專利名稱：豨薟二萜提取物、其制備方法及在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥提取物及其提取方法，更具體地說涉及一種豨薟二萜提取物及其制備方法，以及在預防和治療風濕性、類風濕性疾病中的應用。
背景技術：
豨薟為菊科(Compositae)豨薟屬(Siegesbeckia)一年生草本植物，廣布于熱帶和溫帶地區，全世界共有五種豨薟腺梗豨薟(Siegesbeckia ubescens)，豨薟(S.orientalis)，毛梗豨薟(Sglabrescens)，膠豨薟(S.gummifer)，角豨薟(S.joullensis)。我國有前三種，都供藥用。
中國藥典規定，中藥豨薟為前三種原植物的干燥地上部分。豨薟味苦性溫、寒，入肝、脾、腎三經；主要功效為(1)祛風濕、利筋骨，治風濕頑痹，腰膝酸楚，頭風劇痛；(2)消炎止痛，可治燒傷、燙傷、蟻蟲牲畜咬傷；(3)燥濕止泄，治婦女白帶，外感傷風熱泄。現代藥理實驗表明，豨薟的提取物具有舒張血管、降壓、抗癌、抗生育、鎮痛、抗菌消炎、抗瘧、抗氧化、抑制免疫功能等活性，尤其對于風濕類風濕性疾病有很好的治療作用。其主要有效成分為海松烯型和貝殼杉烷型二萜化合物。
目前，對于中藥豨薟的利用，只是用水或有機溶劑提取得到的提取物直接入藥，如豨薟丸，由于沒有經過精制工序，提取物中二萜有效成分的含量較低，約15％左右，因而在臨床上服用劑量較高，豨薟丸的服用劑量為9g/天，相當于豨薟提取物3g/天，給患者的服用帶來不便。此外對于有效成分二萜沒有進行質量控制，因而對于其治療作用沒有好的保障。
風濕類風濕性關節炎是一種不明原因的慢性全身性免疫反應性炎癥性疾病，免疫反應多發生于關節滑膜，為最常見的結締組織疾病。目前該類疾病的治療藥物有乙酰水楊酸、消炎痛、保泰松、氯滅酸、糖皮質激素、金制劑、免疫抑制劑等，這些藥物雖然有一定的治療效果，但不良反應較大。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的二萜含量低從而帶來的藥理作用弱，服用劑量大，以及對于有效成分二萜沒有明確的控制標準等技術缺陷，提供一種高含量的且有明確控制標準的豨薟二萜部位提取物。
本發明提供了一種豨薟二萜部位提取物，其中含有二萜類化合物不少于40％，同時奇任醇含量不少于7％；優選總二萜類化合物含量為40-90％，奇任醇的含量為7-30％；最優選二萜類化合物50-70％，奇任醇的的含量為12-20％。
本發明的豨薟二萜部位提取物可以通過萃取、柱層析等易于工業化生產的技術而得，該提取物提高了現有記載的豨薟提取物總二萜類化合物的含量，現有以豨薟提取物為原料的藥物豨薟丸中的二萜含量為15％左右。
本發明還提供了一種含量較高二萜類化合物的豨薟二萜部位提取物的制備方法，包括以下步驟
1)提取用低級醇或丙酮或兩者的混合溶液或含水的上述有機溶劑提取，并加熱回流；2)濃縮或干燥減壓回收提取液，冷卻，過濾或離心得上清液，濃縮或干燥，得提取物；3)精制將提取物溶于含甲醇的水中，用低級烷烴、苯或甲苯中的任一種萃取，水層用乙酸乙酯、氯仿、乙醚中的任一種萃取，濃縮或干燥萃取液，得豨薟二萜部位提取物。
其中所述的步驟1)中低級醇為甲醇、乙醇、丙醇，加熱回流的溫度為70-100℃，水的含量為10％-25％；步驟2)中減壓回收至原來的1/4體積，冷卻溫度為0-4℃；步驟3)中所述的甲醇的含量為10-25％，低級烷烴為碳原子數為1至6的烷烴，優選石油醚，水層萃取溶劑優選乙酸乙酯。
本發明還提供了另一種制備方法，包括以下步驟1)提取用低級醇或丙酮或兩者的混合溶液或含水的上述有機溶劑提取，并加熱回流；2)縮或干燥減壓回收提取液，冷卻，過濾或離心得上清液，濃縮或干燥，得提取物；3)精制濃縮物加入大孔吸附樹脂后，先用低濃度的醇溶液洗脫除雜質，再用高濃度的醇溶液洗脫，收集洗脫收集洗脫液，濃縮或干燥，得豨薟二萜部位提取物。
其中所述的步驟1)中低級醇為甲醇、乙醇、丙醇，加熱回流的溫度為70-100℃，水的含量為10％-25％；步驟2)中減壓回收至原來的1/4體積，冷卻溫度為0-4℃；步驟3)中所述其特征是所述的低濃度為10-20％，高濃度為50-70％。
在本發明中的低溫冷卻過程是很重要的，它可以除去提取液中的大量葉綠素以及低級性雜質，不僅可以提高豨薟提取物中二萜的含量，此外還可以使后面的純化操作更方便。其冷卻溫度的選擇也很有講究，太高會使葉綠素以及低急性雜質沒有充分沉降，影響二萜的含量；太低會使有效成分二萜也沉降出，損失有效成分。本發明在提煉步驟中以含醇的水和烷烴為兩相的萃取技術，可以起到脫色除雜的目的，而且避免了二萜在萃取過程中的損失。使用大孔樹脂吸附層析純化技術可以使豨薟二萜部位提取物得到進一步的純化。
本發明豨薟總二萜類化合物的具體提取方法為(1)將豨薟藥材粉碎(約20目)，用低級醇、丙酮或含水的低級醇、丙酮回流提取，其中優選70-95％的乙醇水溶液，最優選75％的乙醇水溶液，容積加入量為藥材的8-10倍量，其中優選8倍量，回流提取1-4小時，其中優選2小時，過濾，藥渣按上述條件重復提取兩次，合并提取液，回收至1/4體積，低溫放置12小時，過濾(或離心)，上清液回收減壓濃縮或噴霧干燥。將干燥所得的提取物溶于10％的甲醇溶液，所用溶液的體積為提取物的2-5倍，其中優選3倍，用石油醚(或環己烷、正己烷，其中優選石油醚)萃取脫色除雜，其中萃取溶劑的體積為甲醇水溶液的0.2-1倍量，其中優選0.3倍，萃取5-6次，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的體積為甲醇水溶液的0.2-1倍量，其中優選0.3倍，萃取5-6次，得到的萃取液即為本發明的豨薟二萜部位提取物，干燥后得到本發明的固體提取物。不同批次的產品以奇任醇為標準品用分光光度法測定，含量為43-55％。在萃取過程中，如果采用非甲醇的醇類進行精制(如乙醇、丙酮等)，在用石油醚(或環己烷、正己烷，其中優選石油醚)進行萃取時，石油醚和含醇的水溶液有部分互溶，影響萃取的效果，從而最終提取物的含量，而很難達到本發明說所的二萜不少40％同時奇工任醇不少7％的含量。同理，選用乙酸乙酯也是為了保證提取物的含量而挑選的最佳的一個溶劑，雖然有些溶劑如氯仿、乙醚也有使精制的效果，但均會使二萜萃取不充分，降低二萜的含量以及得率，同時提取物是作為藥品使用的，所以這些有機溶劑不適宜于采用。
(2)將豨薟藥材粉碎(約20目)，用低級醇、丙酮或含水的低級醇、丙酮回流提取，其中優選70-95％的乙醇水溶液，最優選75％的乙醇水溶液，容積加入量為藥材的8-10倍量，其中優選8倍量，回流提取1-4小時，其中優選2小時，過濾，藥渣按上述條件重復提取兩次，合并提取液，回收至1/4體積，低溫放置12小時，過濾(或離心)，上青液回收減壓原體積的1/3。上述提取液可以直接用于大孔樹脂柱層析，層析填料可以選用大孔吸附樹脂如D001或D101樹脂，其中優選D101大孔吸附樹脂，將提取液加入樹脂柱后，先用10％低級醇或丙酮水溶液洗脫除去雜質，其中優選10％的乙醇水溶液洗脫，洗脫溶液量為保留體積的3倍左右，該洗脫部分棄去不要，再用70％低級醇或丙酮水溶液洗脫，其中優選70％乙醇水溶液收集洗脫液，洗脫溶液量為保留體積的3-5倍，合并洗脫液減壓濃縮或噴霧干燥既得豨薟二萜部位提取物。不同批次的產品以奇壬醇為標準品用分光光度法測定，含量為55-73％。
本發明提供的制備方法得到的豨薟二萜部位提取物中有效成分含量高，精制純化后的提取物更有利于提供其在制劑上的應用。
本發明還提供了一種含有豨薟二萜部位提取物的藥物組合物。
根據化學成分的特點，本發明藥物組合物的優選劑型為片劑、膠囊劑、滴丸劑或顆粒劑等口服劑型。這些制劑可通過常規制藥方法制備。
本發明的輔料為藥劑學常規輔料，可用的添加劑包括賦形劑(可以是糖類衍生物如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和山梨糖醇；淀粉衍生物如玉米淀粉、土豆淀粉、糊精和羧甲基淀粉；纖維素衍生物如結晶纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉；阿拉伯膠；右旋糖酐；硅酸鹽衍生物如偏硅酸鎂鋁；磷酸鹽衍生物如磷酸鈣；碳酸鹽衍生物如碳酸鈣；硫酸鹽衍生物如硫酸鈣等)、粘合劑(例如明膠、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇)、崩解劑(例如纖維素衍生物如羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮)、潤滑劑(例如滑石粉、硬脂酸鎂、鯨蠟或硼酸等)、穩定劑(如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等)、矯味劑(例如常用的矯味劑和香料等)、助流劑(微粉硅膠)、豨釋劑和其他輔用溶劑(例如水、乙醇和甘油等)。
本發明還提供了上述含有二萜類化合物的豨薟二萜部位提取物和含有該豨薟二萜部位提取物的藥物組合物在制備治療風濕類風濕疾病的藥物中的應用。經體外試驗證明，豨薟二萜部位提取物對風濕性、類風濕性疾病具有良好的治療，并經毒理實驗評價，該豨薟二萜部位提取物具有良好的安全性。
本發明的含有二萜類化合物的豨薟二萜部位提取物成分明確，經現代科學方法加以提取、濃縮、精制，制備方法簡單，提取物有效成分含量高，經過毒理和藥理試驗表明含有該提取物的藥物制劑安全范圍大，毒副作用小，具有抗風濕類風濕性疾病、鎮痛、抑制免疫功能等作用。根據二萜含量的不同，本品推薦口服劑量為0.5g-1.0g/天，而傳統的藥物的劑量遠遠大過于此，如豨薟丸9g/天，相當于豨薟提取物3g/天。其與傳統用藥相比，給藥劑量更小，用藥順應性更佳。同時采用了質量控制標準，使臨床用藥的藥效更有保障。
本發明所提供的豨薟二萜部位提取物有效成分含量高，該提取物安全范圍大，毒副作用小，具有明顯的抗風濕類風濕性疾病，抑制免疫功能的作用，且其服用劑量相對傳統用藥劑量小，用藥順應性佳。
具體實施例方式
下列實施例是為了進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。
實施例1豨薟二萜部位提取物的制備方法I豨薟藥材3000g，粉碎為20目，加入8倍量的80％乙醇回流提取2小時，過濾，藥渣再按上述條件重復提取2次，棄去藥渣，合并提取液，減壓回收至原來的1/4體積，低溫(冰箱冷藏，約0-4℃)放置12小時，過濾(或離心)上清液減壓濃縮至干，加入2000ml10％的甲醇水溶液，先用石油醚萃取，每次600ml共5次，回收石油醚，棄去石油醚萃取物，然后用的乙酸乙酯萃取，每次600ml，共5次，噴霧干燥，即可得到本發明的豨薟二萜部位提取物。經分光光度法測定，含量為47％。
實施例2豨薟二萜部位提取物的制備方法II豨薟藥材3000g，粉碎為20目，加入8倍量的80％乙醇回流提取2小時，過濾，藥渣再按上述條件重復提取2次，棄去藥渣，合并提取液，減壓回收至原來的1/4體積，低溫(冰箱冷藏，約0-4℃)放置12小時，過濾(或離心)上清液減壓回收至原來的1/3體積，得到藥材等重量體積的濃縮液(3000ml)，用D101樹脂進行純化，提取液加入樹脂后，先用3個柱體積10％乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用5個柱體積70％乙醇洗脫，收集洗脫液后減壓回收，真空或噴霧干燥，即可得到本發明的豨薟二萜部位提取物。經分光光度法測定，含量為63％。
實施例3膠囊劑處方a
豨薟二萜部位提取物200g預膠化淀粉80g65％乙醇 14ml交聯CMC-Na12g硬脂酸鎂 3g制成1000粒處方b豨薟二萜部位提取物300g微晶纖維素120g60％乙醇 18ml交聯CMC-Na18g微粉硅膠 4g制成1000粒制備方法(1)豨薟二萜部位提取物、微晶纖維素分別過80目篩混勻；(2)配制60％乙醇溶液，作為黏合劑；(3)加入60％乙醇，過20目篩制粒，60℃干燥，20目整粒，得干顆粒；(4)干顆粒加入過100目篩的交聯CMC-Na和硬脂酸鎂或微粉硅膠混勻；(5)測定顆粒中指標成分的含量；(6)裝膠囊，每粒含量為200mg或300mg。
實施例4片劑處方a豨薟二萜部位提取物200g微晶纖維素75gL-HPC 12g粘合劑(65％乙醇) 12ml交聯CMC-Na12g硬脂酸鎂 4g制得1000片處方b豨薟二萜部位提取物300g預膠化淀粉120gL-HPC 18g粘合劑(65％乙醇) 20ml
交聯CMC-Na 18g微粉硅膠 4g制得1000片制備方法(1)豨薟二萜部位提取物、預膠化淀粉分別過80目篩混勻；(2)配制65％乙醇溶液，作為粘合劑；(3)加入65％乙醇，過20目篩制粒，60℃干燥，20目整粒，得于顆粒；(4)干顆粒加入過100目的交聯CMC-Na和硬脂酸鎂或微粉硅膠混勻；(5)測定顆粒中指標成分的含量；(6)壓片，每片含量為200mg或300mg；(1)包衣包7％的LE(天津LE公司商品名稱)簿膜包衣劑，包衣增重約3％。
實施例5滴丸劑取豨薟二萜部位提取物100g，加入聚乙二醇-6000(PEG-6000)200g，加熱溶解，使藥物與基質混合均勻，藥液溫度保持為80℃，用適宜滴丸機滴制。冷卻劑采用液體石蠟，冷卻溫度為14-16℃，滴速為每分鐘60滴，取出滴丸在適宜條件下干燥，即可獲得表面光滑致密，圓整的滴丸。
實施例6顆粒劑取豨薟二萜部位提取物100g，按主藥與輔料1∶1的比例加入糊精，另加入15g甜蜜素作矯味劑，以65％乙醇為潤濕劑制粒，50℃干燥，整粒，可得到滿意顆粒。
以下通過藥效學實驗說明本發明的豨薟二萜部位提取物的藥效藥學實驗1豨薟二萜部位提取物對大鼠蛋清性足腫脹的影響SD大鼠，雄性，體重160-180g隨機分為3組(1)對照組(蒸餾水)，(2)-(3)豨薟二萜部位提取物低、高劑量組(0.15，0.30g/kg)，(4)豨薟乙醇提取物1.00g/kg(未經過精制)，灌胃給藥，每天一次，連續3天，第3天給藥后用毛細管放大法測量每只大鼠右后足跖正常體積。同時右后足跖皮下注射10％新鮮蛋清0.05ml，于不同時間用毛細管放大法測定右后足跖容積，比較藥物組與對照組的腫脹百分率(以致炎后與致炎前足跖體積之差除以致炎前足跖體積作為腫脹百分率)，用t檢驗進行統計學處理。結果顯示，豨薟二萜部位提取物(0.15，0.30g/kg)可明顯抑制大鼠蛋清性足跖腫脹百分率，具有抗炎的作用。從表中的數據可知豨薟二萜提取物劑量0.15g/kg對大鼠蛋清性足跖腫脹的抑制作用同沒有精制過的豨薟提取物劑量為1.00g/kg基本等同，豨薟二萜部位提取物劑量0.30g/kg對大鼠蛋清性足跖腫脹的抑制作用明顯優于沒有精制過的豨薟提取物劑量為1.00g/kg。所以豨薟提取物經過精制后，可以提高療效，降低藥物使用劑量。試驗結果見表1
表1對大鼠蛋清性足跖腫脹的影響(n＝10，

)

注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
藥學實驗2豨薟二萜部位提取物對大鼠福氏完全佐劑關節炎的影響SD大鼠雌雄各半，2-3月齡，體重(250±30)克。將大鼠隨機分為3組，每組10只，正常組每日每只灌服4ml水，于給水第1日給大鼠左后足趾皮內注射0.1ml生理鹽水，模型組與給藥組于給水，給藥第1日分別在左后足趾皮內注射0.1ml福氏完全佐劑，給藥組1和2每日每支分別灌服1.5ml(40mg/ml)豨薟二萜部位提取物、豨薟提取物1.5ml(100mg/ml)，第18日將動物全部處死，取脾和腹腔巨噬細胞備用。大鼠佐劑性關節炎大鼠淋巴細胞增殖功能低下，與正常組比較下降28％，試驗結果顯示豨薟二萜部位提取物對SD大鼠模型淋巴細胞增殖有促進作用，說明豨薟二萜部位提取物可以用于風濕性、類風濕疾病方面的治療，且豨薟二萜部位提取物效果要優于未經精制的豨薟提取物。具體數據如表2所示。
表2豨薟二萜部位提取物對佐劑性關節炎大鼠淋巴細胞增殖的影響(X±S)

##與正常組比較；**與模型組比較。
小鼠毒性試驗按常規方法，將小鼠隨機分組，各組分別灌服5000mg/kg的本發明的豨薟總二萜提取物，觀察7天，未見老鼠死亡，也未見不良反應，可見該類化合物安全有效特點。
權利要求
1.一種豨薟二萜部位提取物，其特征在于該提取物中二萜類化合物含量至少為40％，其中奇任醇的含量至少為7％。
2.如權利要求1所述的豨薟二萜部位提取物，所述的總二萜類化合物含量為40-90％，奇任醇的含量為7-30％；
3.一種制備如權利要求1所述的豨薟二萜部位提取物的方法，包括以下步驟1)提取用低級醇或丙酮或兩者的混合溶液或含水的上述有機溶劑提取，并加熱回流；2)濃縮或干燥減壓回收提取液，冷卻，過濾或離心得上清液，濃縮或干燥，得粗提物；3)精制將提取物溶于含甲醇的水中，用低級烷烴、苯或甲苯中的任一種萃取，水層用乙酸乙酯、氯仿、乙醚中的任一種萃取，濃縮或干燥萃取液，得提取物。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征是所述步驟2)中減壓回收至原來的1/4體積，冷卻溫度為0-4℃；步驟3)中所述的甲醇的含量為10-25％，低級烷烴為碳原子數為1至6的烷烴，水層優選用乙酸乙酯萃取。
5.如權利要求4所述的制備方法，其特征是所述的低級烷烴為石油醚。
6.一種制備如權利要求1所述的豨薟二萜部位提取物的方法，包括以下步驟1)提取用低級醇或丙酮或兩者的混合溶液或含水的上述有機溶劑提取，并加熱回流；2)濃縮或干燥減壓回收提取液，冷卻，過濾或離心得上清液，濃縮或干燥，得提取物；3)精制濃縮物加入大孔吸附樹脂后，先用低濃度的醇溶液洗脫除雜質，再用高濃度的醇溶液洗脫，收集洗脫收集洗脫液，濃縮或干燥，得提取物。
7.如權利要求6所述的制備方法，其特征是所述的步驟2)中減壓回收至原來的1/4體積，冷卻溫度為0-4℃；步驟3)中所述其特征是所述的低濃度為10-20％，高濃度為50-70％。
8.一種藥物組合物，含有權利要求1所述的豨薟二萜部位提取物和藥學可接受的輔料。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特征是述的藥物組合物為口服劑型。
10.權利要求1所述的豨薟二萜部位提取物在制備風濕、類風濕性疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種豨薟二萜部位提取物，其特征在于該提取物中二萜類化合物含量至少為40％，其中奇任醇的含量至少為7％，并提供了該提取物的制備方法及其在制備治療風濕、類風濕性疾病的藥物中的應用。本發明的提取物具有含量高，藥效好，劑量小的優點。
文檔編號A61P37/00GK1961906SQ200610154798
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月27日 優先權日2006年11月27日
發明者金耀, 章小永 申請人:杭州耀恒醫藥科技有限公司