專利名稱：神經生長因子的病毒滅活方法
技術領域：
本發明涉及一種神經生長因子的病毒滅活方法。
背景技術：
目前對于血液制品，國內外較為成熟的病毒滅活方法，主要有物理和化學法兩大 類，其中物理法包括加熱、巴氏滅活、光照等方式，多數蛋白在此條件下不穩定，應避免采 用；柱層析和過濾方法也有很好的去除病毒作用，但存在使用范圍有限的缺陷，如納米膜過 濾僅適用于分子量較小(直徑較小)的蛋白，且價格昂貴。化學法主要有有機溶劑/去污 劑(S/D)、辛酸鈉、低PH等方式，S/D法最早用于血液制品病毒滅活，在室溫下需要6小時， 對產品收率有影響，且有機溶劑/去污劑去除較為麻煩；辛酸鈉法是新發展的病毒滅活方 法，具有安全、快速和高效的特點；低PH法僅適用于對酸不敏感的樣品，一般需要較長的滅 活時間。神經生長因子(NGF)是神經營養因子中最早被發現，目前研究最為透徹的，具有 神經元營養和促突起生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍 神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。神經生長因子 在人體內主要分布于腦、神經節、虹膜、心臟、脾、胎盤等組織及成纖維細胞、平滑肌、骨骼 肌、膠質細胞、雪旺氏細胞等，其他制備來源有雄性小鼠頌下腺、牛精漿、蛇毒、豚鼠前列腺 等，其中來源小鼠頌下腺的鼠神經生長因子與人類NGF有90%同源性。自2003年以來，國家對生物提取產品增加了病毒滅活/去除的要求。在中國專利 CN1752102A中，公開了采用S/D法制備鼠神經生長因子的工藝，雖然可以有效滅活潛在病 毒，但是該處理方法需要在一定溫度范圍內處理4 6小時，對產品收率有影響，且有機溶 劑/去污劑的去除較為麻煩。因此，尚缺乏一種能安全、快速和高效的對神經生長因子病毒滅活的方法。

發明內容
因此，本發明的目的在于，提供一種神經生長因子的病毒滅活方法。本發明的目的是采用以下技術方案來實現的。一方面，本發明提供一種神經生長 因子的病毒滅活方法，該方法采用辛酸鈉進行病毒滅活。優選地，所述方法中辛酸鈉進行病毒滅活的條件為辛酸鈉濃度0.2-0.4%，pH 為5. 0士2，溫度為20-30°C，時間為60-120分鐘；更優選地，辛酸鈉濃度為0. 3%，pH為 5.0士 1，溫度為25°C，時間為90分鐘。優選地，所述方法還包括辛酸鈉的去除步驟；更優選地，所述辛酸鈉的去除采用透 析的方法。優選地，所述透析條件為在注射用水中，2 8°C充分透析24小時。本發明所提供的神經生長因子的病毒滅活方法，包括以下步驟1)制備神經生長 因子中間體；2)采用辛酸鈉對步驟1)所制備的神經生長因子中間體進行病毒滅活處理；3)去除步驟2)中的辛酸鈉。優選地，所述神經生長因子包括鼠神經生長因子、人神經生長因子、牛神經生長因 子、蛇毒神經生長因子，優選為鼠神經生長因子。另一方面，本發明提供上述方法制備的神經生長因子，優選為鼠神經生長因子。又一方面，本發明提供辛酸鈉在神經生長因子病毒滅活中的用途。再一方面，本發明提供一種病毒滅活溶液，該溶液為辛酸鈉溶液，其濃度為 0. 2-0. 4%。還一方面，本發明提供所述的病毒滅活溶液在對于神經生長因子進行病毒滅活中 的用途。由此可見，本發明人根據各種病毒滅活方法的特點，選擇辛酸鈉法對神經生長因 子進行病毒滅活，即在NGF中間體中加入0. 3 %的辛酸鈉，pH調整為5. 0 士 1，室溫下培養90 分鐘，再通過透析去除辛酸鈉。綜上所述，本發明提供了獨有的病毒滅活工藝，從而保障了臨床用藥的安全性。辛 酸鈉法是新發展的病毒滅活方法，具有安全、快速和高效的特點，在PH5.0士 1時，室溫下 0. 3%的濃度僅需要數分鐘即可殺滅多數脂包膜病毒。經檢驗，本發明病毒滅活工藝處理的 鼠神經生長因子對偽狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的下降滴度均大于4Logs，10分鐘后 二種指示病毒均被滅活到最小的檢測水平以下；同時第60、90分鐘的樣品進行盲傳三代， 均未檢測出病毒。鼠神經生長因子蛋白的質量，包括比活、純度等，與未滅活原液相比，無明 顯差異。對在-30°C冰箱中貯存6個月的樣品進行檢驗，也表明蛋白質量穩定。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中圖1為實施例3中未滅活和滅活原液的電泳純度掃描圖譜，其中圖IA和圖IB為 未滅活原液，圖IC為滅活原液。圖2為實施例3中未滅活和滅活原液的等電點照片，其中圖2A為未滅活原液，圖 2B為滅活原液。圖3為實施例4中不同批號未滅活原液的活性照片，其中圖3A為20051101，圖3B 為 20051001，圖 3C 為 20051102。圖4為實施例4中不同批號滅活原液的活性照片，其中圖4A為20051101-1，圖4B 為 20051001-1，圖 4C 為 20051102-1。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明所提供的神經生長因子的病毒滅活方法進行詳細說明。實施例1本實施例為本發明所提供的神經生長因子病毒滅活的工藝路線及具體操作步驟， 詳細如下。工藝路線小鼠頌下腺一勻漿、離心一CM柱I純化一解聚一離心一CM柱II純化一病毒滅活 —透析一濃縮一柱III純化一原液
具體操作步驟如下(l)mNGF中間體的制備將小鼠頌下腺加入緩沖液，用組織破碎機破碎勻漿，得勻 漿液，于4°C，SOOOrpm離心30分鐘去沉淀后，所得上清液上離子交換柱純化，用0. 05M醋酸 鈉緩沖液平衡離子交換柱(CM柱I)，充分平衡后，將上清液以線速度< 60cm/小時的速度 上樣，再以平衡液洗脫，收集A280 > 0. 5的流穿液。流穿液中加入醋酸在酸性條件下解聚， 40C，SOOOrpm離心30分鐘，收集上清液。用0. 05M醋酸鈉緩沖液充分平衡離子交換柱(CM柱 II)，上清液以線速度彡60cm/小時速度上柱，用平衡液洗脫棄雜蛋白，用0.05M Tris-HCl 緩沖液洗脫棄雜蛋白，最后以含0.4M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液洗脫，收集峰樣，得到 mNGF中間體；(2)mNGF中間體的病毒滅活處理在步驟1)所制備的mNGF中間體中，加入0. 3% 的辛酸鈉，PH調整為5.0士 1，室溫25°C滅活90分鐘，再通過透析去除辛酸鈉，透析液再經 分子篩柱(柱III)層析分離，制得mNGF原液。實施例2本實施例為對實施例1所制備的mNGF原液進行病毒滅活效果驗證。經實驗認證，辛酸鈉法對偽狂犬病毒(PRV)和Sindbis病毒的下降滴度均大于 4Logs, 10分鐘后二種指示病毒均被滅活到最小的檢測水平以下；同時對辛酸鈉法第60、90 分鐘的樣品進行盲傳三代，均未檢測出病毒。實施例3本實施例為對實施例1所制備的mNGF原液進行蛋白質量對比研究。未滅活mNGF 原液批號20051001、20051101、20051102滅活mNGF 原液批號20051001-1、20051101-1、20051102-1mNGF蛋白的比活、純度和等電點(具體檢驗方法見《(中國藥典)》)對比取貯存 周期為0個月的樣品，按規定進行檢驗。結果見表1。電泳純度掃描圖譜見圖1，等電點照 片見圖2。表1病毒滅活mNGF原液與未滅活mNGF原液的檢驗結果 結論以上檢驗結果表明，經滅活mNGF原液的蛋白質量與未滅活mNGF原液相比， 無明顯差異。實施例4
本實施例為對實施例1所制備的mNGF原液進行蛋白穩定性對比研究。在規定的儲存條件下，考察病毒滅活原液與未滅活原液的純度和比活性，以此來 表明其穩定性變化情況。未滅活mNGF 原液批號20051001、20051101、20051102滅活mNGF 原液批號20051001-1、20051101-1、20051102-1取貯存在-30°C，貯存周期分別為0個月、1個月、2個月、3個月、6個月的未滅活和 滅活樣品，對蛋白電泳純度、比活等項目按規定進行檢驗。未滅活mNGF原液的結果見表2。活性照片見圖3。表2未滅活mNGF原液的檢驗結果 滅活mNGF原液的結果見表3。活性照片見圖4。表3滅活mNGF原液的檢驗結果
6 結論以上檢驗結果表明，在_30°C冰箱中貯存6個月，經滅活mNGF原液與未滅活 mNGF原液的蛋白電泳純度、比活都無明顯變化，二者相比也無明顯區別，穩定性一致。
權利要求
一種對神經生長因子進行病毒滅活的方法，其特征在于，所述方法采用辛酸鈉進行病毒滅活。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中進行病毒滅活的條件為辛酸 鈉濃度為0. 2-0. 4%，pH為5. 0士2，溫度為20_30°C，時間為60-120分鐘；優選地，辛酸鈉濃 度為0. 3%，pH為5. 0士 1，溫度為25°C，時間為90分鐘。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括辛酸鈉的去除步驟； 優選地，所述辛酸鈉的去除采用透析的方法。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述透析條件為在注射用水中，2 8°C 充分透析24小時。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)制備神經生長因子中間體；2)采用辛酸鈉對步驟1)所制備的神經生長因子中間體進行病毒滅活處理；3)去除步驟2)中的辛酸鈉。
6.根據權利要求1至5中任一項所述方法，其特征在于，所述神經生長因子包括鼠神經 生長因子、人神經生長因子、牛神經生長因子、蛇毒神經生長因子，優選為鼠神經生長因子。
7.權利要求1至6中任一項所述方法制備的神經生長因子，所述神經生長因子優選為 鼠神經生長因子。
8.辛酸鈉在神經生長因子病毒滅活中的用途。
9.一種病毒滅活溶液，其特征在于，該溶液為辛酸鈉溶液，其濃度為0. 2-0. 4%。
10.權利要求9所述的病毒滅活溶液在對神經生長因子進行病毒滅活中的用途。
全文摘要
本發明提供一種神經生長因子的病毒滅活方法。本發明采用辛酸鈉進行病毒滅活的條件為辛酸鈉濃度為0.3％，pH為5.0±1，溫度為25℃，時間為90分鐘。本發明還包括采用透析去除辛酸鈉的步驟。本發明所提供的神經生長因子的病毒滅活方法具有安全、快速和高效的特點，僅需要數分鐘即可殺滅多數脂包膜病毒，保證了產品的安全性。
文檔編號A61L101/42GK101927012SQ20091014850
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優先權日2009年6月26日
發明者周淑芳, 扈會平, 曾娟梅, 趙淑媛 申請人:麗珠醫藥集團股份有限公司