專利名稱：具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽產品及其制備方法，尤其涉及一種具有抗氧化活性的乳清 蛋白多肽及其制備方法，屬于抗氧化多肽制品領域。
背景技術：
乳清是生產干酪、干酪素時從牛乳中分離出來的液體部分，其中乳清蛋白含量
約為干重的13%左右，乳清蛋白中必需氨基酸組成完全符合或超出FAO/WHO的要 求，與其它蛋白質比較，具有最高的生物利用價值。目前，利用不同蛋白資源開發 功能多肽已經成為國內外科學家們研究的熱點。
乳清蛋白是從牛奶中提取出來的，牛奶的組成中87%是水，13%是乳固體。 而在乳固體中27%是乳蛋白質，乳蛋白質中只有20%是乳清蛋白，其余80%都 是酪蛋白，因此乳清蛋白在牛奶中的含量僅為0.7%,可見彌足珍貴。乳清蛋白 具有良好的抗氧化作用，目前國外已有關于乳清蛋白水解物在鐵催化卵磷脂脂質氧 化體系、銅催化脂質氧化體系中抗氧化作用的研究，利用乳清蛋白、a-乳白蛋白和 (3-乳球蛋白制備抗氧化肽，及將乳清水解物應用于煮制的豬肉餡餅中減少冷藏過程 中脂類氧化的報道。
現有的關于乳清蛋白水解物大部分是關于營養或者是降血壓活性肽方面，抗氧 化肽報道較少。國外相關抗氧化報道是采用在鐵催化卵磷脂脂質氧化體系、銅催化 脂質氧化體系、利用乳清蛋白a-乳白蛋白和(3-乳球蛋白制備抗氧化肽，國內未見乳 清蛋白抗氧化肽報道。

發明內容
本發明目的之一在于提供一種在體外和體內均具有抗氧化活性的乳清蛋白多
肽；
本發明目的之二在于提供一種制備上述具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽的方
法；本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的
一種具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽，主要由分子量在100-2800 Da之間的乳 清蛋白多肽組成；更優選的，該乳清蛋白多肽主要由分子量為592.0Da的多肽段所 組成，該多肽段序列為Val-His-Leu-Lys-Pro。
一種制備上述具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽的方法，包括以下步驟
(1)將乳清蛋白進行熱處理；
(2 )熱處理后的乳清蛋白降溫后加入堿性蛋白酶進行水解反應； (3)水解反應產物經滅酶，冷卻，濃縮，分離純化,即得。
其中，步驟(1 )中所述的乳清蛋白優選為濃度為2-10% (w/w)的乳清蛋白, 更優選為濃度為5%( w/w)的乳清蛋白；所述的熱處理優選為將乳清蛋白在90-98°C 溫度下處理2-10分鐘；更優選的，將乳清蛋白在95。C溫度下處理5分鐘；
步驟(2)中所加入堿性蛋白酶的重量百分比濃度和乳清蛋白的重量百分比濃 度之比[E/S]優選為1-3:100，更優選為2:100;
堿性蛋白酶是經細菌原生質體誘變方法造育的2709枯草桿微生物通過深 層發酵、提取及精制而成的一種蛋白水解酶，屬于一種絲氨酸脆外高堿性蛋白 酶，它能水解蛋白質分子肽鏈生成多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質的能 力。主要成分為枯草桿菌蛋白酶，是一種內切酶，催化部位為絲氨酸，分子量 約為27300。
步驟(2 )中所述的水解反應優選在以下條件下進行水解反應溫度為50 - 60°C , pH值為8.0-9.0,水解反應時間為4-6小時；本發明通過試-驗發現，優選采用下述水 解條件進行水解反應，水解度(DH)可以達到35.30%:水解反應溫度為55。C, pH值 為8.5,水解反應時間為5小時；
步驟(3 )中所述的滅酶優選為在92 - 100。C的溫度下進行滅酶；
步驟(3)中為了達到更好的分離效果，所述的分離純化優選是將濃縮后的水 解產物采用凝膠層析(例如SephadexG-lO凝膠層析)將水解產物進行分離、純化， 所得到的產物主要含有分子量為100-2800Da的乳清蛋白多肽，具有高的抗氧化活 性和清除自由基的能力。更優選的，將上述經凝膠層析分離、純化后的產物再經兩 步反相高效液相色譜的方法進行純化，可得到主要由分子量為592.0Da的多肽段所 組成的產品，該多肽段序列為Val-His-Leu-Lys-Pro;
本發明方法所制備得到乳清蛋白多肽主要由分子量在100-2800Da之間的混合 乳清蛋白多肽組成，具有較高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在體外和體內有抗氧化作用，可以作為抗氧化保健產品。
本發明乳清蛋白多肽可以按照口服制劑的常規方法制備成膠嚢劑、顆粒劑、片 劑或散劑等各種口服制劑，優選為膠囊劑。
細胞試驗表明，本發明乳清蛋白多肽產品可以保護細胞，使其較少受到H202
的傷害，同時，提高了細胞中超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽 過氧化物酶(GSH-Px)三種酶活力，對細胞中丙二^(MDA)含量也有顯著的降低作 用；動物試驗的結果表明，本發明乳清蛋白多肽產品能夠顯著P爭低大鼠血清總膽固 醇水平(TC)和甘油三酯水平(TG)以及丙二醛(MDA)含量，還可以顯著提高血清中的 過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活 力。
分子量范圍在100-2800Da的本發明多肽產品具有較強的抗氧化活性，其實驗 結果如下TBARS值為2.20 pmol /mg蛋白，鐵離子還原力(ferric reducing/antioxidant power assay, FRAP )為1170 pmol/L, 1,1-二苯基苦基苯肼自由 基(DPPH)自由基清除能力可達62.93 %;對DPPH、羥基和超氧陰離子自由基的 清除率分別為58.7%, 65.7 %和69.9%,且組氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸的含 量顯著增加。
將本發明分子量范圍在100 - 2800Da的本發明多肽產品采用兩步反相高效液相 色譜的方法進行純化可得到分子量主要為592.0Da的肽段，其氧化活性的實驗結果 如下濃度為100嗎/ml (高劑量組)的本發明多肽與空白對照組(未加活性肽)比 可減少H202對細胞的損傷(P0.05),提高SOD、 CAT和GSH-Px三種酶活力 (P<0.05),中、高劑量組本發明多肽對細胞中MDA有顯著的清除作用，并且可減 少凋亡細力包lt量。
本發明的制備方法才乘作簡單，與合成抗氧化劑相比安全可靠，適合工業化生產， 能夠大幅度提高乳清蛋白資源的利用率，提高乳清綜合利用的水平。
具體實施例方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本 領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方 案的細節和形式進行》務改或替換，但這些^務改和替換均落入本發明的保護范圍內。實驗材料
堿性蛋白酶購自西安沃爾森生物技術有限公司；產品編號EC0063,酶 活力1-20萬u/g ;
實施例1
將濃度為5%的乳清蛋白底物，在95。C溫度下進行5分鐘的熱處理之后，降到 6(TC溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，堿性蛋白酶與乳清蛋白底物濃度之比[E/S]為 2:100,在60。C溫度、pH值8.5的條件下，水解5小時(經檢測，水解度(DH)達到 了 35.30%);將水解產物經煮沸滅酶，冷卻，濃縮，冷凍干燥,即得。經;險測，所制 備得到乳清蛋白多肽主要由分子量在之間的混合乳清蛋白多肽組成。
實施例2
將濃度為5%的乳清蛋白底物，在95。C溫度下進行5分鐘的熱處理之后，降到 60'C溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，堿性蛋白酶與乳清蛋白底物濃度之比[E/S]為 2:100,在55。C溫度、pH值8.5的條件下，水解5小時(經檢測，水解度(DH)達到 了 35.30%);將水解產物經煮沸，冷卻，濃縮，經過SephadexG-10凝膠層析分離純 化，得到了分子量在100-2800Da之間的一組活性較高的抗氧化肽產品；將該分子 量在100 - 2800Da之間的抗氧化肽產品進一步采用兩步反相高效液相色鐠的方法進 行純化后得到活性較高的肽的單峰，質譜(MS)測定結果顯示為分子量為592.0的肽 #殳組成的一個混合肽；該多肽序列為Val-His-Leu-Lys-Pro。
將乳清蛋白未水解物，本實施例的5h乳清蛋白水解物及Sephadex G-10凝膠色 譜柱純化后抗氧化活性最強的100-2800Da純化部分的氨基酸組成及比例進行了 檢測，結果見表l:
表l
氨基酸種類 100—2800Da純化部
未水解物(％) 5h水解物(％) 分
^__(%)
Aspartic acida (天門冬氨酸a) TT^ H"^ iT^
Threonine (蘇氨酸)4.90 4.90 4.92
Serine (絲氨酸) 3.91 3.92 3.83
Glutamic acidb (谷氨酸b) 18.98 18.98 18.57
Glycine(甘氨酸) 1.76 1.77 1.64
Alanine (丙氨酸) 5.32 5.30 4.92Cysteine (半胱氨酸)
2.56
5.13
2.34
5.84
14.21
3.91
3,59
10.60
0.77
1.95
2.58
2.57
5.13
2.33
5.85
14.20
3.91
3.59
10.60
0.80
1.94
2.56
2.29 4.92 2.25 5.46 13.50 3.83 3.83 10.38 1.64 2.19 4.37
Valine (纈氨酸) Methionine (蛋氨酸) Isoleucine (異亮氨酸) Leucine (亮氨酸) Tyrosine (酪氨酸)
Phenylalanine (苯丙氨酸)
Lysine (賴氨酸) Histidine (組氨酸) Arginine (精氨酸)
Proline (脯氨酸)
實施例3
將濃度為5%的乳清蛋白底物，在95。C溫度下進行5分鐘的熱處理之后，降到 55。C溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，堿性蛋白酶與乳清蛋白底物濃度之比[E/S]為 3:100，在55。C溫度、pH值8.0的條件下，水解6小時；將水解產物經煮沸，冷卻， 濃縮，冷凍干燥,即得。
將濃度為5%的乳清蛋白底物，在95。C溫度下進行5分鐘的熱處理之后，降到 5(TC溫度，加入堿性蛋白酶進行水解，堿性蛋白酶與乳清蛋白底物濃度之比[E/S]為 1:100，在50。C溫度、pH值9.0的條件下，水解4小時；將水解產物經煮沸，冷卻， 濃縮，冷凍干燥，即得。
試驗例1 本發明乳清蛋白多肽的體外抗氧化活性試驗
1、 供試樣品實施例1-4所制備的乳清蛋白多肽；
2、 試驗方法及結果
體外抗氧化活性在卯磷脂脂質氧化體系(簡稱Lipsome氧化體系)中進行， Lipsome氧化體系配制方法為稱取0.89472g氯化鉀，0.0776g組氨酸，加水稀釋 到100mL,調其pH值到6.8,再取純度20%的大豆卵磷脂lg溶于氯化鉀-組氨酸緩 沖溶液中，制成2mg/mL的脂質體。進行抗氧化試驗時取稀釋10倍的脂質體5mL, 加入供試樣品1 mL以及加入0,1 mL 50mm Fed3溶液和0.1 mL 10mm抗壞血酸鹽溶 液，37。C水浴lh，乳清蛋白水解物的TBARS (流代巴比妥酸值)為2.20 (mg/L), 與對照相比降低30 - 40 % ;過氧化值(POV值)達2.07 meq/L,與對照相比降低40-50%;還原能力(FRAP值)值為1151)imoL/L，比對照提高5-6倍；對DPPH自 由基(l,l- 二苯代苦味酰基自由基)的清除率達到62.93 %,比對照提高5 - 6倍；Cu2+ 螯合能力達57.87 %,比對照提高6 - 7倍。
試驗例2本發明乳清蛋白多肽的抗氧化活性細胞試驗
一、 供試樣品實施例l-4所制備的乳清蛋白多肽；MRC-5(人胚肺成纖維細胞) 購于協和醫科大學，由美國ATCC細胞庫提供(ATCCNo.: CCL-173)。
二、 試^^方法及結果 1、 MRC-5的培養
MRC-5取回后用0.25%胰酶溶液消化后傳代。血球計數板計數后，以1(^個/ml 的密度懸浮于含10%FBS, 100g/ml雙抗，2mM谷胺酰胺的DMEM培養基中，于 37°C, 5。/。C02條件下培養。連續培養三代(36h)后用于電鏡實驗，其余試驗均用 培養四代(48h)的細胞。
2 、抗氧化肽對MRC-5存活率的作用
細胞存活率(Cell viability)用MTT法測定。MRC-5細胞以1.2x104個/ml的 密度接種于96孔板，每孔加樣量200^1。 37。C培養16h后將不同濃度的樣品(4, 20,和100ng/ml)加入孔板中。37。C培養24h，加入H202使濃度為lmM,繼續于 37。C培養44h后，加入5mg/ml的MTT液(20^1/孔)，繼續培養4小時。丟棄空內 培養液加入DMSO液(150|11/孔)。室溫下，將平板置于^L孔板振蕩器上振蕩10min, 使結晶物水解，用酶標儀于570nm波長處才企測各孔OD值。細胞的相對存活率由 MTT轉化為不可溶的甲月替鹽的數量測定。對照組細胞形成的曱月替的OD相當于 100%存活率。各處理組的細胞存活率結果表示為測定OD和對照組OD的百分比。
3、 抗氧化肽對MRC-5系列抗氧化酶活性和MDA含量的影響
3.1細胞過氧化氫損傷模型及裂解液的制備
細胞裂解液的制備參考Lee等人的方法。略加改動后操作如下用于細胞抗氧 化酶測定的細胞以1.2xl(^個/ml的密度接種于24孔板，每孔加樣量0.5ml。 37。C培 養16h后將不同濃度的樣品(4, 20, 100|ig/ml )加入孔板中，同時一組做空白對照(不 加入乳清抗氧化肽)。37。C預培養24h后，在4組中都加入11202使濃度為lmM,繼 續于37。C培養24h后，加入150ml細胞裂解液(1% triton X-100 ), 4°C裂解12h后 測定酶活。細胞裂解液的蛋白質含量由考馬斯亮蘭法測定。酶活表示為U/mg蛋白。 3.2抗氧化酶系和MDA含量的測定細胞裂解液的制備參考Lee等人(2003 )的方法。略加改動后操作如下用于 細胞抗氧化酶測定的細胞以1.2x104個/ml的密度接種于24孔板，每孔加樣量0.5ml。 37。C培養16h后將不同濃度的樣品(4， 20, 100嗎/ml)加入孔板中。37。C培養24h 后，每孔加入150ml細胞裂解液(1% triton X-100), 4。C裂解12h后測定酶活。細 胞裂解液的蛋白質含量由考馬斯亮蘭法測定(Bradford, 1976)。酶活表示為U/mg 蛋白。
(1 )超氧化物岐化酶(SOD)活力
SOD酶活測定采用氯化硝基氮藍四唑光還原法(NBT法)(Beauchamp和 Fridovich,1971),按照試劑盒操作說明進行測定。 (2)過氧化氫酶(CAT)活力
按照Carrillo等人(1991)的方法測定。反應體系含有12^1的3% (v/v) H202 和100^1細胞裂解液，888pl50mM的PBS (pH7.0)。樣品于37。C水浴2min, 240nm 處測定5min內OD的變化，其變化和H202的變化成比例。 (3 )谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)
GSH-Px用DTNB顯色法測定(Paglia和Valentine, 1967; Hafemen, 1974 )。反 應溶液由如下部分組成O.IMPBS( pH7.0 ),lmMEDTA, lOmM谷胱甘肽，lmMNaN3， l單位谷胱甘肽還原酶，1.5mMNADPH和O.lml細胞裂解液。37。C水浴10min,加 入H202使之濃度為lmM。 340nm處測定OD值。NADPH氧化的速度表示GSH-Px 活性。
(4) MDA含量的測定
用硫代巴比妥酸(TBARS )方法測定(王金枝，2007)。
細胞試驗結果表明，本發明乳清蛋白多肽可以保護細胞，使其較少受到H202 的傷害，同時，提高了細胞中超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽 過氧化物酶(GSH-Px)三種酶活力，對細胞中丙二醛(MDA)含量也有顯著的降低作 用。
試驗例3 本發明乳清蛋白多肽的抗氧化活性動物試驗
一、 供試樣品實施例l-4所制備的乳清蛋白多肽；
二、 試驗方法及結果 1.試豸企動物
清潔級SD大鼠，雄性，購自維通利華試驗動物公司(北京)，年齡為4 5個月，體重為290 ~ 320g,試驗地點在東北農業大學動醫研究所實驗動物房內。
2 D-半乳糖(D-gal)致衰老大鼠模型的建立
將大鼠同室分籠飼養，自然光照，自由釆食和飲水。每兩天稱量一次體重。適 應性祠養1周后建立模型，最終每組10只。隨機分為7組①正常對照組；②D-gal 模型陰性對照組；③D-gal +未水解乳清蛋白組；④D-gal +乳清蛋白肽低劑量； D-gal +乳清蛋白肽中劑量； D-gal +乳清蛋白肽高劑量；⑦D-gal + Vc組模型陽 性對照。②、③、④、 、 、⑦皮下注射D-半乳糖(120 mg'kg-1 )，連續注射6 周建立衰老模型；其中②、③、④、 、 、⑦組小鼠于第二周每曰分別灌胃組小 鼠給予等量雙蒸水、50mg.kg"未水解乳清蛋白，低中高劑量組灌胃乳清多肽50、 100、 ZOOmg'kg-1,及Vc50mg.kg-、①組小鼠頸背部皮下注射等量生理鹽水并于第 二周給予等量雙蒸水作為非模型正常對照組。
3血清和組織勻漿的制備
灌胃45d后，摘眼3求耳又血，斷頸處死，剖去心和腎等臟器貯存于液氮中。大鼠 血樣于4。C冰箱放置12h,離心取上清，即為血清。液氮中取出大鼠心和腎組織， 制成10%組織漿液。
4血清和組織中抗氧化酶系和MDA的測定 主要包括超氧化物岐化酶(SOD),谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛 (MDA)含量的測定。方法同細胞試驗，具體操作和結果計算按照試劑盒操作說明 進行。
動物試驗的結果表明，對大鼠灌胃處理45天以后，本發明乳清蛋白肽能夠顯 著降低大鼠血清總膽固醇水平(TC)和甘油三酯水平(TG)以及丙二醛(MDA)含量，而 且本發明乳清蛋白肽可以顯著提高血清中的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶 (SOD)以及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力。
權利要求
1、一種具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽，其特征在于主要由分子量在100-2800Da之間的乳清蛋白多肽組成。
2、 按照權利要求1所述的乳清蛋白多肽，其特征在于主要由分子量為592.0Da 的多肽段所組成，該多肽段序列為Val-His-Leu-Lys-Pro 。
3、 一種制備權利要求1所述具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽的方法，包括 (1)將乳清蛋白進行熱處理；(2 )熱處理后的乳清蛋白降溫后加入堿性蛋白酶進行水解反應； (3)水解反應產物經滅酶，冷卻，濃縮，分離純化，即得。
4、 按照權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(l)中所述的乳清蛋白為 濃度為2-10% (w/w),優選為5% (w/w);所述的熱處理為將乳清蛋白在90-98°C 溫度下處理2-10分鐘；優選的，將乳清蛋白在95。C溫度下處理5分鐘，然后冷卻。
5、 按照權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所加入堿性蛋白酶 的濃度和乳清蛋白的重量之比為1-3:100,優選為2:100。
6、 按照權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的水解反應在 以下條件下進行水解反應溫度為50-60°C, pH值為8.0-9.0,水解反應時間為4-6 小時；優選的，在以下條件進行水解反應水解反應溫度為55。C, pH值為8.5,水 解反應時間為5小時。
7、 按照權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的滅酶是采用 92 - IO(TC的溫度進行滅酶。
8、 按照權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述的分離純化采 用凝膠層析的方式進行；其中，所述的凝膠層析是SephadexG-10凝膠層析。
9、 按照權利要求8所述的方法，其特征在于步驟(3)中將濃縮后的水解產 物采用凝膠層析進行分離、純化后再采用兩步反相高效液相色譜的方法進行純化。
10、 按照權利要求1或2所述的乳清蛋白多肽產品，其特征在于按照口服制 劑的常規方法制備成膠嚢劑、顆粒劑、片劑或散劑。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗氧化活性的乳清蛋白多肽的制備方法及其產品。本發明制備方法包括(1)將乳清蛋白進行熱處理；(2)熱處理后的乳清蛋白降溫后加入堿性蛋白酶進行水解反應；(3)水解反應產物滅酶，冷卻，濃縮，經過SephadexG-10凝膠色譜柱純化后獲得抗氧化活性最強的肽段在100-2800Da之間的混合多肽。本發明所制備得到乳清蛋白多肽具有較高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在體外和體內均有良好的抗氧化作用。本發明制備方法操作簡單，與合成抗氧化劑相比安全可靠，適合工業化生產，能夠大幅度提高乳清蛋白資源的利用率，提高乳清綜合利用的水平。
文檔編號A61P39/00GK101519426SQ20091012924
公開日2009年9月2日 申請日期2009年3月19日 優先權日2009年3月19日
發明者刁新平, 孔保華, 彭新顏, 李艾黎 申請人:東北農業大學