+通道阻斷劑)的組合對DRG電流的抑制。ω芋螺毒素抑制Ca2+電流，并且一旦N-通道被阻斷，Tat_NR2B9c (100 μ Μ)不能提供額外的抑制(圖5Α，左側)。類似地，在Tat-NR2B9c抑制離子電流后添加芋螺毒素時，未觀察到額外的電流抑制(圖5A，右側)。另外，選擇性L型Ca2+通道阻斷劑硝苯地平顯著地影響了存在(100 μ M，細胞內)或不存在Tat_NR2B9c時記錄的Ca2+電流的大小，如圖5B中所示。圖5B的左側部分顯示鈣電流的平均值+/_標準誤，而右側是來自單個實驗的全細胞電流的代表性示蹤。圖6證明Tat_NR2B9c對Ca2+電流的阻斷不是頻率依賴性的。使用100 μ M Tat-NR2B9c測試其使用依賴效應。+20mV去極化脈沖激發的電流顯示強的頻率依賴性衰減。然而，頻率的升高(0.07，10，20，50Hz)未提高Tat_NR2B9c對該電流的抑制作用。該圖顯示在不同頻率下的一個代表性DRG神經元中記錄的Ca2+電流。這些電流具有在數分鐘后衰減的自然趨勢，并且頻率的升高未影響Tat-NR2B9c對電流的抑制(代表性的η = 4)。圖7證明在DRG神經元中Tat_NR2B9c以不依賴于電壓的方式抑制Ca2+電流，并且該抑制涉及N型Ca2+通道。從-60mV的保持電位起，使用50ms電壓鉗從-40到+50mV的步進來引發電流。總之，圖4-7顯示Tat_NR2B9c能夠抑制DRG中的電流，例如由N型Ca2+通道介導的鈣電流。此外，包含Tat序列的其他肽也能夠抑制電流。這些數據還顯示該抑制涉及N 型Ca2+通道，并且不依賴于頻率和電壓。雖然為了清晰理解的目的詳述了上面的發明，但是，很明顯可以在所附權利要求的范圍內實施某些修改。上文引用的所有出版物、文件、登錄號等在此為了所有目的以其整體引入作為參考，其程度就如同單獨地指明這樣引用每一出版物、文件、登錄號等一樣。如果在不同時間有一種以上的序列版本與同一登錄號相關，則提及該登錄號時指的是在提交本申請時與其相關的版本，也溯及包含該登錄號的任何在先申請時與其相關的版本。除非上下文中明顯不同，否則任何方面均可與任何其他方面組合起來要求保護， 或如同不與另一方面組合的那樣要求保護。所述方面可以例如是步驟、特征、性質、要素、 模式、變量、測量、量或實施方案。除非上下文中明顯不同，否則任何表明某方面是非必須的、或任選的、或示例性的語言旨在提供對權利要求的充分說明支持(例如，35U. S. C. 112 或EPC的Art. 83和84)，其包括“排他性”或“排除性”語言。排他性語言包括將權利要求具體且明確地限定為所討論方面的任意術語。“排除性”語言例如明確地將所討論的方面從權利要求的范圍中排除。“排他性”或“排除性”術語的非限制性實例包括“僅”、“只”、
“由......組成”、“單獨”、“無”、“沒有”、“不”、“不能”、“不存在”或“排除”或其變體。表明
某方面是非必須的、或任選的、或示例性的語言的非限制性實例包括諸如以下的術語“變通方案”、“任選地”、“包括”、“能”、“可以”、“例如”、“實施方案”、“方面”、“如果”或其變體。
權利要求
1.具有包含YGRKKRRQRRR(SEQID NO 2)的氨基酸序列的tat肽或其具有少于4個氨基酸缺失、替換或插入的變體或所述tat肽的擬肽用于治療或有效預防疼痛的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述的tat肽具有包含YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO: 1)的氨基酸序列，或所述序列的具有少于10個缺失、替換或插入的變體，或其擬肽。
3.上述權利要求任一項的用途，其以低于lmg/kg的劑量施用。
4.上述權利要求任一項的用途，其以10_5至lO—mg/kg的劑量施用。
5.上述權利要求任一項的用途，其中所述tat肽不與NMDAR2B 9C連接。
6.上述權利要求任一項的用途，其中所述tat肽沒有與PSD95-NMDAR相互作用的抑制劑連接。
7.上述權利要求任一項的用途，其中所述tat肽與NMDAR2B 9C連接。
8.上述權利要求任一項的用途，其中外周地施用所述肽。
9.上述權利要求任一項的用途，其中鞘內地施用所述肽。
10.上述權利要求任一項的用途，其中所施用的肽不以可檢測的量進入CNS中。
11.上述權利要求任一項的用途，其中以主要導致N型鈣通道的抑制、而非PSD-95與 NMDAR或NOS相互作用的抑制的方案施用所述肽。
12.上述權利要求任一項的用途，其中所述劑量低于lmg/kg。
13.上述權利要求任一項的用途，其中所述劑量是10_5至lO—mg/kg。
14.上述權利要求任一項的用途，其中所述患者沒有經歷中風、癲癇、缺氧、CNS的外傷、阿爾茨海默病以及帕金森病。
15.上述權利要求任一項的用途，其中所述疼痛位于外周部位。
16.上述權利要求任一項的用途，其中所述疼痛位于CNS。
17.上述權利要求任一項的用途，其中外周地施用所述肽或擬肽。
18.上述權利要求任一項的用途，其中鞘內地施用所述肽或擬肽。
19.上述權利要求任一項的用途，其中通過所述肽或擬肽與N型鈣通道的結合來實現疼痛的治療或預防。
全文摘要
本發明提供了用于治療疼痛的活性劑。示例性的活性劑包含逆轉錄病毒Tat蛋白的一部分，或由其組成。一個此類活性劑是肽Tat-NR2B9c。該肽以前已經作為通過抑制PSD95與NMDA受體和/或NOS的相互作用來抑制中風及類似病癥的損傷效應的活性劑而被描述。本申請提供了數據顯示Tat-NR2B9c肽可有效地緩解疼痛。可在低于抑制PSD95與NMDAR或NOS的相互作用所需劑量的肽劑量下獲得疼痛的緩解。
文檔編號A61K38/00GK102202677SQ200980143194
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月2日 優先權日2008年9月3日
發明者J·D·加爾曼, M·P·貝爾馬里斯, M·W·薩爾特, M·蒂米安斯基, P·S·盧 申請人:諾諾公司, 阿爾伯維塔公司