專利名稱：療效高副作用少的糖皮質激素與丹參組成的外用藥劑的制作方法
技術領域：
糖皮質激素類外用藥劑是臨床治療皮膚病的常用藥物，但這些外用藥均有較大的副作用。本發明涉及一組療效高副作用少的含糖皮質激素與丹參組成的外用藥劑。
背景技術：
糖皮質激素外用制劑應用于臨床已有四十余年，是醫學界解決皮膚頑癥痼疾的重要藥物。但它的副作用較大，不少病人甚至迫于它的副作用而停藥。糖皮質激素可引起類腎上腺皮質機能亢進癥、誘發及加重感染、潰瘍、骨質疏松并發骨折、神經精神系統并發癥、肌病等。糖皮質激素外用于皮膚所引起的不良反應主要表現為，痤瘡、色素沉著、多毛癥、紫癜、皮膚萎縮、萎縮紋、毛細血管擴張、毛周角化癥、結節性脂膜炎、速發型過敏反應(如蕁麻疹)等。在臨床上，一些患者如銀屑病人，局部皮膚長期使用糖皮質激素外用制劑后，可出現皮膚萎縮、毛細血管擴張、萎縮紋。此類不良反應的發生，一方面與藥物的藥理活性有關，另一方面與臨床上的不適當使用及濫用有關。如何提高糖皮質激素外用制劑的治療效果，防治其不良反應的發生是近十多年來世界各國科學工作者研究的重點領域之一。國外學者早在二十世紀七十年代末期就開始了如何防治糖皮質激素外用于皮膚所產生的不良反應的研究。他們所使用的動物模型有無毛小鼠，墨西哥無毛狗。學者們研究的最多的藥物是維甲酸類藥物，他們發現維甲酸類藥物不但能夠抑制糖皮質激素引起的皮膚萎縮，而且并沒有減弱其抗炎效應。關于維甲酸類藥物的作用機理，有關研究發現，局部外用維甲酸類藥物能夠減少皮膚中膠原蛋白的丟失，并且能夠促進新的膠原蛋白的合成。另有研究發現，糖皮質激素外用制劑與5-環氧和酶抑制劑類藥物局部外用于皮膚，既有協同抗炎效應，又不會導致皮膚萎縮。近年米，國外學者發現甲狀腺激素類藥物能夠刺激皮膚中膠原蛋白的合成，可用來防治糖皮質激素所導致的皮膚萎縮。國內學者也進行著一系列的對糖皮質激素外用制劑的毒性的研究。本課題組曾報道，復方丹參制劑對大鼠糖皮質激素性骨質疏松癥具有防治作用。本課題組還發現，丹參酮可有效拮抗D-半乳糖所致的皮膚細胞衰老，不但可以保護細胞免受自由基損傷，而且還可使成纖維細胞活性增強，膠原蛋白合成增加，使皮膚趨于年輕化。本課題組還發現蛇床子總香豆素可有效防治潑尼松所誘致的大鼠骨質疏松。為了尋找能增加糖皮質激素的療效，減少其不良反應的藥物組合物，我們做了大量的探討與研究，發現中藥丹參或丹參的有效成分丹參酮與糖皮質激素組成外用制劑局部外用于皮膚，既有協同抗炎效應，又不會導致皮膚萎縮，為我們開發糖皮質激素組成外用制劑提供了很好的選擇。

發明內容
糖皮質激素外用制劑是臨床上治療皮膚病的重要藥物，已知可用于防治皮膚疾病的糖皮質激素類藥物有醋酸潑尼松，醋酸潑尼松龍，醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安西龍，地塞米松，倍他米松，氟氫可的松，氯潑尼醇，地夫可特，氟米龍，曲安奈德，布丁奈德，莫米松，氯倍他索，氟氫松，丁氯倍他松，倍氯米松，氯氟輕松，阿氯米松，鹵米松，甲羥松，去羥米松，氟氫縮松，二氟可龍；這些藥物不少也已經配成外用的藥膏如軟膏劑、乳膏劑；霜劑；膜劑，凝膠劑。但糖皮質激素外用制劑長期大劑量使用可造成一系列嚴重的不良反應，這是公知的技術。本發明發現在糖皮質激素外用制劑加入中藥丹參或丹參提取物丹參酮，與糖皮質激素組成復方后能增強糖皮質激素的抗炎作用，減輕其不良反應，可用于防治各種糖皮質激素外用制劑適應癥。
具體實施例方式本發明方案是設計了下述研究處方進行實驗一、復方曲安縮松涂劑1.曲安縮松丹參酮涂劑取70ml無水乙醇先把實驗用量的曲安縮松溶解，充分溶解后，加入丹參酮，充分溶解后，再加入30ml蒸餾水，即可。實驗用量的曲安縮松是指每100毫升的溶液中含曲安縮松0.05～0.5克，丹參酮用量為，每100毫升的溶液中含0.1～0.5克。
2.復方曲安縮松丹參涂劑取70ml無水乙醇先把實驗用量的曲安縮松溶解，充分溶解，另取丹參生藥材粗粉碎后，用100ml 60％乙醇滲泡48小時，過濾，濾液濃縮至30ml，再與上述曲安縮松溶液混合，即可。實驗用量的曲安縮松是指每100毫升的溶液中含曲安縮松0.05～0.5克，丹參用量為每100毫升的溶液中含5～25克。
二復方地塞米松乳劑1.復方地塞米松丹參酮乳劑取醋酸地塞米松0.25克，丹參酮2克，乳膏基質(硬脂酸100克，液狀石臘160克，白凡士林50克，單硬脂酸甘油酯50克，三乙醇胺2克，十二烷基硫酸鈉2克，甘油125克，10％羥苯乙酯溶液10毫升)蒸餾水470毫升，按乳膏的生產工藝制備成1000克乳劑，供研究及臨床應用。本復方醋酸地塞米松可在0.1～0.25克，丹參酮0.5～5克之間調整。
2.復方地塞米松丹參乳劑取醋酸地塞米松0.25克，乳膏基質(硬脂酸100克，液狀石臘160克，白凡士林50克，單硬脂酸甘油酯50克，三乙醇胺2克，十二烷基硫酸鈉2克，甘油125克，10％羥苯乙酯溶液10毫升)，另取丹參生藥材粗粉碎后，用100ml 60％乙醇滲泡48小時，過濾，濾液濃縮至30ml，加蒸餾水至470毫升，按乳膏的生產工藝制備成1000克乳劑，供研究及臨床應用。本復方醋酸地塞米松可在0.1～0.25克，丹參藥材50～250克之間調整。
根據研究或臨床應用需要，上述涂劑中的地塞米松，可采用醋酸氫化可的松，醋酸可的松，甲潑尼松，曲安縮松，氟氫可的松，莫米松，氯倍他索，氟氫松，倍氯米松，氯氟輕松米替代。
實施例一為了觀察外用曲安縮松誘發皮膚萎縮的小鼠皮膚組織病理學特征、皮膚相關的生化指標以及免疫器官的變化；同時，觀察曲安縮松丹參酮涂劑和復方曲安縮松丹參涂劑對對糖皮質激素皮膚不良反應的防治作用，我們開展了下述實驗
1.實驗方法1.1材料1.1.1實驗動物及飼養條件初始體重20±2g的三月齡清潔級昆明種小鼠30只，雌雄各半(廣東醫學院實驗動物中心提供)。飼養條件飼養室內溫度保持24℃～28℃，濕度在50％～60％。分籠普通喂養。每籠10只，自由攝食攝水，專室飼養，專人負責，實驗前及每周稱體重一次。動物飼養3周。
1.1.2主要儀器SHH.W21.600三用電熱恒溫水浴箱 大津市華北實驗儀器有限公司華凌電冰箱 BCD-205WE廣東752型紫外分光光度計上海第三分析儀器廠內切式組織勻漿機 浙西機械廠55p-72超速離心機 日本HITACHTAE-240型電子分析天平 Mettle-Toledo儀器(上海)有限公司半自動圖像數字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡 Nikon日本計算機Macintosh II Ci， 美國蘋果公司產品數字化板報SummaSketch II plusKSS Image Analysis(version2.0)KSS Scientific consultants，UT USAKSS Stereologe(version2.0)KSS Scientific consultants，UT USALEICA MPS30熒光-光學顯微鏡及顯微照相機德國LEICA公司1.1.3主要試劑考馬司亮蘭G250南京建成生物科技公司羥脯氨酸試劑盒南京建成生物科技公司SOD試劑盒 南京建成生物科技公司MDA試劑盒 南京建成生物科技公司1.1.4研究藥物及配制方法(1)各組所涂用的藥物1組空白對照組，取70ml無水乙醇，加蒸餾水至100ml即可；2組曲安縮松模型組，用70ml無水乙醇把0.2g曲安縮松溶解，加入30ml蒸餾水，配制濃度為0.2g/100ml溶液；3組復方曲安縮松丹參涂劑。
(3)脫毛劑硫化鈉購自廣州化學試劑廠。配制方法稱取硫化鈉25g，加水50ml，加溫溶解，然后加入聚乙烯10m，充分混合即可。
(4)三氯化鐵廣東省臺山市化工廠。配制方法三氯化鐵29g，蒸餾水加至100ml。
(5)堿性品紅上海化學試劑公司。
(6)間苯二酚上海山浦化工有限公司。
(7)Weigert溶液配制方法堿性品紅2g，間苯二酚4g，三氯化鐵25ml，濃鹽酸4ml，蒸餾水200ml。
(8)蘇木素上海化學試劑公司。
(9)Weigert鐵蘇木素液配制方法A液蘇木素1g；無水酒精100ml。
B液30％三氯化鐵4ml，蒸餾水100ml，純鹽酸1ml。
A、B兩液需分瓶盛放，臨用前A液B液等量混合。
(10)Van Gieson染液配制方法A液1％酸性品紅水溶液。
B液苦味酸飽和水溶液(約1.22％)。
A、B兩液需分瓶盛放，臨用前取A液1份B液9份混合后使用。
(11)1％鹽酸酒精液配制方法70％酒精99ml，純鹽酸1ml，充分混合即可。
2.2方法2.2.1實驗設計分組根據實驗所需，分為空白對照組、曲安縮松模型組、復方曲安縮松丹參涂劑。每組10只小鼠。
2.2.2動物背部脫毛及涂藥實驗前，用脫毛劑在背部尾上1cm處始，向頭頸方向沿背部正中線兩側對稱脫毛面積約4cm2，成一矩形，并用清水沖洗小鼠背部，避免脫毛劑的殘留。各組以對應的藥物外涂于背部，每次涂0.01ml/cm2，每大兩次，共三周，實驗前及實驗開始后每周稱重一次。
2.2.3取材所有小鼠用藥三周后，眼球取血處死。取背部正中皮膚，取一1cm×1cm大小皮膚迅速放入10％中性甲醛液中固定，擬作組織切片進行組織病理形態學觀察及定量分析；另取余背部皮膚迅速冰凍保存，擬作皮膚組織勻漿測皮膚羥脯氨酸、SOD及MDA含量。取小鼠胸腺、脾，稱濕重，觀察其變化。
2.2.4皮膚生化指標的檢測(1)10％皮膚組織勻漿的制備
①取脫毛后的皮膚組織塊0.5g左右，經冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其它結締組織，濾紙拭干，稱重，放入10ml的小燒杯中。
②用量筒取該組織塊重量9倍的預冷的生理鹽水，取2/3倒入裝有組織塊的燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，然后倒入勻漿管中將剩余的1/3生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的組織塊，一起倒入勻漿管，用內切式組織勻漿機攪拌制成10％組織勻漿(勻漿時間10次/秒，間歇3秒，連續7～10次，在冰水中進行)。
③取少量組織勻漿直接涂片，在顯微鏡下觀察細胞的破碎情況，若破碎不全，則反復凍溶三次，使其完全破碎，使胞內容物完全游離在液相中。
(2)皮膚組織羥脯氨酸、SOD及MDA含量測定參照南京建成生物工程公司試劑盒說明方法測定。羥脯氨酸，以微克/毫克蛋白(μg/mgprot)為單位；SOD，每毫克組織蛋白在1ml反應液中SOD抑制率達50％時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)，以活力單位/毫克蛋白(U/mgprot)表示；MDA，以納摩爾/毫克蛋白(nmol/mgprot)為單位。皮膚組織蛋白含量的測定，按照考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒說明書進行。
2.2.5組織切片染色及鏡下觀測內容(1)彈力纖維染色采用Weigert間苯二酚-堿性品紅染色法操作方法①石蠟切片，脫蠟至水，蒸餾水洗。
②0.25％高錳酸鉀氧化10分鐘。
③0.5％草酸漂白為止。
④蒸餾水洗后95％酒精洗一次。
⑤直接浸入Weigert溶液20～60分鐘。
⑥0.5％鹽酸酒精分化，觀察背景無色彈力纖維清楚為好。
⑦水洗，快洗后進二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果彈力纖維呈黑藍色。)(2)膠原纖維染色采用Van Gieson染色法操作方法①組織固定10％福爾馬林液，常規脫水包埋。
②切片脫蠟至蒸餾水。
③用Weigert鐵蘇木素液染10～20分鐘。
④流水稍沖洗。
⑤1％鹽酸酒精迅速分化。
⑥流水沖洗后蒸餾水沖洗。
⑦用Van Gieson液染3～5分鐘。
⑧傾去染液，直接用95％酒精分化和脫水。
⑨無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。
(結果膠原纖維呈紅色，肌纖維、胞質及紅細胞呈黃色，細胞核呈監褐色。)(3)表皮細胞染色采用HE染色法染色。操作方法略。
(4)鏡下觀察皮膚表皮，真皮膠原纖維、彈力纖維變化情況主要觀察皮膚表皮厚度，細胞層數，基底層細胞排列分布及形態；觀察真皮層膠原纖維、彈力纖維的形態及數量。
(5)表皮厚度，彈力纖維面積的測量采用LEICA MPS30熒光-光學顯微鏡下攝影，應用相應計算機以KSS Image Analysis圖像分析軟件，在每組隨機選擇4-6個高倍鏡視野，測量皮膚表皮厚度及真皮彈力纖維面積平均值。
2.3統計學分析運用SAS軟件進行單因素分析，先采用SAS中的UNIVARIATE過程檢驗方差齊性，若方差相等采用方差分析，組間比較再采用SNK-q檢驗；若方差不齊則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，再用Nemenyi檢驗比較兩組間差別。
3.實驗結果(1)各組表皮形態學觀察及計算機圖像定量分析實驗結果可見曲安縮松模型組小鼠表皮厚度明顯變薄，細胞層數減少，基底細胞排列散亂，細胞大小不一。正常對照組小鼠表皮厚度較厚，由3～5層細胞組成，可見明顯的角質層，棘細胞散在分布，基底細胞呈立方形，排列整齊。與曲安縮松模型組相比，復方曲安縮松丹參涂劑組小鼠表皮厚度及細胞層數均增加，細胞大小一致，基底細胞呈立方形，排列緊湊，可見角質層。
各用藥組小鼠表皮厚度計算機圖像定量分析見表3.1表3.1小鼠表皮厚度計算機圖像分析系統定量分析結果

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.1可見，曲安縮松模型組小鼠表皮厚度較正常對照組減少了39.5％，差異有統計學意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組表皮厚度比曲安縮松模型組增加了47.1％差異有統計學意義(P＜0.05)。
(2)曲安縮松模型組真皮彈力纖維形態學觀察及計算機圖像定量分析實驗結果可見曲安縮松模型組小鼠彈力纖維變短、減少，散在性分布。正常對照組小鼠彈力纖維細長，有輕微彎曲度，分布廣泛，排列相對有序。與曲安縮松模型組相比，復方曲安縮松丹參涂劑組小鼠彈力纖維增多，部分彈力纖維細長，部分彈力纖維斷裂，呈散在性分布。各用藥組小鼠真皮彈力纖維面積計算機圖像定量分析見表3.2表3.2小鼠皮膚彈力纖維面積計算機圖像分析系統定量分析結果

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.2可見，曲安縮松模型組小鼠彈力纖維面積較正常對照組減少了26.8％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組彈力纖維面積比曲安縮松模型組增加了24.0％差異有統計學意義(P＜0.05)。
(3)各組真皮膠原纖維形態學觀察實驗結果可見曲安縮松模型組真皮膠原層厚度變薄，膠原束斷裂甚至破碎，排列疏松且紊。正常對照組膠原纖維豐富，排列緊密，呈束狀排列，走向與皮面平行，呈波紋狀。與曲安縮松模型組相比，復方曲安縮松丹參涂劑組小鼠膠原纖維明顯增多，排列致密、規則，呈波浪狀，與皮面平行。
(4)各用藥組皮膚生化指標的檢測①各用藥組小鼠羥脯氨酸含量的檢測見表3.3表3.3大鼠皮膚組織羥脯氨酸含量檢測結果

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.3可見，曲安縮松模型組羥脯氨酸含量較正常對照組降低了31.1％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組羥脯氨酸含量比曲安縮松模型組增加了23.1％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
②各用藥組小鼠SOD活力的檢測見表3.4表3.4小鼠皮膚組織中SOD活力

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.4可見，曲安縮松模型組SOD活力較正常對照組降低了30.3％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組SOD活力比曲安縮松模型組增加了50.4％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
③曲安縮松模型組小鼠MDA含量的檢測見表3.5表3.5小鼠皮膚組織中MDA含量

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
由表3.5可見，曲安縮松模型組MDA含量較正常對照組增加了36.9％，差異有統計學的意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組MDA含量比曲安縮松模型組減少了31.9％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
(5)各組小鼠免疫器官重量的變化各組小鼠與正常對照組小鼠脾臟和胸腺的重量變化如表3.6和3.7。
表3.6小鼠胸腺重量檢測結果

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
表3.7小鼠脾臟重量檢測結果

注(1)與曲安縮松模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.05；(2)變化比例1與正常對照組比較，變化比例2與曲安縮松模型組比較。
從表3.6和3.7可見，曲安縮松模型組小鼠脾臟和胸腺明顯萎縮，濕重分別較正常對照組減少了43.8％和45.4％，差異有統計學意義(P＜0.05)。復方曲安縮松丹參涂劑組胸腺濕重及脾臟濕重分別比曲安縮松模型組增加了52.6％、44.5％，差異有統計學意義(P＜0.05)。
小結與曲安縮松模型組相比，丹參組表皮厚度、彈力纖維、皮膚羥脯氨酸含量及SOD活力增加，而皮膚中的MDA含量下降，脾臟和胸腺的重量均增加。以上實驗結果顯示復方曲安縮松丹參涂劑組具有抗外用糖皮質激素誘發皮膚不良反應的作用。
研究表明正常3月齡小鼠經外用0.2％濃度曲安縮松酊劑后，可造成小鼠皮膚表皮層厚度變薄，彈力纖維減少等皮膚萎縮的形態學改變，另外還可使小鼠的脾臟和胸腺出現萎縮。以上這些改變與皮膚的SOD活力降低、羥脯氨酸含量減少、MDA含量增加以及糖皮質激素的免疫抑制作用有關。說明了長期外用糖皮質激素可導致小鼠皮膚呈現萎縮的典型改變，而且還可以使小鼠出現免疫抑制。
外用復方曲安縮松丹參涂劑，可使小鼠皮膚表皮層厚度增厚，彈力纖維增加，可使皮膚的SOD活力增強、羥脯氨酸含量增加、而MDA含量減少；可使小鼠萎縮的脾臟和胸腺得到恢復。以上這些均說明了復方曲安縮松丹參涂劑組可有效對抗外用糖皮質激素引起的皮膚萎縮，而且還可增強小鼠的免疫力。
另一項研究證明，丹參酮也具有丹參同樣的作用，用丹參酮配制的含曲安縮松的外用制劑，也有增強療效，降低不良反應的作用。
權利要求
1.一種療效高副作用少的含糖皮質激素的供外用的藥物組合物，其特征是該藥物組合物是它同時含有曲安縮松和丹參。
2.一種療效高副作用少的含糖皮質激素的供外用的藥物組合物，其特征是該藥物組合物中的曲安縮松可以用其他可供外用的糖皮質激素替代。
3.一種療效高副作用少的含糖皮質激素的供外用的藥物組合物，其特征是該藥物組合物中的丹參可以用丹參酮替代。
4.如權利要求1所述的療效高副作用少的含糖皮質激素的供外用的藥物組合物，該藥物組合物可制成供皮膚外用的制劑。
全文摘要
本發明公開了由糖皮質激素與丹參或丹參酮組成的療效高副作用少的糖皮質激素類供外用的藥物組合物。糖皮質激素是防治皮膚病的重要藥物，但糖皮質激素長期大劑量使用可造成一系列嚴重的不良反應，本發明發現丹參及其提取的有效成分丹參酮與糖皮質激素組成復方后能增強糖皮質激素的抗炎作用，減輕其不良反應，可用于防治各種相關的皮膚疾病。
文檔編號A61K31/57GK1965899SQ20061014698
公開日2007年5月23日 申請日期2006年11月27日 優先權日2006年11月27日
發明者吳鐵, 崔燎, 陳志東, 高敏堅, 許宗嚴, 高志祥 申請人:廣東醫學院