專利名稱：大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物和基因及制法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物和基因及制法及用途，屬生物醫學領域。

背景技術：
組織傷口修復是一個由血細胞，細胞外基質和多種細胞調節因子參與，交互作用的動態過程。組織傷口修復包括三個階段炎癥反應，組織形成和組織再造。在炎癥反應階段，通過周圍的受損的血管，從血清中釋放各種生長因子，細胞因子和低分子量的小分子化合物，引起炎癥反應，與受損血管周圍的細胞外基質相互膠聯，凝結，形成一道防御外界微生物的屏障，也作為早期創傷修復過程中生長因子作用的支架。同時，釋放的各種生長因子和細胞因子能夠啟動傷口修復中的細胞增殖和遷移。在組織形成和組織再造階段，在各種生長因子和細胞因子的作用下，在傷口周圍出現由新形成的毛細血管長出物組成的肉芽組織，最終肉芽組織結痂，形成疤痕，修復傷口。
最新研究表明，組織傷口修復反應與腫瘤發生過程有密切關系，腫瘤生長也可以被視為一種不受調節的組織修復過程。在正常的組織中，組織修復反應被誘導發生，在完成損傷組織修復后，它能夠被調控停止下來。但是在有致癌性的突變的情況下，最初的腫瘤生長被認為是對組織的損害而激發組織修復反應的發生。這就導致了一個惡性循環組織修復產生的細胞會被用于腫瘤團的生長，而更大的腫瘤團將被認為是更大的組織損害，從而導致組織修復反應提供更多的細胞用于腫瘤的生長。如果能夠鑒定出啟動因子信號及其負控制因子信號，就能試著去中和它，從而阻止腫瘤組織修復程序，進而也能幫助來抑制或阻止腫瘤的生長。因此，尋找腫瘤所利用的觸發組織修復反應的重要啟動因子信號及其負控制因子信號成為目前和未來的腫瘤研究的熱點方向之一。
脊椎動物中，晶狀體蛋白(crystallin)是眼球晶狀體的結構蛋白(C.T.Morner于1893年最早發現)，決定了晶狀體的折光性和通光性。晶狀體蛋白分為α和βγ兩大類，α-晶狀體蛋白屬于廣泛分布的小的熱休克蛋白質家族。βγ-晶狀體蛋白具有特征性的希臘鑰匙模體(Greek key motifs)，每個模體由40個氨基酸殘基組成，而兩個結構模體可通過不對稱性排列形成一個結構域，故將它們歸為βγ-晶狀體蛋白超家族。除了晶狀體外，非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質(non-lens βγ-crystallin)廣泛分布在其他組織中。在微生物中，非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質主要為壓力誘導表達的相關蛋白質。例如Protein S和Spherulin3a。Protein S是一種來源于土壤中革蘭氏陰性細菌Myxococcus xanthus的孢子專一蛋白，當處于營養缺乏的惡劣條件下，Protein S被誘導大量分泌表達，并結合鈣離子通過寡聚化作用在細菌表面組裝形成多層衣殼，在惡劣條件下保護自身。Spherulin 3a，來源于細菌Physarum polycephalum的囊泡形成蛋白，在各種壓力環境下合成，參與形成胞囊和休眠。在脊椎動物中，已知的非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質包括ep37和AIM1。EP37(epidermis-specific protein 37，表皮分化蛋白37)是表達在兩棲動物Cynopspyrrhogaster(日本蠑螈，潮汕蠑螈或稱赤腹蠑螈)的胚胎表皮，皮膚腺和胃表皮細胞中的蛋白質。黑色素瘤缺失蛋白1(AIM1，absent in melanoma 1)，為一類首先在人黑色素瘤疾病模型中缺失的與腫瘤抑制相關的新基因。AIM1在哺乳動物的胚胎發育過程中時空特異性的表達調節，具有不同大小的轉錄本，在成體中AIM1大量表達于皮膚，肺，心臟，肝和腎等器官，認為是一個潛在的腫瘤抑制基因。盡管EP37蛋白和AIM1基因被認為可能參與表皮發育和腫瘤抑制，但是目前對于他們的分子特性，生理功能和分子作用機制還知之甚少。
三葉因子(trefoil factor，TFF)為一類含有一個或者多個三葉因子結構域(或稱為P-結構域，該結構域由大約38～39個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫鍵)的分泌型的蛋白質，廣泛地分布在哺乳動物的胃腸道上皮及其他的上皮系統中，被認為與粘膜保護，損傷修復和腫瘤抑制密切相關。第一個三葉因子多肽pS2/TFF1發現于人乳腺癌MCF7細胞中，在基因敲除三葉因子，小鼠的腫瘤發生率升高，同時三葉因子能夠引起腫瘤細胞凋亡，因此推測三葉因子為潛在的腫瘤抑制因子。三葉因子能夠引起趨化反應，促進表皮細胞的細胞遷移和傷口修復，在胃粘膜的損傷修復中起到重要的作用，因此，三葉因子還作為促進生長蛋白。例如，目前報導重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細胞(rat intestinalepithelial cell Lines，IEC-6)的細胞遷移能力，但是其所需要的濃度約為80多微摩爾。但是，自三葉因子蛋白發現以來一直作為孤兒配體存在，與三葉因子作用的受體和詳細的信號轉導通路不清楚，也沒有文獻報道三葉因子家族蛋白和非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質能夠聯合協同作用。
細胞內泛素化修飾信號的具有多種功能，例如多泛素化修飾信號認為是蛋白酶體降解蛋白的信號，單泛素化修飾信號則參與了其他不依賴于蛋白酶體降解的重要的細胞生理功能，包括介導細胞外分子內吞，轉運到細胞核調節。最近研究表明，蛋白激素，生長因子和細胞因子可通過單泛素化修飾，經過一系列信號分子的調節，能夠直接轉運到細胞核，調節細胞基因表達，發揮著重要的生理作用。例如，成纖維成長因子(fibroblastgrowth factors，FGFs)，血小板生長因子(platelet derived growth factors，PDGF)，表皮生長因子(epithelial growth factors，EGF)，和血管生長因子(vascular endothelial growthfactors，VEGF)結合受體后，經過單泛素化修飾，能夠被細胞內吞，直接轉運到細胞核，調節基因表達，刺激細胞生長，增殖和分化，在胚胎發育，組織再生等生理過程中發揮重要作用。
大蹼鈴蟾(Bombina maxima)主要分布在中國西南的云南省和四川省，是我國特有的資源性兩棲動物種類，也是特色的民族民間藥物。大蹼鈴蟾皮膚分泌物中已經發現了大量的小分子量的肽類活性組分，如具有調節或者激素的功能的肽類，為哺乳動物激素分子，神經遞質和生長因子的類似物；抗菌肽類，作為兩棲動物天然免疫系統的重要組成部分。目前，在兩棲類動物皮膚中尋找活性單體化合物和大分子先導化合物已成為了國內外新藥和研究工具性探針的熱點之一。


發明內容
本發明的目的是提供一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物，還提供這種蛋白復合物的基因，以及其制備方法，還提供這種蛋白復合物及其基因的用途。大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物在體外具有ATPase和GTPase活性，為一類新的ATPase和GTPase酶。其具有多種細胞生物活性在體外納摩爾水平能夠殺死多種腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞脫落和凋亡；在皮摩爾水平具有促進創傷修復的活性；在細胞外經單泛素化修飾，能夠直接轉運到細胞核中進行基因表達的調控從而調節細胞狀態，包括細胞遷移、脫落，生長。本發明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物提供了非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細胞生物學功能及其能夠與三葉因子蛋白協同作用的機制，可應用于生物醫學試劑制備和抗腫瘤以及促進創傷修復制藥。
本發明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物是從兩棲類皮膚中純化得到的天然大分子蛋白質，其天然分子量為72kDa，由兩種類型的亞基所組成，α亞基和β亞基按αβ2的分子形式以非共價鍵連接而成。序列測定表明其α亞基由336個氨基酸殘基組成，具有SEQ ID NO1中的氨基酸序列，為非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質超家族成員。β亞基成熟肽由146個氨基酸殘基組成，包含三個三葉因子結構域，具有SEQ IDNO2中的氨基酸序列。該蛋白質被命名為大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物(complex of non lens-βγ crystallin and trefoil factor)，縮寫為βγ-CAT。
本發明的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物是從兩棲類皮膚中得到的天然存在的非晶狀體βγ-晶狀體蛋白家族成員與三葉因子家族成員的蛋白質復合物，也是非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子在天然條件下聯合協同作用。
編碼本發明大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基的cDNA由1251個核苷酸組成，該cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端為SEQ ID NO3，其特征在于編碼成熟的βγ-CAT的α亞基蛋白為SEQ ID NO3中第22-1029位核苷酸，其編碼相對應的氨基酸序列為SEQ ID NO1。
編碼本發明大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的β亞基的cDNA由1830個核苷酸組成，該cDNA的核苷酸序列自5’端至3’端為SEQ ID NO4。其特征在于編碼成熟的βγ-CAT的β亞基蛋白為SEQ ID NO4中第82-519位核苷酸，其編碼相對應的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物，其制備方法可以通過生物化學分離純化方法，從中國特產兩棲動物大蹼鈴蟾皮膚中分離純化得到將野外采集的活體大蹼鈴蟾飼養于實驗室內，用清水沖洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加適量的無水乙醚刺激，密閉容器3～5分鐘，待大蹼鈴蟾皮膚表面有大量的泡沫狀分泌物產生，打開容器，輕柔按摩動物背部皮膚，并用含5mM EDTA的生理鹽水溶液沖洗大蹼鈴蟾，收集皮膚分泌物，離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)，上清液冷凍干燥，即得皮膚分泌物。
將皮膚分泌物液經過凍干，溶解，透析和離心處理，分別通過分子凝膠層析(AKTASephadex superfine G-100分子篩層析柱)和離子交換柱(AKTA Mono-Q HR5/5陰離子層析柱)兩道分離純化流程，即可獲得純化的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物。
大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基和β亞基的基因的克隆包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA的純化及反轉錄，構建皮膚cDNA文庫，分別根據兩個亞基的N端已知序列和部分內肽片段序列，設計引物，利用PCR篩選法篩選編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基和β亞基的基因，根據βγ-CAT的α亞基的全cDNA推導出對應的蛋白序列，結合肽指紋圖譜和已知內肽片段序列進行驗證，確認編碼βγ-CAT的α亞基的全cDNA。
大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基和β亞基的全cDNA作為基因工程制備大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的應用。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物具有ATPase和GTPase活性，還具有核苷酸結合活性，為一類全新的尚未報道過的ATPase和GTPase， 可用于生物醫學試劑制備和制藥 本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物在納摩爾水平能夠選擇性的殺死腫瘤細胞，并且能夠誘導癌細胞發生脫落和凋亡。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物在皮摩爾水平(50pM)就能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物在皮摩爾水平就能夠促進細胞遷移，具有促進創傷修復的活性。目前報導的重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細胞(rat intestinal epithelial cellLines，IEC-6)的細胞遷移能力，但是其所需要的濃度太高，約為80多微摩爾(83μM)。本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物誘導細胞遷移時候所需要的濃度僅在皮摩爾水平，活性比其他報道的哺乳動物來源的單鏈三葉因子蛋白要高一百萬倍左右。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物能夠通過單泛素化修飾，以囊泡化的方式，直接迅速轉運到細胞核中進行基因表達的調控從而調節細胞狀態，包括細胞遷移、脫落，生長。
本發明提供的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物揭示脊椎動物非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細胞生物學功能及其能夠與三葉因子蛋白協同作用的協同機制。
下面結合附圖，通過具體實施例來詳細闡述本發明，但是本發明的內容并不僅局限于此。



圖1為本發明蛋白復合物βγ-CAT的分離制備流程，A圖為分子篩凝膠層析分離圖譜，B圖為陰離子凝膠層析圖譜。
圖2為本發明蛋白復合物βγ-CAT的α亞基的氨基酸全序列表。
圖3為本發明蛋白復合物βγ-CAT的β亞基的氨基酸全序列表。
圖4為本發明蛋白復合物βγ-CAT的α亞基基因的核苷酸全序列表。
圖5為本發明蛋白復合物βγ-CAT的β亞基的基因的核苷酸全序列表 圖6為本發明蛋白復合物βγ-CAT體外測定ATPase和GTPase，核苷酸結合活性，A和B圖為核苷酸結合測定，C圖為ATPase和GTPase活性測定。
圖7為本發明蛋白復合物βγ-CAT體外選擇性對多種腫瘤細胞細胞毒殺傷作用。
圖8為本發明蛋白復合物βγ-CAT誘導人結腸腫瘤細胞HCT116發生凋亡。
圖9為本發明蛋白復合物βγ-CAT抑制黑色素瘤A375細胞生長。
圖10為本發明蛋白復合物βγ-CAT誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)遷移和傷口修復，A圖為βγ-CAT誘導HUVEC細胞遷移的量效關系圖，B圖為βγ-CAT誘導HUVEC傷口修復的量效關系圖。
圖11為本發明蛋白復合物βγ-CAT誘導人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)產生囊泡化，A圖為活體觀察βγ-CAT的囊泡化效應，B圖為氯化銨對βγ-CAT的囊泡化效應的影響，C圖為βγ-CAT的囊泡化效應的量效和時效曲線。
圖12為本發明蛋白復合物βγ-CAT通過囊泡化，經單泛素化修飾，直接轉運到人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞核，A圖為Cy3標記βγ-CAT顯示細胞核定位，B圖為FITC標記抗體原位雜交顯示βγ-CAT的細胞核定位，C圖為抗體免疫雜交分析βγ-CAT在細胞內的轉運中間體及其單泛素化修飾。

具體實施例方式 實施例1大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的分離純化，結構測定和α亞基和β亞基基因的分子克隆 (一)大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的分離純化 第一步將野外采集的活體大蹼鈴蟾飼養于實驗室內，用清水沖洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加適量的無水乙醚刺激，密閉容器3～5分鐘，待大蹼鈴蟾皮膚表面有大量的泡沫狀分泌物產生，打開容器，輕柔按摩動物背部皮膚，并用含5mM EDTA的生理鹽水溶液沖洗大蹼鈴蟾，收集皮膚分泌物，離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)，上清液冷凍干燥，即得皮膚分泌物。
第二步分子篩Sephadex superfine G-100層析將皮膚分泌物液凍干粉溶于緩沖液(50mM Tris-HCl buffer，pH7.8，containing 150mM NaCl and 5mM EDTA)，4℃過夜充分溶解后離心處理(5000rpm，4℃，20分鐘)取上清。上清液經0.45μm濾頭過濾后，上樣于以相同的緩沖液預先平衡好的AKTA Sephadex superfine G-100分子篩層析柱(2.6×100cm)，流速為1.0ml/min。按檢測器280nm的光吸收值收集第二峰初樣(見圖1A)。
第三步AKTA Mono-Q HR5/5陰離子層析柱經凍干濃縮和透析處理后(20mMTris-HCl，pH7.8，4℃透析24小時)，上樣于以透析緩沖液預先平衡好的AKTA Mono-QHR5/5陰離子層析柱，通過鹽梯度進行洗脫(A液20mM Tris-HCl，pH8.3；B液20mM Tris-HCl，pH8.3，containing 1M NaCl；A和B為等體積)。收集箭頭所示峰，即得大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物，見圖1B。
純化得到的大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的純度采用SDS-PAGE/NATIVE-PAGE測定，電泳方法參照Laemmli(Laemmli 1970)，蛋白條帶純度采用銀染方式檢測。
(二)大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的結構測定 1.βγ-CAT分子量測定βγ-CAT的表觀分子量采用Gel Pro V3.0軟件對銀染的SDS-PAGE(T＝10％)電泳膠進行分析。天然分子量測定采用分子篩排阻層析(Sephadexsuperfine G-100，2.6×100cm)，Phosphatase B(97.4kDa)，BSA(66.2kDa)，Ovalbumin(45.0kDa)，Chymotrypsin(25.0kDa)作為內參分子量標準，取1mg βγ-CAT上樣，流速為0.2ml/min，按5min/tube收集，計算βγ-CAT天然分子量，同時采用基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)檢測βγ-CAT的精確分子量。
2.βγ-CAT的蛋白定量βγ-CAT的蛋白定量測試采用BIO-RAD公司的PROTEIN ASSAYKIT，采用考馬斯亮蘭G-250染料，BSA做為濃度梯度標準校正曲線，依照產品技術手冊進行。
3.βγ-CAT的α亞基和β亞基的N末端氨基酸序列測定純化的βγ-CAT經SDS-PAGE(T＝10％)電泳后，轉移到PVDF膜上，使用美國Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列儀，用Edman降解法分別測定βγ-CAT的α亞基和β亞基的N末端氨基酸序列。
4.βγ-CAT的α亞基和β亞基的拆分采用HPLC1100系統Vydac C4 RP-HPLC層析柱來實現拆分βγ-CAT的兩個亞基。流動相分別為30％乙腈-70％去離子水-0.1％三氟乙酸和30％異丙醇-70％乙腈-0.1％三氟乙酸。
5.βγ-CAT的α亞基和β亞基的內肽序列分析將用VydacC4 RP-HPLC拆分得到的βγ-CAT的α亞基和β亞基采用胰蛋白酶/Endoprotease Glu-CV8消化參照產品指導進行，通過Applied Biosystems 476A型蛋白多肽序列儀進行序列分析。
6.βγ-CAT的α亞基和β亞基肽質量指紋圖譜的鑒定先將βγ-CAT的α亞基和β亞基先進行二硫鍵的還原及巰基保護(碘乙酰胺化)，處理方法為將0.1mg βγ-CAT溶解于100μl 0.5M pH8.5 NaHCO3中，再加入10μl 0.1 M DTT，于42℃反應60分鐘，然后加入20μl 0.2M碘乙酰胺室溫暗處反應2小時。再將處理的βγ-CAT經10％SDS-PAGE分離，用考馬斯亮蘭R-250染色，待脫色至背景清晰后切下采用PEBiosystems Voyager System 6192進行胰蛋白酶酶解肽質量指紋圖譜的測定。
(三)大蹼鈴蟾非晶狀體βr-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基和β亞基編碼基因的分子克隆 技術路線包括大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取，mRNA的純化及反轉錄，構建皮膚cDNA文庫，分別根據兩個亞基的N端已知序列和部分內肽片段序列，設計引物，利用PCR篩選法篩選編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子復合物βγ-CAT的α亞基和β亞基的基因。
1.大蹼鈴蟾皮膚總RNA提取活體大蹼鈴蟾用水清洗干凈，快速搗毀腦、脊髓處死動物，迅速剝皮，放入液氮中速凍4h，取150mg皮膚組織，加入2ml總RNA提取緩沖液，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30min，加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12,000rpm離心10min，取上清，加入等體積異丙醇，室溫放置10min，4℃，12,000rpm離心10min，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀物即為大蹼鈴蟾皮膚總RNA。
2.大蹼鈴蟾皮膚mRNA的純化采用美國Invitrogen公司的mRNA分離純化試劑盒進行純化。取大蹼鈴蟾皮膚總RNA 500μg溶于500μl經過DEPC處理的滅菌水中，65℃水浴10min，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠(隨mRNA分離純化試劑盒)輕彈混勻，至磁力架吸附30sec，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30sec，最后加0.1ml0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10min，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的離心管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30sec，移上清至上述離心管，上清中為純化的大蹼鈴蟾皮膚mRNA。加入1/10體積3 M乙酸鈉，pH5.2，等體積異戊醇，于-70℃放置30min，然后于4℃，12,000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
3.大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫的構建采用SuperScriptTM Plasmid cloning System(GIBCO/BRL)試劑盒來構建皮膚cDNA文庫，但是操作方法有所改進。cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)，于1.5ml試管中加入2μl NotI引物和7μl mRNA，3μl DEPC水，70℃保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4μl 5X第一鏈合成緩沖液，2μl0.1M DTT，1μl 10mM dNTP混合物，再加入1μl SuperScript II反轉錄酶，于37℃保溫1小時后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95μl DEPC水，30μl 5X第二鏈合成緩沖液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大腸桿菌DNA連接酶，4μl大腸桿菌DNA多聚酶I，1μl大腸桿菌RNA酶，反應總體積150μl，混勻后于16℃保溫2小時；加入2μl T4DNA多聚酶繼續保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140μl上層溶液轉移到干凈試管中，加入70μl 7.5 M乙酸銨，0.5ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。Sal I adapter的連接，上述沉淀溶于25μl DEPC水中，加入10μl 5XT4DNA連接酶緩沖液，10μl Sal I adapter，5μl T4DNA連接酶，反應總體積50μl，于16℃保溫16小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶切，于cDNA溶液中加入5μl酶切緩沖液，4μl Not I酶，反應體積50μl，于37℃保溫2小時。重復上述DNA的抽提和乙醇沉淀過程，沉淀溶解于100μlTEN緩沖液中。將cDNA樣品過DNA分級分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組分合并，體積為20μl，加入5μl酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸銨，0.6ml無水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN緩沖液中。合成的cDNA連接酶緩沖液，1μlpSPORT1質粒(Not I-Sal I酶水解，50ng)，4μl 5X T4DNA連接酶，反應體積20μl，室溫反應3小時，可準備轉化大腸桿菌HB101感受態細胞。感受態細胞的制備，挑取單個HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃培養過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養液中，37℃振蕩2小時，待菌液540nm 0.D.值為0.4時，4℃，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1M CaCl2重懸，分裝后置冰浴內備用。連接產物的轉化取上述連接產物5μl加入50μl感受態細胞冰浴20分鐘，42℃熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無氨芐青霉素的SOC培養基0.4ml，37℃培養1小時，取200μl涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37℃培養16小時，每個LB平皿用5ml LB液體培養基洗滌菌落，加10％甘油凍存構建的cDNA大約含4×105個單獨克隆。
4.βγ-CAT的β亞基的分子克隆按測定的N未端及內肽序列，我們設計了兩條引物，上游引物P1F和下游引物P3R，P1F5’-TT(CT)TCNGA(CT)(CT)TNCA(AG)ATAGG-3’，對應于βγ-CAT-β N端的1-7氨基酸殘基，P3R5’-ATNGGNTCNGC(TG)CT(TC)TTCCT-3’，對應于內肽102-108氨基酸殘基。以5μg mRNA為模板，以oligo-d(T)18為引物，獲得cDNA第一鏈。利用P1F和P3R兩條引物進行部分序列的PCR擴增。PCR條件為94℃ 2min，92℃10sec，50℃ 30sec，72℃90sec，共35個循環，72℃ 10min。所得片段克隆到pGEM-T載體(Promega)，測序，獲得目的序列。根據該序列設計特異引物，上游引物P85’-AGTCTGAAGTGTGCAGTTGCA-3’對應于β亞基成熟肽的8-14氨基酸殘基，和下游引物P86R5’-TAATGCATGAAAACAGCAGCC-3’，對應于β亞基成熟肽的80-86氨基酸殘基。以P8和P86R為特異性引物，參照張云文章中所述方法，在所構建的大蹼鈴蟾皮膚cDNA文庫中篩選βγ-CAT的β亞基全長cDNA克隆。篩選陽性克隆的方法細菌接種于96孔板上以8×8矩陣排列的方式培養于LB培養基(內含有100μg/ml胺芐青霉素)，總共64孔，每孔100μl 37℃培養過夜。第一輪篩選將細菌稀釋到1000個細菌/100μl，第二輪篩選稀釋至50個細菌/100μl。于64個培養孔按照橫豎方式分別合并細菌，由64孔合并為16孔，然后用引物進行PCR擴增，找出具有陽性克隆的孔再進行第二輪篩選，第二輪篩選結束后，將含目的克隆的培養細菌劃線培養，挑取單克隆進行PCR測定，最后篩選出陽性單克隆進行核苷酸序列測定。PCR條件94℃，2min；92℃10sec，50℃ 30sec，72℃ 40sec，共35個循環。
5.βγ-CAT的α亞基的分子克隆根據測序獲得的內肽片段序列，共設計合成15條正義引物和17條反義引物，將這些引物以一定的排列組合進行嵌套PCR，將PCR產物亞克隆進pGEM-T載體(Promega)，進行測序，篩選出含有βγ-CAT的α亞基內肽片段的亞克隆。以引物BMT-H-23(5’-ATTATT CTT TA(CT)gA(CT)gA(Ag)CC-3’)和BMT-H-23R(5’-gg(CT)TC(gA)TC(gA)TAA AgA ATA AT-3’)擴增出一個確定含有內肽的0.8kb片段。第二步，基于此cDNA片段序列設計專一引物進行cDNA篩庫。從獲得的cDNA片段序列，設計兩條專一引物正義引物P9(5’-GGTCTGAGCTTAGAACTCACCAGG-3’)，對應于βγ-CAT的α亞基的16-23氨基酸殘基，和反義引物P9R(5’-GAGCACCTGCCAAGAAGAAGC-3’)，對應于βγ-CAT的α亞基的121-127氨基酸殘基，進行下一倫篩庫以獲得陽性單克隆。獲得的克隆采用ABIPRISM 377 DNA(Applied Biosystems)測序儀進行測序。
6.編碼βγ-CAT的α亞基和β亞基的基因的確認 將由cDNA推導出的亞基全序列進行已獲得的亞基肽質量指紋圖譜進行驗證。將全序列和已有的亞基肽質量指紋圖譜數據輸入EXPASY FindPep Tool進行分析確認(//au.expasy.org/cgi-bin/findpept.pl)。
從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中純化的βγ-CAT，在SDS-PAGE膠中，還原與非還原條件下βγ-CAT均由兩條蛋白條帶組成，表觀分子量一條為18kDa(β亞基)，另一條為38kDa(α亞基)，表明兩個亞基通過非共價鍵形式存在。通過Gel Pro V3.0對兩條蛋白條帶含量分析表明，α亞基含量占55.5％，β亞基含量占44.5％，α和β亞基含量比例接近1∶1。在Native-PAGE膠中，銀染的βγ-CAT顯示只有一條帶，并且在濃縮膠中未觀察到有未進膠的蛋白條帶，表明在天然狀態下α和β兩個亞基是以非共價鍵形成βγ-CAT復合物。天然分子量測定實驗表明，βγ-CAT的天然分子量為72kDa。通過C4 RP-HPLC層析柱實現了βγ-CAT的兩個亞基的拆分，表明兩個亞基之間是通過疏水相互作用形成復合物。
通過測序分析獲得β亞基N末端15個氨基酸(FSDLQIGSLLHAVAA)，βγ-CAT的α亞基六段內肽片段，共102個氨基酸；β亞基四段內肽片段，共65個氨基酸。最終分別得到編碼βγ-CAT的α亞基和β亞基的cDNA全克隆(SEQ ID NO3編碼α亞基，見圖4；SEQ ID NO4編碼β亞基，見圖5)。根據cDNA推導出對應的α亞基(SEQ ID NO1，見圖2)和β亞基(SEQ ID NO2，見圖3)氨基酸全序列，能夠與已經獲得的N末端氨基酸序列和內肽序列片段完全匹配。同時，將由cDNA推導出的亞基氨基酸全序列輸入EXPASY FindPep Tool進行肽質量指紋圖譜分析，同已有的亞基肽質量指紋圖譜數據進行比較分析，得到的結果表明從獲得的全cDNA推導出的氨基酸序列的肽質量指紋圖譜與已獲得的亞基肽質量指紋圖譜匹配完全，即獲得的cDNA確切分別編碼βγ-CAT的α和β亞基。
分別將βγ-CAT的α亞基和β亞基的氨基酸全序列通過NCBI BLAST進行搜索分析，結果顯示在世界范圍內尚未有氨基酸序列相同的蛋白質或cDNA序列相同的基因報道。βγ-CAT的α亞基由336個氨基酸殘基組成，為非晶狀體βγ-晶狀體蛋白質超家族成員；而其β亞基成熟肽由146個氨基酸殘基，包含三個三葉因子結構域，因而將該蛋白質被命名為大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物(complex of non lens-βγcrystallin and trefoil factor)，縮寫為βγ-CAT。
實施例2大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物βγ-CAT體外ATPase和GTPase，核苷酸結合活性測定 核苷酸結合活性測試 βγ-CAT與核苷酸結合活性測試具體實驗流程為將βγ-CAT與10μM TNP-GTP/ATP(溶解于溶液50mM Tris-HCl(pH7.8)+20％(v/v)glycerol)在室溫孵育5分鐘，然后進行熒光激發測試(激發為410nm，發射為565-600nm)，與核苷酸類似物結合能力由575nm TNP-GTP/ATP熒光發射強度的改變來判斷。
GTPase/ATPase活性測試 βγ-CAT的GTPase/ATPase活性測試采用GTPase/ATPase比色kit(Innova Biosciences，UK，high sensitivity)，參照KIT指南進行，酶活單位為nmol/min。
結果表明βγ-CAT能夠與GTP/ATP的類似物TNP-GTP/TNP-ATP在體外實驗體系中結合，表明βγ-CAT具有GTP/ATP結合活性(見圖6A-B)。結合βγ-CAT在HUVEC中能夠快速轉運到細胞核中，調節基因表達，表明βγ-CAT可通過其GTPase/ATPase酶活性和NTP結合活性來發揮其轉錄激活，調節基因表達的功能。
同時βγ-CAT在體外檢測到了GTPase/ATPase活性，其酶活性分別為0.23nM/min和0.15nM/min(見圖6C)，通過WEB OF SCIENCE檢索，在世界范圍內尚未有相關報道，表明βγ-CAT為一類全新的GTPase/ATPase，。
實施例3大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物βγ-CAT對多種腫瘤細胞株的細胞毒作用 腫瘤細胞株HCT116，AGS，K562購自中國科學院上海細胞庫；腫瘤細胞株Hela，HT29，MCF-7，THP-1，A375，Hacat購自中國科學院昆明動物所細胞庫。
倒置顯微鏡(Olympus，USA)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，German)；35mm細胞培養皿(Corning，美國)，各種規格的細胞培養瓶(Corning，美國)。膠原酶(Sigma，美國)；胰酶(Sigma，美國)；青霉素，鏈霉素，四環素(Sigma，美國)；臺盼藍(Sigma，美國)；胎牛血清(Hyclone，美國血源)；各種培養基(M199，McCoy’s 5a，MEM，Ham’sF12K，RP1640)(Gibco，美國)，血栓調節蛋白抗體(Invitrogen，美國)，熒光素FITC-標記的羊抗兔二抗(Invitrogen，美國)；熒光素標記的低密度脂蛋白(Invitrogen，美國)；生化試劑(EDTA，DMSO，丙酮，Triton-100，NaCl，KCl，NaHCO3，KH2PO4等，Amersco)。
(一).各種腫瘤細胞的培養 1.1結腸癌細胞株HCT116，HT29。
1.購買結腸癌細胞株HCT116，HT29。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無微生物污染。
2.更換培養基為McCoy’s 5a培養基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，至細胞長至90％滿度。
3.棄培養基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量McCoy’s 5a培養基(含有1.5mM L-谷氨酰胺，2.2g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養箱中培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
1.2乳腺癌細胞株MCF-7。
1.購買乳腺癌細胞株MCF-7。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無其他微生物污染。
2.更換培養基為MEM(Eagle)培養基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.1M非必須氨基酸，1mM丙酮酸鈉，0.01mg/ml牛胰島素，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，至細胞長至90％滿度。
3.棄培養基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量MEM(Eagle)培養基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，0.1M非必須氨基酸，1mM丙酮酸鈉，0.01mg/ml牛胰島素，10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養箱中培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
1.3胃腺癌細胞株AGS。
1.購買胃腺癌細胞株AGS。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無其他微生物污染。
2.更換培養基為Ham’s F12K培養基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，至細胞長至90％滿度。
3.棄培養基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量Ham’s F12K培養基(含有2mM L-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氫鈉，10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養箱中培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
1.4宮頸癌表皮細胞株Hela。
1.購買宮頸癌表皮細胞株Hela。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無其他微生物污染。
2.更換培養基為RP1640培養基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，至細胞長至90％滿度。
3.棄培養基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量RP1640培養基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養箱中培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
1.5急性白血病單核細胞株THP-1；慢性髓原白血病細胞株K562。
1.購買急性白血病單核細胞株THP-1。復蘇本實驗室保存慢性髓原白血病細胞株K562。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無其他微生物污染。
2.更換培養基為RP1640培養基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，懸浮培養至細胞數明顯增加。
3.加入新鮮RP1640培養基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
4.置37℃，5％CO2培養箱中懸浮培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
1.6皮膚癌細胞株惡性黑色素瘤細胞株A375；病毒轉染的永生化角質細胞Hacat。
1.購買皮膚癌惡性黑色素瘤細胞株A375；病毒轉染的永生化角質細胞Hacat。置倒置顯微鏡下觀察，細胞狀態良好，無其他微生物污染。
2.更換培養基為RP1640培養基(含有10％胎牛血清)。置37℃，5％CO2培養箱中培養幾天，持續觀察無任何污染，至細胞長至90％滿度。
3.棄培養基。PBS清洗兩次。
4.0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)清洗一次。
5.加入0.25％胰酶溶液(含有0.53mM EDTA)消化5min。
6.加入適量RP1640培養基(含有10％胎牛血清)，重懸浮細胞，分入2-3個培養瓶中。
7.置37℃，5％CO2培養箱中培養，至細胞長至90％滿度，進行實驗測試。
(二)MTT法測定βγ-CAT對腫瘤細胞的細胞毒作用 1.分別消化長至90％滿度的腫瘤細胞株HCT116，HT29，MCF-7，AGS，Hela，A375，Hacat，THP-1，K562。調整細胞懸液濃度至2.5×105 cell/ml。接種于96孔板中，每孔200μl。
2.置37℃、5％CO2培養箱中過夜培養。
3.更換新鮮培養基，37℃、5％CO2培養箱中放置2小時。
4.加入βγ-CAT至終濃度分別為0，5nM，25nM和100nM。同時設置凋零孔，對照孔，每組設定3復孔。37℃、5％CO2培養箱中孵育30min。
5.離心，小心吸去上清。PBS輕輕洗滌，再次離心，棄上清。
6.每孔加入180ul新鮮M199培養液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，繼續培養4h。
7.終止培養，離心，小心吸去孔內培養液。PBS輕輕洗滌，再次離心，棄上清。
8.每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀595nm處測量各孔的吸光值。
9.計算細胞存活率[(對照孔-凋零孔)-(實驗孔-凋零孔)]/(對照孔-凋零孔)×100％。
MTT法測定結果顯示，βγ-CAT對9種不同的腫瘤細胞表現出明顯的細胞毒選擇性。如圖7所示，圖中橫坐標為βγ-CAT的濃度，縱坐標為癌細胞的存活率。βγ-CAT在0，5，25，100nM四個濃度時對5種不同的腫瘤細胞表現出顯著的體外細胞毒作用，隨著βγ-CAT濃度增加，癌細胞存活率降低，細胞毒作用增強，顯示出明顯的量效關系，即具有劑量依賴性。βγ-CAT在0，5，25，100nM四個濃度內對腫瘤細胞AGS，Hacat，A375和K562無明顯的細胞毒活性。βγ-CAT對具有細胞毒作用的癌細胞表現出高效的細胞毒活性，其對低分化結腸腺癌細胞HCT116的CC50為3nM，為最敏感；對結腸腺癌細胞HT29的CC50為3nM；對乳腺癌細胞MCF-7的CC50為75nM；對急性白血病單核細胞THP-1的CC50為60nM；對宮頸癌表皮細胞Hela的CC50為100nM。
實施例4大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物體外誘導結腸癌細胞株HCT116細胞凋亡 凋亡DNA抽提試劑盒(上海華舜)；瓊脂糖；乙醇(Amresco)；UV凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)，TUNEL染色試劑盒，細胞色素c釋放檢測試劑盒(Invitrogen，美國)；Caspases酶活性測定試劑盒(Calbiochem)；PI，Hoechst(Sigma，美國)；流式細胞儀(FACSVantage SE，Becton Dickinson)；熒光分光光度計(Perkin Elmer LS50B)所需溶液 1)PI溶液將PI溶于PBS(pH7.4)中，終濃度為100μg/ml，含RNase 100μg/m用棕色瓶4℃避光保存。
2)Hoechst染色液用雙蒸水配成1mg/ml，pH7.0。使用時，將Hoechst 33342儲液加入培養的細胞中，終濃度為10μg/ml。
3)D-Hanks液配方(g/L)KCl，0.4g；KH2PO4，0.06g；NaCl，8.0g；NaHCO3，0.35g；Na2HPO4·7H2O，0.09g；酚紅，0.01g。
4)PBS緩沖液配方(g/L)NaCl，8.0g；KCl，0.2g；Na2HPO4·H2O，1.56g；KH2PO4，0.2g。
1.流式細胞法檢測細胞凋亡的發生 在長到90％滿度的HCT116細胞中，加βγ-CAT后，在37℃、5％CO2培養箱中分別孵育30min和2h，同時設立陰性對照(加入PBS)。中止培養后，平行組細胞分別用下述的PI單染色法和PI/Hochest染色法染色，在流式細胞儀上檢測HCT116，HT29，A375，THP-1的細胞凋亡情況。
A.PI單染色法測定經βγ-CAT處理后二倍體亞峰的產生 1.在長到90％滿度的細胞培養瓶中，加βγ-CAT至終濃度為25nM，在37℃、5％CO2培養箱中孵育不同時間0h，2h，4h，12h。設立陽性對照(加入H2O2)和陰性對照(加入PBS)。
2.收集細胞離心，棄上清液。
3.PBS清洗一次。
4.離心棄去PBS，加入預冷的70％的乙醇固定，4℃，15min。
5.離心棄去固定液，PBS緩沖液重懸。
6.用1ml PI染液，4℃避光，染色30min。
7.流式細胞儀上檢測。
B.PI和Hochest雙染色法測定經βγ-CAT處理后二倍體亞峰的產生 1.在長到90％滿度的細胞培養瓶中，加βγ-CAT至終濃度分別為0nM，5nM，30nM，100nM。在37℃、5％CO2培養箱中孵育2h。
2.中止培養，傾出上層培養基。PBS清洗兩次，與上層培養基合并。
3.胰酶溶液消化貼壁細胞，收集細胞懸液與2中的溶液合并。
4.離心，棄上清液。
5.PBS清洗一次。
6.加入Hochest染色液，4℃避光，染色10min。
7.加入0.5ml PI染液，4℃避光，染色10min。
8.流失細胞儀上檢測。
2.TUNEL染色法檢測 培養HCT116細胞于蓋玻片上，加入βγ-CAT(終濃度分別為5nM，25nM，100nM)，在37℃、5％CO2培養箱中分別孵育2小時。設立陰性對照(只加入PBS緩沖液)。中止培養。按TUNEL KIT中染色法進行染色，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。
3.試劑盒檢測細胞色素c釋放 培養HCT116細胞于蓋玻片上。加βγ-CAT至終濃度分別為5nM，25nM，100nM，在37℃、5％CO2培養箱中分別孵育2小時。設立陰性對照(只加入PBS緩沖液)。中止培養，吸出上層培養基，PBS清洗兩次。按照試劑盒操作步驟對細胞進行固定，透明，封閉，染色等步驟。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
4.Caspases酶活性測定 在長到90％滿度的HCT116細胞中，分別加入不同濃度的βγ-CAT，在37℃、5％CO2培養箱中孵育2h。設立陰性對照(加入PBS)。中止培養，傾出上層培養基。PBS清洗兩次，與上層培養基合并。離心，棄上清液收集細胞。實驗分為兩個平行組。一個組中僅檢測貼壁細胞；一個組中檢測貼壁細胞和上清液所有收集細胞。裂解液裂解收集的所有細胞，測定并調整總蛋白質的濃度。處理細胞，分別加入試劑盒中的各種底物。37℃孵育2小時。熒光分光光度計檢測。結果計算Caspases酶活性表示為每μg總蛋白每個小時的最大熒光凈增量。
結果表明，βγ-CAT能夠誘導HCT116腫瘤細胞發生凋亡。βγ-CAT(濃度為0nM，5nM，30nM，100nM)分別處理30分鐘和2小時，通過PI/Hochest雙染料染色法染色能夠明顯地看到死亡細胞數隨著劑量的增加、孵育時間的延長而增加(被PI穿透的細胞數明顯增多)，即βγ-CAT能夠以劑量，時間依賴的方式誘導HCT116發生凋亡。
HCT116經βγ-CAT處理后，TUNEL染色陽性，能夠檢測到線粒體細胞色素c的釋放和caspases酶激活。在整體細胞(包括脫落的細胞和貼壁細胞)中，caspase-1/2/6/8/9被大量的激活，表明βγ-CAT能夠誘導腫瘤細胞HCT116通過經典凋亡途徑發生凋亡(見圖8)。
實施例5大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物βγ-CAT體外抑制惡性黑色素瘤細胞株A375的生長 MTT法測定βγ-CAT對黑色素瘤細胞株A375的生長的狀態影響 1.消化長至90％滿度的黑色素瘤細胞株A375，調整細胞懸液濃度至104cells/ml。接種于96孔板中，每孔200μl。同時設定已知的不同細胞濃度的孔以作對照。
2.置37℃、5％CO2培養箱中培養約6小時，至細胞貼壁后，更換含有βγ-CAT不同終濃度的培養基(從0-25nM)，培養不同的時間(共7天)。每隔24小時，MTT法測定當天的細胞數，并更換一次含有相應濃度的βγ-CAT培養基。每個劑量和時間點都設定三個復孔。
3.計算每天細胞的存活率。并作生長曲線。
如圖9所示，在體外βγ-CAT能夠顯著的抑制皮膚癌惡性黑色素瘤細胞A375的生長。隨著βγ-CAT濃度的增加(25pM，50pM，250pM，1nM，5nM，25nM)，細胞數減少，細胞生長受到明顯抑制，表現出明顯的量效關系，即具有劑量依賴性。
實施例6大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物βγ-CAT促進人源臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞遷移和傷口修復測定 嬰兒臍帶來自自愿捐贈者；膠原包被的Boyden chamber細胞遷移測定試劑盒；VEGF(Singma，美國)；EGF(Singma，美國)。
1)Harvesting緩沖液含有2mM EDTA的PBS緩沖液。
2)Quenching Medium含有5％BSA的無血清完全培養基。
3)饑餓培養基HUVEC饑餓培養基含有2％胎牛血清的HUVEC完全培養基。
HUVEC的培養和鑒定 (一).HUVEC的原代培養 1.在無菌條件下，取健康產婦分娩后新鮮的嬰兒臍帶，(長20cm以上，不宜超過6小時)，選擇無夾痕，無扭曲，無凝血阻塞的部分。
2.在臍靜脈兩端開口處，分別用絲線扎緊并固定在50ml注射器和帶輸液膠管的玻璃插管上，注入D-Hanks液沖洗臍靜脈，至無血跡。
3.從一端的注射器向臍靜脈徐徐注入0.1％膠原酶溶液，至血管充盈。注意兩端封閉，以防止液體返流。立即放入37℃的無菌D-Hanks液中，10min后取出。
4.通過注射器吸取收集酶液，同時注入含20％胎牛血清的199培養液沖洗靜脈。合并于同一離心管中，以1000rpm/min離心7-10min。
5.棄去離心沉淀后的上清液，加入20％胎牛血清的199培養液重新懸浮細胞，并調整至細胞密度為1.5-2.0×105個/ml，接種于培養瓶中或培養皿中，置37℃、5％CO2培養箱中培養。
6.第2天棄培養液，用D-Hanks液輕輕洗1次，以去除不貼壁的細胞或死細胞，換入新鮮含20％胎牛血清、抗生素的199培養液。繼續置37℃、5％CO2培養箱中培養。
7.每2-3天換液一次。每次換1/2-2/3量。待細胞長至融合狀態后，即可傳代。
(二).HUVEC的傳代培養 1.待原代培養的細胞長至融合狀態后，棄培養液，用預溫的D-Hanks液清洗2次，加入0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA混合消化液，正好形成一淺層液面將細胞覆蓋，室溫下消化1-2min。
2.鏡下見細胞變圓，細胞間隙增寬后，立即翻轉培養瓶，棄酶液。
3.可再用D-Hanks液輕輕洗1次，加入新鮮含10％胎牛血清，和抗生素的M199培養液。
4.用吸管吸取培養液，輕輕將細胞捶打下來，調整細胞密度至1.5×105cells/ml，按實驗需要接種到新的培養瓶或其他培養器皿中。一般按照1∶2-1∶3的比例傳代。
5.每隔2-3天換液一次，每次換掉2/3量。待細胞長至融合狀態，又可傳代。
(三).HUVEC的鑒定 1.光鏡下觀察。就培養瓶在倒置顯微鏡下直接觀察。內皮細胞成扁平的短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區域較無核的區域突出，細胞呈單層鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列生長，并有接觸抑制現象。
2.血栓調節蛋白抗體免疫熒光染色。
2.1胰酶消化已經長至90％滿度的HUVEC為單細胞懸液。
2.2使用血球計數板上計算細胞濃度，調整細胞濃度到1×105細胞每毫升培養基。
2.3接種1ml細胞懸液到放置于35mm小皿中蓋玻片上，置37℃，5％CO2培養箱中培養過夜。
2.4光鏡下觀察，細胞貼壁狀態及生長狀態正常。更換培養基，置37℃，5％CO2培養箱中穩定2小時。
2.5棄上層培養基，用D-Hanks清洗兩次。
2.6丙酮固定。用D-Hanks清洗。Triton-100穿透。用D-Hanks清洗。
2.7加入抗血栓調節蛋白抗體，4℃，孵育過夜。
2.8 D-Hanks清洗三次。加入商業化FITC-標記的羊抗兔二抗，4℃，孵育過夜。
2.9 D-Hanks清洗三次。封片。
2.10激光共聚焦顯微鏡下觀察。
細胞遷移活性測定(Cell migration assay) 采用Boyden Chamber(Chemicon，美國)系統來測定細胞遷移活性，具體操作步驟如下 1.準備和收集實驗細胞HUVEC培養到約80％滿度。更換細胞培養基為無血清培養基，饑餓細胞約18小時。倒置顯微鏡下觀察細胞狀態。PBS清洗細胞。加入Harvesting緩沖液消化細胞5min。加入足量Quenching Medium中和消化液中的胰酶和EDTA。離心，棄上清。加入少量Quenching Medium重新懸浮細胞。計數，調整細胞濃度至2.5×106cells/ml。
2.藥物處理按照試劑盒說明將細胞300μl加入到所需的chamber室里同時加入VEGF25pM作為陽性對照，PBS，作為陰性對照；加入25pM βγ-CAT，50pM βγ-CAT。在37℃、5％CO2培養箱中孵育24小時。中止培養。倒置顯微鏡下，拍照。
3.細胞染色和分析用槍頭和棉簽完全移走chamber室內朝里面的所有培養基和細胞。使用試劑盒內部提供的結晶紫染色液，室溫下對細胞染色30min。染色結束后，用PBS清洗3次，并完全浸入去離水中清洗。倒置顯微鏡下，拍照。加入抽提緩沖液，抽提細胞內色素結晶紫。分光光度計，550nm波長讀數。計算并比較不同藥物濃度下的細胞遷移率。
傷口修復活性測定(Wound healing assay) 采用人工劃傷模型來測定βγ-CAT的體外傷口修復活性，具體操作步驟如下 1.消化并收集HUVEC，調整細胞濃度為1×106cells/ml。接種2ml細胞懸液至膠原預鋪被的6孔培養板中，在37℃、5％CO2培養箱中過夜培養。
2.倒置顯微鏡下，觀察至細胞完全貼壁，鋪滿培養板底。
3.用200μl槍頭劃線，造成人工的“傷口”模型。PBS清洗去除漂浮的、死亡的細胞，更換培養基為饑餓培養基。在37℃、5％CO2培養箱中穩定2小時。倒置顯微鏡下，拍照。
4.在HUVEC中，加入βγ-CAT至終濃度為25pM；50pM。設立陽性對照，HUVEC中加入VEGF 25pM。設立陰性對照，加入體積相同的PBS。在37℃、5％CO2培養箱中孵育。每隔24小時，更換一次饑餓培養基，并補充藥物至相應的濃度；倒置顯微鏡下，拍照，記錄下“傷口”的閉合情況。
5.持續觀察72小時。
6.以上的實驗重復3次以上。
在倒置顯微鏡下觀察到原代培養的人臍靜脈內皮細胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均勻，胞核清晰，呈卵圓形。有核的區域較無核的區域突出，細胞呈單層鵝卵石樣或鋪路石樣鑲嵌狀排列生長，并有接觸抑制現象。血栓調節蛋白抗體免疫熒光染色呈陽性。表明體外原代培養人臍靜脈內皮細胞成功。在整個實驗的過程中，使用的都是第二代到第三代的HUVEC進行實驗。
結果表明，在膠原包被的基質上，βγ-CAT能夠誘導HUVEC細胞遷移和傷口修復。在極低濃度(25pM和50pM)的下，βγ-CAT能夠以劑量依賴的方式誘導HUVEC細胞穿過膠原鋪被的Boyden chamber的板底面(圖10A左)。25pM濃度下，發生遷移而穿過膜底面的細胞大約為陰性對照的1.5倍；50pM濃度下，發生遷移的細胞數量增大為陰性對照的3倍左右；高于25pM的血管內皮生長因子(VEGF)對HUVEC細胞的遷移誘導作用。在倒置顯微鏡下，可以清晰地看到穿過膜底面的細胞數明顯增加(圖10A右)。
傷口修復(Wound healing)結果表明，βγ-CAT能夠以劑量依賴的方式誘導HUVEC細胞在膠原鋪被的基質上完成“人工傷口”的閉合。在陰性對照中，72小時后，傷口”仍然保持比較大的開放狀態，遷移到傷口面上的細胞也非常少；在VEGF處理陽性對照中，隨著時間的推移，過傷口逐漸變小，72小時后，“傷口”基本上已經合攏。βγ-CAT處理的傷口隨著時間的增加逐漸閉合，50pMβγ-CAT處理的效果比25pMβγ-CAT處理的效果明顯。72小時后，50pMβγ-CAT處理的“傷口”基本上接近閉合(圖10B)。
同時，將拆分的βγ-CAT的α亞基和β亞基分別進行細胞遷移和傷口修復活性測試，結果表明在100nM的濃度下，未觀察到單獨的βγ-CAT的α亞基和β亞基具有明顯的上述活性，從而進一步表明βγ-CAT的α亞基和β亞基需要協同作用，才能發揮其高效的生物學活性。
目前報導的重組人源三葉因子2(hTFF2)可以以3-6倍的效率增加大鼠小腸隱窩上皮細胞(rat intestinal epithelial cell Lines，IEC-6)的細胞遷移能力，但是其所需要的濃度太高，約為83μM。本發明提供的大蹼鈴蟾創傷修復和抗腫瘤蛋白βγ-CAT誘導細胞遷移時候所需要的濃度僅在皮摩爾(pM)水平，活性比其他報道的單鏈三葉因子蛋白大約要高一百萬倍左右。
實施例7大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物βγ-CAT通過囊泡化直接轉運到人源臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞核，調節基因表達 (一).βγ-CAT誘導人源臍靜脈內皮細胞(HUVEC)發生囊泡化 1.活體觀察生長在35mm細胞培養皿中的HUVEC，觀察狀態良好后，更換新鮮培養基。穩定2小時。放置于激光共聚焦顯微鏡的二氧化碳培養小室中，培養，拍照。
加入βγ-CAT 30nM，活體觀察HUVEC的細胞形態變化。放大倍數200倍，每隔10秒連續拍照。
2.中性紅染色生長在35mm細胞培養皿中的HUVEC，觀察狀態良好后，更換新鮮培養基。穩定2小時。加入βγ-CAT 30nM處理細胞30min，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養基。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3.劑量效應生長在35mm細胞培養皿中的HUVEC，觀察狀態良好后，更換新鮮培養基。穩定2小時。加入不同濃度的βγ-CAT(nM)處理細胞30min，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養基。然后每孔加入100 ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性紅。540nm讀數。設置3個復孔；設置對照孔和凋零孔。陽性對照，NH4Cl 8mM作用18小時； 陰性對照，PBS孵育18小時。
4.NH4Cl依賴實驗生長在35mm細胞培養皿中的HUVEC，觀察狀態良好后，更換新鮮培養基。穩定2小時。分別對細胞進行4種處理1)PBS，2)PBS和NH4Cl，3)PBS和βγ-CAT，4)NH4Cl和βγ-CAT。作用30min后，中性紅染色液100μl染色4min。用150μl 0.9％的生理鹽水洗滌兩次，移去含有藥物的培養基。然后每孔加入100ul的酸化乙醇(50％ethanol in 1％acetic acid)以提取中性紅。540nm讀數。
(二).βγ-CAT轉運到人源臍靜脈內皮細胞(HUVEC)細胞核 1.βγ-CAT標記熒光染料Cy3，細胞核定位觀察 熒光染料Cy3標記按照試劑說明標記βγ-CAT分子，并經過G50分子篩分離純化。生長在35mm細胞培養皿中的HUVEC，觀察狀態良好后，更換新鮮培養基。放置于激光共聚焦顯微鏡的二氧化碳培養小室中，培養，拍照。加入Cy3標記-βγ-CAT 30nM，熒光下實時觀察βγ-CAT分子的細胞定位。放大倍數200倍，每隔10秒連續拍照。
2.熒光染料FITC標記輕重鏈抗體，37℃條件下對βγ-CAT輕鏈和重鏈的細胞定位 2.1βγ-CAT的α和β亞基兔源多克隆抗體的生產新西蘭大白兔耳靜脈采血，分離血清，作為抗血清的陰性對照。經多步驟分離純化的βγ-CAT蛋白質在12％SDS-PAGE上電泳，電泳結束后，分別割下約位于1.8kDa和3.6kDa分子量處的βγ-CAT的α和β亞基條帶，進行膠回收。回收蛋白質，測定蛋白濃度，并用磷酸緩沖液調整蛋白質濃度為1mg/ml。與同體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化。背部皮下多點注射，免疫新西蘭大白兔，注射8-10點，總體積為400μl。以后每隔10天，用與第一次同等劑量的βγ-CAT與不完全佛氏佐劑的乳化液進行加強免疫，共四次。最末一次免疫后五天，耳緣靜脈取血，分離血清，用免疫酶聯吸附(ELISA)實驗測定抗體效價。當抗體效價達到為1/5000左右時，處死免疫兔，收集血液。將血液置于37℃保溫1h后于4℃放置過夜，2,000g離心5min，收集血清。通過硫酸胺沉淀法，去除非IgG免疫球蛋白質。純化抗體溶解于PBS緩沖液中，小量分裝并保存于-20℃，用于實驗。
2.2 FITC分別標記α和β亞基抗體用碳酸鈉緩沖液(sodium carbonate buffer，0.1M，pH9)將兔源的βγ-CAT的α和β亞基多克隆IgG抗體的蛋白質濃度調節到2mg/ml。FITC按照1mg/ml的濃度溶解于DMSO中。每毫升的蛋白質溶液，加入50微升的FITC。
每次緩慢的加入5ul的溶液，同時輕輕的不斷的搖晃。加完所有的FITC后，將混合物置于黑暗中，4℃，反應8小時。加入NH4Cl至終濃度為50mM，4℃孵育2小時，封閉未結合的FITC。加入二甲苯青至0.1％，甘油至5％。分子篩(G50)層析分離未結合的FITC和已標記的蛋白質分子。標記好的蛋白質分子先流出，而二甲苯青和未標記的FITC則后流出。4℃避光保存。可加入疊氮鈉至終濃度為15mM。產物的蛋白質的熒光比例可由495nm和280nm的吸收值來計算。
3.細胞培養和藥物處理消化HUVEC，接種于蓋玻片上。倒置顯微鏡下觀察，細胞長到約90％滿度時，加入βγ-CAT至終濃度為10nM，分別在37℃，5％CO2培養箱中和4℃的條件下，孵育不同的時間5min；30min；2h。孵育結束后中止培養。
4.顯微鏡觀察小心吸走上層培養基。磷酸緩沖液清洗細胞表面兩次。4％多聚甲醛固定細胞，室溫下放置20min。磷酸緩沖液清洗細胞表面兩次。0.1％Triton-X 100透明，室溫下放置10min。磷酸緩沖液清洗細胞表面兩次。2％BSA封閉，4℃，過夜孵育。加入2％牛血清白蛋白稀釋的標記抗體(1/200)100μl，室溫下避光放置，1小時。2％BSA清洗細胞表面三次。磷酸緩沖液清洗細胞表面三次。PI染液復染核，室溫下避光放置5min，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察。
(三).Western Blot檢測βγ-CAT的細胞定位。
3.1藥物處理細胞在長至90％滿度的HUVEC株中，加入βγ-CAT至終濃度為25nM，在37℃，5％CO2培養箱中孵育30min，中止培養。吸出上層培養基，用磷酸緩沖液清洗兩次貼壁細胞表面，與上層培養基合并。離心(1000rpm，5min)，棄上清，用磷酸緩沖液洗滌三次，離心。然后加入細胞裂解液(SIGMA，美國)裂解細胞沉淀及培養瓶壁的貼壁細胞，冰上放置15min。吸出細胞裂解液，加入6×SDS加樣緩沖液，10％SDS-PAGE上電泳，100V，2小時。電泳結束后，轉膜。
3.2 Western Blot分析Western Blot分析按標準實驗流程進行，分別用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CATα亞基和抗-βγ-CAT β亞基多克隆兔源抗體和兔源抗單泛素的(rabbitanti-mono-ubiquitin)單克隆抗體作為一抗，二抗為羊抗兔的辣根過氧化物酶偶聯的抗體(conjugated-HRP goat anti-rabbit antibody)，采用ECL(PIERCE)化學發光底物檢測信號，采用X-膠片壓片顯影。
(四).采用人基因組Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix，USA)RNA芯片分析βγ-CAT對HUVEC細胞基因表達的調節 4.1βγ-CAT處理HUVEC，抽提總RNA將βγ-CAT(25nM)加入75cm2培養瓶中的HUVEC(三代之內，95％滿度)中，37℃孵育2小時，按照TRIzol KIT中步驟抽提總RNA，陰性對照為溶劑對照。抽提得到的總RNA，用1％瓊脂電泳進行分析。
4.2.RNA芯片雜交實驗 1)將抽提的HUVEC總RNA進行定量和質檢，滿足要求的RNA樣品備用； 2)利用雙輪cRNA擴增，生物素標記法對樣品進行靶標制備，然后用于芯片雜交； 3)用Fluidics Station 450進行洗脫和染色，然后用Scanner3000掃描芯片； 4)用GeneChip Operating software(GCOS 1.4)分析軟件對芯片圖像進行分析， 把圖像信號轉化為數字信號。
4.3.芯片數據分析將原始數據采用dChip3.0軟件做校正和歸一化處理，篩選出信號值＞100并且P Value值為P和M的檢測值。
4.4.表達差異基因的篩選和展示采用SAM3.0軟件對四次生物學重復的芯片配對進行表達差異性分析，設定篩選域值為fold change≥3，q value＝0，(false discoveryrate)FDR＝0，共獲得123個顯著性差異表達的基因。用Cluster和Treeview來展示顯著性差異表達的基因。
結果表明 1.通過活體觀察顯示，βγ-CAT能夠誘導HUVEC在10min內發生快速囊泡化。中性紅染色可觀察到明顯的囊泡化(圖11A)，而且βγ-CAT形成的囊泡化是不依賴于NH4Cl的，但在低濃度的NH4Cl的存在下，能夠增強βγ-CAT的囊泡化(圖11B)。當βγ-CAT的終濃度為2nM時，能夠引起HUVEC的最大的囊泡化。以后，隨著濃度的增高，測量到的囊泡化程度反而降低(圖11C)，這可能是由于高濃度的βγ-CAT直接引起HUVEC的脫落造成活細胞數目下降的緣故。實驗數據表明βγ-CAT能夠通過囊泡化直接轉運到HUVEC的細胞中。
2.分別通過熒光染料Cy3標記βγ-CAT和熒光染料FITC標記βγ-CAT的α和β亞基抗體，在激光共聚焦顯微鏡下實時觀察可見，βγ-CAT被迅速轉運到HUVEC細胞核。在37℃條件下，可見βγ-CAT快速內吞進入細胞內，30min時被轉運到細胞核中，2小時觀察βγ-CAT-α亞基完全集中細胞核區域，而βγ-CAT-β亞基主要分布在細胞核外周區域(圖12A-B)。
3.βγ-CAT(10nM)37℃ 30分鐘處理HUVEC后，分別采用抗-βγ-CAT，抗-βγ-CAT-α亞基和抗-βγ-CAT-β亞基兔源多克隆抗體作為檢測探針，通過免疫雜交(Western Blot)來分析βγ-CAT在HUVEC內的細胞核定位。結果表明，βγ-CAT能夠形成了SDS穩定的，分子量為150kDa的大分子復合物。同時通過單泛素的兔源單克隆抗體檢測到150kDa的大分子復合物中有泛素化修飾。同時結合免疫熒光共聚焦顯微鏡，可觀察到熒光染料Cy3標記的單泛素的兔源單克隆抗體熒光信號與FITC標記βγ-CAT-α亞基抗體信號重合，表明βγ-CAT能夠被單泛素修飾后形成(圖12C)。
4.βγ-CAT(25nM，2小時)處理HUVEC后，引起顯著性差異表達變化的基因共有123個，主要集中為細胞轉錄因子，DNA結合轉錄調節因子，細胞炎癥相關的細胞因子，細胞生長和凋亡相關調節蛋白和細胞組織重建相關的金屬蛋白酶等，例如早期生長反應相關家族因子，細胞轉錄因子(如IL-6，IL-8，IL-1α)，DNA結合轉錄調節因子，核受體亞家族4受體，金屬蛋白酶，Kruppel-like factors和Fos members。這些基因都與細胞有絲分裂，分化和生長，以及組織的再生和修復等基本生命活動有密切聯系。數據表明βγ-CAT通過調節細胞上述基因的差異表達，從而促進細胞生長，遷移和創傷修復。
序列表
<110>中國科學院昆明動物研究所
<120>大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物和基因及制法及用途
<160>4
<210>1
<211>336
<212>PRT
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>1
Met Ser Glu Asn Lys Ile Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Ser Phe Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ser Leu Glu Leu Thr Arg Ser Gln Thr Lys Leu Ala Arg Gln Asn
20 25 30
Phe Ser Lys Ala Ala Ser Ser Leu Arg Val Ile Gly Gln Pro Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Thr Gln Asn Phe Phe Lys Gly Glu Ala Arg Val Tyr Glu Glu
50 55 60
Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Asp Val Asp Asn Lys Ile Met Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Leu Ala Ser Leu Gly Asp Pro Val Ile Lys Leu Phe Glu Gly
85 90 95
Gln Ser Leu Ser Gly Lys Ser Ile Val Val Asn Glu Ala Ala Ile Leu
100 105 110
Asn Phe Gly Lys Leu Glu Asn Gly Ala Ser Ser Trp Gln Val Leu Ser
115 120 125
Gly Ala Trp Lys Ile Cys Asp Glu Val Lys Asp Asn Pro Arg Tyr Lys
130 135 140
Val Ser Asn Val Ala Asp Met Val Phe His Tyr Ser Glu Thr Gly Leu
145 150 155 160
Ser His Ser Ala Leu Ser Ile Tyr Pro Leu Leu Ala Gly Lys Pro Lys
165 170 175
Leu Thr Thr Asn Val Gln Trp Asp Arg Lys Lys Glu Leu Ser Asn Arg
180 185 190
Val Ser Gln Leu Asp Glu Ile Ile Val Val Asn Lys Ser Lys His Glu
195 200 205
Gln Asp Phe Ser His Ser Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Val Glu Met Lys Phe Ser Asn Glu Thr Thr Ile Glu Leu Gly Ala Ser
225 230 235 240
Phe Lys Val Pro Leu Ile Gly Glu Leu Ser Thr Thr Leu Thr Gln Thr
245 250 255
Ile Ser Ile Glu Lys Gly Lys Thr Glu Gly Thr Ser Thr Thr Val Thr
260 265 270
Asn Lys Val Thr Ile Pro Val Thr Val Pro Ala Asn Thr Lys Val Thr
275 280 285
Ile Asn Val Met Arg Arg Asp Ile Ser Tyr Ser Val Pro Val Glu Ile
290 295 300
Ile Ile Glu Arg Asn Asn Ala Arg Lys Ala Glu Tyr Ala Glu Leu Ile
305 310 315 320
Cys Arg Asp Gly Thr Asp Val His Ile Ser Arg Asn Asp Glu Ala Val
325 330 335
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>2
Met Ala Ser Lys Met Phe Phe Ile Val Thr Ile Ala Leu Ala Ile Gly
-20 -15 -10 -5
Cys Gly His Gly Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu Lys Cys Ala
-1 1 5 10
Val Ala Ala Tyr Asp Arg Ile Ala Cys Pro Gly Asn Thr Lys Glu Gln
15 20 25
Cys Asn Ala Arg Arg Cys Cys Tyr Asp Asn Arg Gln Ser Gly Ala Ile
30 35 40
Trp Cys Phe Arg Gln Arg Asp Leu Arg Pro Gly Cys Tyr Ile Asp Pro
45 50 55 60
Ala Glu Arg Val Gly Cys Ala Gly Glu Gly Val Thr Pro Thr Glu Cys
65 70 75
Arg Glu Lys Gly Cys Cys Phe His Ala Leu Thr Gly His Val Trp Cys
80 85 90
Tyr Lys Leu Asn Glu Ser Glu Asp Ala Trp Lys Cys Ala Val Pro Ile
95 100 105
Lys Arg Arg Val Ala Cys Ala Gly Ser Gly Val Thr Ala Ala Glu Cys
110 115 120
Lys Ala Lys Gly Cys Cys Tyr Asn Ser Ser Thr Tyr Asn Thr Ile Trp
125 130 135 140
Cys Phe Arg Pro Gln Val
145
<210>3
<211>1251
<212>DNA
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>3
TTCACATTCT GAAGAGGTAA AATGAGTGAA AACAAAATTA TTTTATATGA TGAGCCCTCA 60
TTTGAAGGTC TGAGCTTAGA ACTCACCAGG TCTCAGACTA AATTGGCTCG TCAAAATTTT 120
TCAAAGGCTG CTTCCTCTCT GCGTGTGATT GGCCAGCCAT GGGTCGCTTA TACTCAAAAC 180
TTCTTTAAGG GTGAAGCACG TGTGTATGAG GAGGGCAGTT ACAGTAATAT TGATGTTGAC 240
AACAAAATCA TGTCTTTATA TCTCATCCTT GCAAATCTGG GGAACCCAGT TATCAAGCTC 300
TTTGAAGGCC AAAGCTTGTC TGGCAAATCC ACTGTGGTGA ACGAAGCAGC TATTCTGAAC 360
TTTGGAAAAC TAGAAAATGG AGCTTCTTCT TGGCAGGTGC TCAGTGGTGC CTGGAAAATA 420
TGCGATGAAG TGAAGGATAA CCCCAGATAC AAGGTATCAA ACGTTGCAGA TATGGTTTTT 480
CATTACTCTG AAACAGGCTT GAGTCACTCA GCGTTAAGTA TTTATCCTCT ATTGGCTGGG 540
AAGCCTAAAC TTACAACAAA TGTCCAGTGG GACAGAAAGA AGGAGCTCAG TAACCGTGTT 600
GGCCAACTAG ATGAGATCAT TGTTGTTAAT AAGTCTAAGC ATGAACAGGA TTTTAGCCAC 660
AGTTCAGGCC GGGACTATAC CTCCAGTCCT GAAGTTGAAA TGAAATTTAG CAATGAAACT 720
ACTATCGAGT TGGGAACAGG CTTTAAGGTT CCTCTGATTG GTGAACTGAG TACCACTTTG 780
ACCCAAACCA TATCCATAGA GAAAGGAAAA ACTGAGGGCA CGTCTACCAC TGTCACCAAC 840
AAAGTGACCA TTCCTGTGAC GGTTCCAGCA AATACTAAAG TCACCATCAA TGTCATGAGA 900
AGAGACATCA GCTACTCTGT CCCAGTAGAA ATAATTATAG AAAGAAACAA TGCGAGGAAG 960
ACAGAATATG CTGAGCTTAT ATGCAGAGAT GGTACAGACG TGCACATCTC CCGAAATGAT 1020
GAGGCTGTTT AATCCTAAAA CTCCAAAGCA ACAAGAGACA GAAGATAGTG GTCTGATCTT 1080
TATTACTGGC AATAGAAGAC ATGTCCACAT CAGATTGTGC TAACTCTTCA AGTTATAAAT 1140
AGCTGCCCCT ACAACACCTT AAGGCTTGTA TCAGTATATA CCATACTGGG GCTGAACTCA 1200
CTGAACCATC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1251
<210>4
<211>1830
<212>DNA
<213>大蹼鈴蟾(Bombina maxima)
<400>4
TGTCTATTTT GTTGCATTTT CATGGCAAGC AAGATGTTCT TCATAGTGAC AATAGCATTG 60
GCTATTGGCT GTGGCCATGG ATTTTCAGAC CTTCAGATAG GTAGTCTGAA GTGTGCAGTT 120
GCAGCATATG ACAGAATTGC ATGTCCTGGA AATACAAAAG AACAATGCAA TGCCAGGCGG 180
TGTTGTTATG ATAATAGGCA ATCTGGTGCA ATCTGGTGCT TTAGACAAAG AGATCTCAGA 240
CCTGGATGCT ATATTGACCC TGCAGAAAGA GTTGGATGTG CAGGCGAAGG AGTGACACCC 300
ACTGAATGCA GGGAGAAAGG CTGCTGTTTT CATGCATTAA CTGGTCATGT TTGGTGCTAT 360
AAACTTAACG AATCAGAGGA TGCCTGGAAA TGTGCTGTCC CTATCAAACG GAGAGTTGCA 420
TGCGCTGGCT CAGGCGTCAC AGCTGCTGAG TGCAAGGCAA AAGGTTGTTG TTACAATTCA 480
AGCACCTACA ATACCATATG GTGCTTTAGA CCTCAAGTAT AACTGATCTA TAAAATGGAA 540
TTGTTCAGGT GTTCAAGATG AGAACAAGGT TGAAGATTAG TGAAGAATTC CTCTTCAATC 600
TAGTGATTTC TTTTTTTTGT GCTAAACCTA ACAATGATTT AAATTATATT CTTTCTCAGA 660
TGTATGTTCC CTCTAAGGCA TAAGAATGTG CATGCTGTTA TTGAACGTTT AGGGCTATAT 720
TACAAGAGGC ACGCTATTGC TAACGCGGGT CACAATATCC AATATCGCAA CTGTGCTAAC 780
CTGTGCACAT ATTACAAGTT GAAAGGAAAC GGGTGAGCTT GTGCGTAAAT AAATTTGCGG 840
TTGTTGGGTT AGAGGTTACC GTAAAGAATA GAGTGCACCA AACACAACAT AAATACATTA 900
ATATCAAGTG TTACACTCAT ATATATACAC CATCTGATAA CAATTATTTA TATCAATATT 960
AAGAAAATAT TTTTAGAAGG GTTTAAAGGT ATATGGTAAT TATGTAGGGT GACCATGTTG 1020
CCGCTTTGGA AGGGGACACA TGTGTGTTTT TCATGTGTGT CCCTTTTTGA AGCGGCAGTG 1080
TGGTCAGCCT AGGTATATGT ATAAGTTTAA ATGTGTGTGT GTGAATATAT ATATATATAT 1140
ATATATATAT ATATATTAAC AATGTGGGGT CAAGCACTCA CGACACTGAT AATCCAATGC 1200
CCCAGGTGCA GTCCTGACAA TAGTATACAC AGTTTCGGGA GGGCAAGGAA GAGGTGCTCT 1260
CACGGGGTCT TTAGTGGATA TGGGAATGAA ACCCATGTTT GTTGAGGACC CCGTGGGTGT 1320
GCCTCTTTTT TGCCTTCTTG AAATTGTGTA TATATATATA TATATATATA TATATATATT 1380
GTATATACAT GTGTATTTAT GTATTTATAT ATGTATATGC ATACATATAT GTACACAAAT 1440
TAACACATAT GTATAGACAT ATACACACAC ACACACATAT ATACATATAT ATATATATAT 1500
GTATATATAT ATATACACAC ACGCTTTGGA GGCCTTTCCA CTCAAATACC TTAAAACATG 1560
TAAAATAATT TTTAAAAATG TTAATATTTT ATAATGGGCC AGATTACAAG TGGAGCACAA 1620
ATTAATGCTT CAGCTTGAGC ATTAATTGCT CTAGAAGTAA GCTTTATTGC GCTTGTTGGG 1680
TTGCACTCGT ATTACAAGTT AAAAAGTAAA CTCTATTGGC TCTTGCGCTA AACCGACACG 1740
CACAAAAGCC GAAGTTAGAA TATCACGTGC ACGTTCACGT ATTCCCCCAT AGAAGTCAAT 1800
GAAGAAAAAA AAGTTAAAAA AAAAAAAAAA 1830
權利要求
1.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物，其特征在于其分子量為72kDa，由兩種類型的α和β亞基，按αβ2的分子形式以非共價鍵連接而成，其α亞基由336個氨基酸殘堝組成，其氨基酸序列為SEQ ID NO1；其成熟β亞基由146個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為SEQ ID NO2。
2.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的基因，其特征在于編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的α亞基的基因由1251個核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為SEQ ID NO3，對應的編碼其成熟的α亞基蛋白為SEQ ID NO3中第22-1029位核苷酸，其編碼相對應的氨基酸序列為SEQ IDNO1；編碼大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的β亞基的基因由1830個核苷酸組成，其自5’端至3’端核苷酸序列為SEQ ID NO4，對應的編碼其成熟的β亞基蛋白為SEQ ID NO4中第82-519位核苷酸，其編碼相對應的氨基酸序列為SEQ ID NO2。
3.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物的制備方法，其特征在于從中國特產兩棲動物大蹼鈴蟾皮膚中分離純化得到。
4.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復合物為一類新的ATPase和GTPase，可用于生物醫學試劑制備和制藥。
5.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復合物在抗腫瘤制藥中的應用。
6.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復合物在創傷修復制藥中的應用。
7.大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物及基因的用途，其特征在于該蛋白復合物從細胞外經泛素化修飾，能夠直接轉運到細胞核中進行基因表達的調控，可用于生物醫學試劑制備和制藥。
全文摘要
本發明涉及一種大蹼鈴蟾非晶狀體βγ-晶狀體蛋白與三葉因子蛋白復合物和基因及制法及用途。其天然表觀分子量為72kDa，由α亞基和β亞基按αβ2的分子形式以非共價鍵連接而成，為一類新的ATPase和GTPase酶，具有多種細胞生物活性，在體外納摩爾水平能夠殺死多種腫瘤細胞、抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞脫落和凋亡。在皮摩爾水平具有促進創傷修復的活性。在細胞外經單泛素化修飾，能夠直接轉運到細胞核中進行基因表達的調控從而調節細胞狀態，包括細胞遷移、脫落、生長。本發明的蛋白復合物提供了非晶狀體βγ-晶狀體蛋白全新的細胞生物學功能及其能夠與三葉因子蛋白協同作用的機制，可應用于生物醫學試劑制備和抗腫瘤以及促進創傷修復制藥。
文檔編號A61K38/43GK101230339SQ200810058028
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月14日 優先權日2008年1月14日
發明者云 張, 劉樹柏, 何英英, 李文輝 申請人:中國科學院昆明動物研究所