專利名稱：因子VII或VIIa的GLA結構域變體的制作方法
技術領域：
本發明涉及凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽的新的Gla結構域變體，及所述多肽變體在治療中的用途，具體是治療多種凝血相關疾病的用途。
背景技術：
凝血是由多種血液組分(或因子)之間復雜的相互作用組成的過程，最終導致纖維蛋白凝塊形成。通常參與被稱為凝血“級聯反應”的血液組分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，通過活化劑的作用其可轉變為活性形式。FVII就是這些凝血因子中的一種。
FVII是一種維生素K依賴性血漿蛋白，在肝中合成，并以分子量為53kDa的單鏈糖蛋白形式分泌到血液中(Broze & Majerus，J.Biol.Chem 1980；2551242-1247)。FVII酶原在單一位點R152-I153處被蛋白酶水解，產生由一個二硫鍵連接的雙鏈，從而轉變為活性形式(FVIIa)。FVIIa與組織因子的復合體(FVIIa復合體)可將凝血因子IX和凝血因子X均轉變為其活性形式，接下來的反應導致快速的凝血酶產生以及纖維蛋白形成(Osterud & Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。
FVII經歷翻譯后修飾，包括依賴維生素K的羧基化，導致在該分子N末端區產生10個γ羧基谷氨酸殘基。因此，SEQ ID NO1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位殘基是Gla結構域中對于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸殘基。其他翻譯后修飾包括在第145和322位的兩個天然產生的N-糖基化位點，以及在第52和60位的兩個天然產生的O-糖基化位點處分別連接糖組分。
編碼人FVII(hFVII)的基因被定位于13號染色體的q34-qter9(deGrouchy等，Hum Genet 1984；66230-233)。其包含9個外顯子，長度為12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；845158-5162)。FVII的基因組構和蛋白結構與其它維生素K依賴性原凝血蛋白的結構相似，外顯子1a和1b編碼信號序列；外顯子2編碼多肽和Gla結構域；外顯子3編碼一段短的疏水區；外顯子4和5編碼表皮生長因子樣結構域；以及外顯子6到8編碼絲氨酸蛋白酶的催化結構域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；243736-3750)。
利用X射線晶體成像的方法(Banner等，Nature，1996；38041和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；2852089)，已報道了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；968925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa與可溶性組織因子的復合體，以及hFVII的小片段的實驗三維結構(Muranyi等，Biochemistry，1998；3710605和Kao等，Biochemistry，1999；387097)。
關于FVII蛋白工程化突變體的報道相對較少(Dickinson & Ruf，J BioChem，1997；27219875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；2738516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；27130685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；381957-1966)。
已報道了FVII在BHK或其他哺乳動物細胞中的表達(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2內切蛋白酶在真核細胞中的共表達(WO00/28065)。
人重組FVIIa的商品化制劑以NovoSeven的名稱出售。NovoSeven指明用于治療血友病A或B患者的出血發作。NovoSeven是市售的可治療出血發作的唯一有效并且可靠的rFVIIa。
WO91/1154中報道了FVII的一種無活性形式，其中152的精氨酸和/或153的異亮氨酸被修飾。這些氨基酸位于活化位點。WO96/12800描述了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑導致的FVIIa的失活；Petersen等說明了FVIIa在I153的α氨基酸基團氨甲酰化導致的失活(Eur J Biochem，1999；261124-129)。這種失活形式可以與野生型FVII或FVIIa競爭對組織因子的結合以及抑制凝固活性(clotting activity)。這提示這種FVIIa的失活形式可用于治療極易產生凝血的患者，如患膿毒病的患者，其易于發作心肌梗塞或血栓性中風。
對于治療失控的出血諸如外傷等的情況，相信FVIIa能夠活化FX為FXa而不與組織因子結合，并且所述活化反應據信主要見于活化的血小板(Hedner et al.Blood Coagulation & Fibrinolysis，2000；11；107-111)。然而，hFVIIa或rhFVIIa在缺乏組織因子的情況下對FX具有低活性，由此失控出血的治療例如在外傷患者中，需要分別為高劑量和多個劑量的hFVIIa或rhFVIIa。因此，為更有效治療失控出血(最小化失血)，需要改進的FVIIa分子，其在缺乏組織因子的條件下對FX具有高活性。所述改進的FVIIa分子與rhFVIIa相比，在用于失控的失血時，顯示較低的凝血事件(作用較快/增加的凝固活性)。
FVII/FVIIa的Gla結構域變體公開于WO 99/20767，US 6,017,882和WO 00/66753，其中位于Gla結構域中的一些殘基鑒定為對于磷脂膜結合而言是重要的，并由此對FX活化是重要的。具體地，發現殘基10和32是關鍵的，且增加的磷脂膜結合親和力，以及由此增強的FX活化，可通過進行突變P10Q和K32E實現。具體地，發現FX活化與rhFVIIa相比在邊緣凝血條件諸如在存在低水平組織因子的條件下增強。
WO 01/58935公開通過定點糖基化或PEG化開發具有增加的半壽期等的FVII或FVIIa分子的新策略。
WO 03/093465公開FVII或FVIIa變體，其具有位于Gla結構域中的修飾并具有導入Gla結構域外的一或多種N-糖基化位點。
WO 2004/029091公開FVII或FVIIa變體，其具有位于組織因子結合位點的特定修飾。
本發明人現在鑒定了Gla結構域中其它殘基，其可進一步增加磷脂膜結合親和力并由此進一步增強FX活化。本發明的FVII或FVIIa變體還降低組織因子結合親和力。
本發明的目標是提供改進的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa變體)，其能夠比hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa更為有效地活化FX為FXa。具體地，本發明的目標是提供改進的FVII或FVIIa分子(FVII或FVIIa變體)，其能夠在組織因子缺乏的條件下比hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa更為有效地活化FX為FXa。這些目標通過本發明提供的FVII或FVIIa變體說明。

發明內容
本發明第一方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽變體，其具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相對于SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的1-15個氨基酸的修飾，其中疏水氨基酸殘基通過位置34中的氨基酸取代而被導入。
本發明第二方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽變體，其具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相對于SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的1-15個氨基酸的修飾，其中所述氨基酸序列包含位置36中的氨基酸取代。
本發明第三方面涉及因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽變體，其具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括具有相對于SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的3-15個氨基酸的修飾，其中氨基酸序列包含位置10和32中的氨基酸取代以及位于選自位置74，77或116的位置中的至少一種其它氨基酸取代。
本發明其它方面涉及本發明多肽變體的編碼核苷酸序列，包含所述核苷酸序列的表達載體，以及包括所述核苷酸序列或表達載體的宿主細胞。
本發明的其它方面涉及包含本發明多肽變體的藥物組合物，本發明多肽變體或本發明的藥物組合物作為藥物的用途，以及利用本發明的多肽變體或藥物組合物的治療方法。
本發明的其它方面將從以下說明書以及所附權利要求顯而易見。


圖1顯示當在“全血測定法(Whole Blood Assay)”中測定時，凝固時間相對于本發明的變體濃度。
圖2顯示在“凝血圖測定法(Thrombogram Assay)”中測定的本發明變體的最大組織因子-依賴性凝血酶生成速率。
圖3顯示在“凝血圖測定法”中測定的本發明變體的最大磷脂-依賴性凝血酶生成速率。
發明詳述定義在本申請和本發明的全文中，使用下列定義術語”FVII”或“FVII多肽”指以單鏈形式提供的FVII分子。FVII多肽的一個實例是野生型人FVII(hFVII)，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1。但是，應理解術語“FVII多肽”還包括hFVII-樣分子，諸如SEQ ID NO1的片段或變體，具體是其序列與SEQ ID NO1相比包含至少一個，諸如達15個，優選達10個氨基酸修飾的變體。
術語”FVIIa”或“FVIIa多肽”指以活化的兩條鏈形式提供的FVIIa分子。當SEQ ID NO1所示氨基酸序列用于描述FVIIa的氨基酸序列，應理解單-鏈形式的R152和I153之間的肽鍵被切割，并且所述鏈之一包含氨基酸殘基1-152，其它鏈包含氨基酸殘153-406。
術語“rFVII”和“rFVIIa”分別指重組技術產生的FVII和FVIIa分子。
術語“hFVII”和“hFVIIa”分別指野生型人FVII和FVIIa，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1。
術語“rhFVII”和“rhFVIIa”指人野生型FVII和FVIIa，其具有氨基酸序列SEQ ID NO1，通過重組方法制備。RhFVIIa的實例是NovoSeven。
本文術語“Gla結構域”意圖包括SEQ ID NO1的氨基酸殘基1-45。
因此，術語“在Gla結構域外的位置”包括SEQ ID NO1的氨基酸殘基46-406。
簡寫“FX”，“TF”和“TFPI”分別指因子X，組織因子和組織因子途徑抑制物。
術語“蛋白酶結構域“用于N末端起的大約殘基153-406。
術語“催化位點”用于指多肽變體的S344，D242和H193組成的催化三聯體。
術語“親代”意圖指將根據本發明修飾/改進的分子。盡管將通過本發明修飾的親代多肽可為任何FVII或FVIIa多肽，并因此來自任何來源，例如，非人哺乳動物來源，優選親代多肽是hFVII或hFVIIa。
“變體”是與其親代多肽有一或多個氨基酸殘基不同的多肽，通常在1-15氨基酸殘基中(例如在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15氨基酸殘基中)，諸如在1-10氨基酸殘基中，例如在1-8，1-6，1-5或1-3個氨基酸殘基中。通常，所述親本多肽是hFVII或hFVIIa。
術語“偶聯物”(或可互換為“偶聯的多肽”)表示由一個或多個多肽與一個或多個非多肽組分(如聚合物分子、親脂化合物、糖組分及有機衍生劑)共價連接而形成的異源(復合或嵌合的意思)分子。優選地，偶聯物在有關濃度和條件下是可溶的，即在生理液體如血液中可溶。本發明偶聯多肽的實施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
術語“共價連接”表示該多肽和非多肽組分或者彼此直接共價連接，或者通過至少一種間插組分，如橋、間隔子或連接部分，間接地相互共價連接。
本文所用術語“非多肽組分”表示分子，其與氨基酸單體組成的肽聚合物不同并且通過肽鍵相連在一起，所述分子能夠與本發明多肽變體的連接基團偶聯。此類分子的優選實例包括聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑。在本文中用于本發明的偶聯物時，應理解為非多肽組分通過多肽的連接基團連接到偶聯的變體的多肽部分。如上說明，非多肽組分可能直接或間接共價連接到連接基團。
術語“聚合物分子”被定義為由兩個或多個單體共價連接形成的分子，其中所述單體無一是氨基酸殘基，除非聚合物是人白蛋白或另一種豐富血漿蛋白。術語“聚合物”可與術語“聚合物分子”互換。該術語涵蓋經體外糖基化連接的碳水化合物分子，所述體外糖基化即體外進行的合成性糖基化，其通常涉及碳水化合物分子與多肽變體的連接基團的共價連接，任選使用交聯劑。
術語“糖部分”意圖指含碳水化合物的分子，其包括一或多個單糖殘基，能夠通過體內糖基化與多肽變體相連(以產生糖基化的多肽變體形式的多肽變體偶聯物)。術語“體內糖基化”意圖指出現于體內的糖部分的任何連接，即在用于表達所述多肽變體的糖基化型細胞中的翻譯后加工中，例如通過N連接的或O連接的糖基化。寡糖結構的確切結構，在很大程度上依賴于目的糖基化型生物體。
“N-糖基化位點”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸殘基，N是天冬酰胺，S/T/C是絲氨酸，蘇氨酸或半胱胺酸，優選絲氨酸或蘇氨酸，最優選蘇氨酸。優選，位于相對于天冬酰胺的位置+3的氨基酸殘基不是脯氨酸殘基。
“O-糖基化位點”是絲氨酸或蘇氨酸殘基的OH-基團。
術語“連接基團”表示多肽變體的功能基團，具體是其氨基酸或碳水化合物部分的功能基團，其能夠與非多肽組分如聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機衍生劑偶聯。有用的連接基團及其相配的非多肽組分表示在下圖中。

對于體內N-糖基化來說，術語“連接基團”以非常規方式用于表示構成N-糖基化位點的氨基酸殘基(序列為N-X-S/T/C，如上所述)。盡管N-糖基化位點的天冬酰胺殘基是在糖基化期間與糖組分連接的殘基，但這種連接不能完成，除非該N-糖基化位點存在其它氨基酸殘基。
因此，當非多肽組分是糖組分，并且偶聯是通過體內N-糖基化實現時，與目的多肽氨基酸序列改變相關的術語“含有非多肽組分連接基團的氨基酸殘基”應理解為構成N-糖基化位點的一個或多個氨基酸殘基被改變，改變方式是功能性的N-糖基化位點被導入氨基酸序列。
在本申請中，氨基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定義的來使用，此定義基于IUPAC命名法(IUPAC命名法以及氨基酸和肽的符號(殘基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘誤Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
術語“氨基酸殘基”表示包含任何天然或合成氨基酸殘基，并主要意圖值包含在20種天然存在的氨基酸組成的組中的氨基酸殘基，即選自以下氨基酸殘基組成的組丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
用于鑒定氨基酸位置的術語舉例說明如下G124表示SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第124位被甘氨酸殘基占據，G124R表示第124位甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代。備選取代可以“/”表示，如N145S/T表示其中第145位的天冬酰胺被絲氨酸或蘇氨酸取代的氨基酸序列。多取代以“+”表示，如K143N+X145S/T表示這樣的氨基酸序列，其中第143位賴氨酸殘基被天冬酰胺殘基所取代，并且第145位的天冬酰胺殘基被絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基所取代。額外氨基酸的插入，如在G124之后插入一個丙氨酸殘基，表示為G124GA。在G124之后插入兩個其它丙氨酸殘基表示為G124AA等。本發明中，術語“插入位置X中”或“在位置X插入”表示氨基酸被插入位置X和X+1之間的氨基酸殘基。氨基酸殘基的缺失以星號表示。例如，第124位甘氨酸的缺失表示為G124*。
除非另有說明，此處氨基酸殘基的序號對應于SEQ ID NO1所示野生型FVII/FVIIa的氨基酸序列。
此處所用與特定突變相關的術語“不同于”是指除特定的氨基酸差異外許可存在另外的差異。例如，除了意在增加FX活化的Gla結構域中進行的修飾以外，所述多肽可包含其它不必然與該效果相關的修飾。
因此，除了此處公布的氨基酸改變外，可理解如需要，本發明變體的氨基酸序列多肽的氨基酸序列可含有其它改變，即其他的取代、插入或缺失。例如，這些改變可能包括截短N-和/或C末端的一個或多個氨基酸殘基(例如1-10個氨基酸殘基)，或在N-和/或C末端導入一個或多個額外的氨基酸殘基，如在N末端加入甲硫氨酸殘基或將半胱氨酸殘基導入C末端或其附近，以及“保守性氨基酸取代”，即，取代是在具有相似特性的氨基酸的組，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸之間進行的。
所述保守取代的實例顯示在下表中。

題為“Gla結構域外的修飾”和“Gla結構域外的其它修飾”的部分中還公開了其它修飾的其它實例。
術語“核苷酸序列”表示兩個或多個核苷酸分子的連續片段。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來源或其任意組合。
術語“載體”指質粒或其它核苷酸序列，其能夠在宿主細胞中復制或整合入宿主細胞基因組，并由此用于與相容的宿主細胞(載體-宿主系統)聯合執行不同的功能以促進核苷酸序列的克隆，即制備有用量的序列，指導所述序列編碼的基因產物的表達，以及將所述核苷酸序列整合入宿主細胞基因組中。所述載體將根據其執行的功能而含有不同組分。
“細胞”、“宿主細胞”、“細胞系”和“培養細胞”在本文中可互換使用并且這些術語都應當理解為包括細胞生長或培養所產生的后代。
“轉化”和“轉染”可互換使用，指將DNA導入細胞的過程。
“可操作連接的”指兩個或多個核苷酸序列通過酶促連接等方式共價連接在彼此相關的構象中，使序列行使正常功能。通常，“可操作連接的”意指被連接的核苷酸序列是鄰接的，并且在分泌引導區的情況下，是鄰接的而且在閱讀狀態下。連接在方便的限制性位點來完成。如果不存在此類位點，那么使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭以及標準的重組DNA方法。
本發明術語“修飾”或“氨基酸修飾”意圖包括氨基酸側鏈的取代，氨基酸殘基的取代，氨基酸殘基的缺失或插入。
術語“導入”主要指氨基酸殘基的導入，具體是通過取代現存氨基酸殘基，或者通過插入另外的氨基酸殘基。
術語“去除”指氨基酸殘基的去除，具體是通過將該氨基酸殘基用另外的氨基酸殘基取代，或者使待去除的氨基酸殘基缺失(沒有取代)。
本發明術語“活性”應被理解為與測定法相關的活性，所述測定法中實際測定了該活性。
因此，術語“解酰胺基活性”用于指在“解酰胺測定法”中測定的活性。為了顯示“解酰胺活性”，活性形式的本發明變體應具有在本文所述“解酰胺測定法”中測定的rhFVIIa的解酰胺活性的至少10％。本發明變體的優選實施方案中，其活化的形式應具有rhFVIIa的解酰胺活性的至少20％，諸如至少30％，例如至少40％，更優選至少50％，諸如至少60％，例如至少70％，更優選至少80％，諸如本文所述“解酰胺測定法”中測定的rhFVIIa的解酰胺活性的至少90％。在該變體的感興趣的實施方案中，在其活化的形式中，所述變體具有與rhFVIIa基本相同的解酰胺活性，諸如rhFVIIa的解酰胺活性的75-125％。
術語“凝固活性”指在本發明所述“全血測定法”中測定的活性，即獲得凝塊形成所需的時間。因此，較少的凝固時間對應較高的凝固活性。
術語“增加的凝固活性”用于說明在可比條件下，在本發明的“全血測定法”中測定時，所述多肽變體的凝固時間與rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的凝固時間相比，在統計學上明顯降低。
本發明術語“活性”也指變體將FX活化為FXa的能力。該活性也指“FX活化活性”或“FXa生成活性”并可在本文所述“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定。
術語“增加的FX活化活性”或“增加的FXa生成活性”用于指本發明的變體，在其活化的形式中，與參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，其活化FX為FXa的能力在統計學上明顯增加。本發明的變體(在其活化的形式中)具有的FX活化活性增加的程度可方便地在本發明所述“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定。
與給定的物質聯用的術語“免疫原性”旨在表示該物質可誘導免疫系統反應的能力。免疫反應可以是細胞或抗體介導的反應(對免疫原性更進一步的定義參見，如，RoittEssential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般來說，抗體反應性下降提示免疫原性下降。免疫原性可通過本領域任何已知的方法來測定，如體內方法或體外方法。
術語“功能性體內半壽期”使用其通常的含義，即多肽在體內/靶器官中仍具有50％生物活性的時間，或者多肽的活性為最初活性的50％的時間。
作為測定功能性體內半壽期的另一種方法，可測定“血清半壽期”，即，50％多肽在被清除之前在血漿或血流中循環的時間。血清半壽期的測定常常比測定功能性體內半壽期簡單并且血清半壽期的大小通常可以很好地說明功能性體內半壽期大小。血清半壽期的其它可替換術語包括“血漿半壽期”、“循環半壽期”、“血清清除率”、“血漿清除率”和“清除半壽期”。該多肽通過網狀內皮系統(RES)、腎、脾或肝中一個或多個的作用，通過組織因子、SEC受體或其他受體介導的清除作用，或通過特異或非特異的蛋白水解作用而清除。通常清除依賴于大小(相對于腎小球過濾的截留值而言)、電荷、連接的碳水化合物鏈，以及是否存在該蛋白的細胞受體。保留的功能通常選自前凝血劑、蛋白酶解或受體結合活性。功能性體內半壽期和血清半壽期可通過本領域中已知的任何合適的方法來測定。
術語“增加的”功能性體內半壽期或血清半壽期指，如在可比條件(通常在試驗動物中，諸如大鼠，兔，豬或猴中測定)測定的那樣，多肽變體的相關半壽期相對于參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的相關半壽期而言在統計學上明顯增加。
術語“AUCiv”或“靜脈內給藥時的曲線下面積”以其通常的含義使用，即作為血清-時間曲線中活性下的面積，其中所述多肽變體經靜脈內給藥，具體是在大鼠內靜脈內給藥。通常測定的活性是上述“凝固活性“。一旦確定活性-時間點，可通過計算機程序諸如GraphPad Prism 3.01方便地計算AUCiv。
將理解為直接比較不同分子(例如本發明的變體與參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa)的AUCiv值，應給予相同量的活性。因此，AUCiv-值通常被標準化(即校正了注射的劑量中的差異)并表達為給予的AUCiv/劑量。
術語“對蛋白酶解降低的敏感性”主要指經可比條件下的檢測，該多肽變體與hFVIIa，rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，對蛋白酶解的敏感性降低。優選，蛋白酶解降低了至少10％，如至少25％(例如降低了10％-25％或10-50％)，諸如至少25％(例如25-50％，25-75％，或25-100％)，更優選降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了50-75％或50-100％)，更優選降低了至少60％，諸如至少降低了75％(例如75-100％)，或甚至降低了至少90％。
術語“腎清除”使用其通常的含義，即發生在腎的清除，例如，通過腎小球過濾、腎小管排泄或在腎小管細胞中的降解來完成。腎清除取決于多肽的物理特性，包括大小(直徑)流體體積、對稱性、形狀/剛性和電荷。通常來說，大約為67kDa的分子量被認為是腎清除的截留值。腎清除可通過任何合適的測定方法來建立，如已建立的體內測定方法。通常，腎清除通過將標記的(如，放射標記的或熒光標記的)多肽給予患者并測定從患者收集的尿液中的標記物活性來測定。腎清除的下降經過可比條件下與相應參照多肽rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa，進行比較而確定。優選，所述多肽變體的腎清除率比rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa降低至少50％，優選降低至少75％，最優選降低至少90％。
術語“組織因子結合位點”，“活性位點區”和“活性位點結合裂隙的脊”參照實施例1定義。
術語“疏水氨基酸殘基”包括以下氨基酸殘基異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
術語“帶負電的氨基酸殘基”包括以下氨基酸殘基天門冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。
術語“帶正電的氨基酸殘基”包括以下氨基酸殘基賴氨酸(K)，精氨酸(R)和組氨酸(H)。
本發明的變體在親本多肽的Gla結構域中的修飾優選產生這樣的分子，其具有增加的磷脂膜結合親和力，增加的活化FX為FXa的能力，和/或增加的凝固活性。本發明的變體也可具有降低的組織因子結合親和力，并在與組織因子結合時具有降低的活性。
不受任何具體理論的限制，目前認為增強的磷脂膜結合親和力導致其它凝血因子具體是FX附近的活化的多肽變體的局部濃度較高。由此，將FX活化為FXa的速率較高，僅僅由于活化的FVII變體與FX的更高的摩爾比。FX的活化速率提高導致活性凝血酶的量較高，由此纖維蛋白的交聯率更高。
因此，認為利用本發明多肽變體的醫學治療可提供超過目前可得的rhFVIIa化合物(NovoSeven)的優勢，諸如劑量低，有效性增加和/或作用更快。
此外，相信組織因子-非依賴性變體，即與組織因子結合時與野生型人因子VIIa相比活性降低的變體，可在降低不需要的血凝塊形成(例如血栓形成或血栓栓塞)危險性方面提供一些安全性優勢，具體是用于治療急性失控的出血事件諸如外傷時。
因此，在本發明高度優選的實施方案中，所述多肽變體，在其活化的形式中以及與參比分子rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比時，具有增加的FX活化活性，具體是在組織因子-非依賴性測定法諸如本文所述的“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定時。更具體，在本文所述“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定時，所述多肽變體的活性的形式的FX活化活性與參比分子的FX活化活性的比例優選為至少1.25。更優選，所述比例為至少1.5，諸如至少1.75，例如至少2，更優選至少3，諸如至少4，最優選至少5。
當參比分子為rhFVIIa時，在本文所述“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定的情況下，所述多肽變體的活性的形式的FX活化活性與參比分子的FX活化活性的比例優選至少約5，通常至少約10，諸如至少約15或20。
在本發明其它高度優選的實施方案中，本發明的變體與rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比具有增加的凝固活性(即減少的凝固時間)。本發明優選實施方案中，在本文所述“全血測定法”中測定時，對于變體而言達到血凝塊形成的時間(t變體)與對于rhFVIIa(twt)或[P10Q+K32E]rhFVIIa而言達到血凝塊形成的時間(tP10Q+K32E)的比例至多為0.9。更優選所述比例至多0.75，諸如0.7，更優選所述比例至多0.6，最優選所述比例至多0.5。
一或多種上述性質可通過本文所述修飾實現。
包括位置34中的疏水氨基酸殘基的本發明的變體如上所述，本發明第一個方面涉及FVII或FVIIa多肽變，其具有包括相對于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO1)的1-15個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中疏水氨基酸殘基通過位置34中的氨基酸取代導入。
將被導入位置34中的疏水氨基酸殘基可選自以下殘基組成的組I，L，M，V，F，Y和W，優選I，L和V，具體是L。
優選實施方案中，所述變體還包含位置10中的氨基酸取代，具體是P10Q，和/或位置32中的氨基酸取代，具體是K32E。本發明一個具體優選實施方案中，所述變體包含位于位置10和32中的取代，諸如P10Q+K32E。
因此，在本發明感興趣的實施方案中，所述變體包含取代P10Q+K32E+A34L。
在本發明具體的感興趣的實施方案中，所述變體還包含在位置3和4之間的至少一種(通常一種)氨基酸殘基的插入。優選插入的氨基酸殘基是疏水氨基酸殘基。最優選所述插入是A3AY。因此，在本發明具體感興趣的實施方案中，所述變體包含修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L。
除了上述任何修飾，所述變體可包括位于位置33中的其它取代。優選，疏水氨基酸殘基通過位置33中的取代，具體是D33F來導入。
Gla結構域還可包含其它位置中的修飾，具體是位置8，11和28中的修飾，諸如R28F或R28E。另一方面，應理解Gla結構域不應被修飾到使得膜結合性質受損的程度。因此，優選在γ-羧化的殘基中不進行修飾，即優選在殘基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不進行修飾。在類似的方式中，通常優選不將非肽部分諸如糖部分和/或PEG基團導入Gla結構域。因此，優選在Gla結構域中不進行任何可產生體內N-糖基化位點的修飾。
最后，將理解本部分所述Gla結構域中的修飾可優選與Gla結構域以外的位置中的一或多種修飾組合(見下文題為“修飾Gla結構域外的”和“Gla結構域外的其它修飾”的部分)。
包括位置36中的氨基酸取代的本發明的變體如上所述，本發明第二方面涉及FVII或FVIIa多肽變體，其具有包括相對于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO1)的1-15個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含位置36中的氨基酸取代。
優選，將通過取代被導入位置36中的氨基酸殘基是帶負電的氨基酸殘基，例如R36E或R36D，具體是R36E。
優選實施方案中，所述變體還包含位置10中的氨基酸取代，具體是P10Q，和/或位置32中的氨基酸取代，具體是K32E。本發明一個具體優選實施方案中，所述變體包含位置10和32中的取代，諸如P10Q+K32E。
本發明的變體還包含位置38中的取代。優選帶負電的氨基酸殘基通過取代導入位置38，例如K38E或K38D，具體是K38E。
因此，感興趣的變體是包含以下取代的變體取代P10Q+K32E+R36E或P10Q+K32E+R36E+K38E。
在具體感興趣的實施方案中，所述變體還包含位置34中的氨基酸取代(即所得變體包含以下殘基中的取代10+32+34+36或10+32+34+36+38)。優選，帶負電的氨基酸殘基通過位置34中的取代例如A34E或A34D導入。
優選變體的具體實例是包括取代取代P10Q+K32E+A34E+R36E或P10Q+K32E+A34D+R36E+K38E的那些。
本發明感興趣的實施方案中，所述變體還包含至少一種(通常一種)位于位置3和4之間的氨基酸殘基的插入。優選，插入的氨基酸殘基是疏水氨基酸殘基。最優選所述插入是A3AY。
除了上述任何修飾，所述變體還包含位于位置33中的取代。優選，疏水氨基酸殘基通過位置33中的取代具體是D33F導入。
Gla結構域可還含有其它位置中的修飾，具體是位置8，11和28中，諸如R28F或R28E。另一方面，應理解Gla結構域不應被修飾到使得膜結合性質受損的程度。因此，優選在γ-羧化的殘基中不進行修飾，即優選在殘基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不進行修飾。在類似的方式中，通常優選不將非肽部分諸如糖部分和/或PEG基團導入Gla結構域。因此，優選在Gla結構域中不進行任何可產生體內N-糖基化位點的修飾。
最后，將理解本部分所述Gla結構域中的修飾可優選與Gla結構域以外的位置中的一或多種修飾組合(見下文題為“Gla結構域外的修飾”和“Gla結構域外的其它修飾”的部分)。
包括位置74，77或116中的氨基酸取代的本發明的變體如上所述，本發明第三方面涉及FVII或FVIIa多肽變體，其具有包括相對于hFVII或hFVIIa(SEQ ID NO1)的3-15個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含位置10，32中的氨基酸取代以及至少一種位于選自位置74，77和116組成的組的位置中的氨基酸取代。
優選實施方案中，位置10中的氨基酸取代是P10Q，位置32中的氨基酸取代是K32E。
更優選，位置74，77或116中的取代選自P74S，E77A和E116D組成的組。
在感興趣的實施方案中，變體還包含位置34中的氨基酸取代。優選，帶負電的氨基酸殘基通過取代導入位置34，例如A34E或A34D，具體是A34E。
本發明感興趣的實施方案中，所述變體還包含至少一種(通常一種)位于位置3和4之間的氨基酸殘基的插入。優選，插入的氨基酸殘基是疏水氨基酸殘基。最優選所述插入是A3AY。
因此，感興趣的變體的具體實例包括含有修飾A3AY+P10Q+K32E+E116D，A3AY+P10Q+K32E+E77A和P10Q+K32E+A34E+P74S的變體。
除了上述任何修飾，所述變體還包含位于位置33中的取代。優選，疏水氨基酸殘基通過位置33中的取代具體是D33F導入。
Gla結構域可還含有其它位置中的修飾，具體是位置8，11和28中，諸如R28F或R28E。另一方面，應理解Gla結構域不應被修飾到使得膜結合性質受損的程度，即優選在殘基6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中不進行修飾。優選在Gla結構域中不產生體內N-糖基化位點。
最后，將理解本部分所述Gla結構域中的修飾可優選與Gla結構域以外的位置中的一或多種修飾組合(見下文題為“Gla結構域外的修飾”和“Gla結構域外的其它修飾”的部分)。
Gla結構域外的修飾2.3小時的循環rhFVIIa半壽期在““Summary Basis for Approval forNovoSeven”，FDA參考號96-0597中有報道。相對較高的劑量和頻繁的給藥對于實現并保持所需治療或預防效果是必須的。結果，難以實現適宜的劑量調控，并且對頻繁的靜脈內給藥的需要對患者的生活方式造成限制。
具有較長循環半壽期和/或增加的生物利用度(諸如靜脈內給藥時與rhFVIIa相比具有增加的曲線下面積)將減少必要的給藥次數。由于目前需要頻繁注射并可能獲得更佳的治療性FVIIa水平同時提高治療效果，很明顯需要改進的FVII-或FVIIa-樣分子。
因此，本發明的另一目的是提供改良的FVII或FVII分子(FVII或FVIIa變體)，其具有增加的生物利用度(諸如與參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，在經靜脈內給藥時，曲線下面積增加)，并且與參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比能更有效地將因子X活化為因子Xa(不與組織因子結合)(從而能更有效地治療失控的出血，諸如外傷，或慢性疾病諸如血友病)。
因此，感興趣的本發明的變體是這樣的變體，在其活化的形式中，與參比分子諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，經靜脈內給藥時產生增加的曲線下面積(AUCiv)。這可通過在大鼠中經靜脈內給藥方便地確定。更具體，本發明感興趣的變體是活化的形式中的所述變體的AUCiv與參比分子，諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的AUCiv的比例為至少1.25，諸如至少1.5，例如至少1.75，更優選至少2，諸如至少3，更優選至少4，諸如至少5，具體是在大鼠中(經靜脈內)給藥時。
該效應通常對應與參比分子，諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，增加的功能性體內半壽期和/或增加的血清半壽期。因此，在本發明其它感興趣的實施方案中，所述活化的形式中的變體的功能性體內半壽期或血清半壽期與參比分子，諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的功能性體內半壽期或血清半壽期的比例為至少1.25.更優選，活化的形式中的所述變體的相關半壽期與參比分子，諸如rhFVIIa或[P10Q+K32E]rhFVIIa的相關半壽期的比例為至少1.5，諸如至少1.75，例如至少2，更優選至少3，諸如至少4，例如至少5。
一種增加蛋白質循環半壽期的方法是保證蛋白質的腎清除率降低。這可通過將所述蛋白質與能夠降低所述蛋白質的腎清除率的化學部分例如聚乙二醇(PEG)偶聯來實現。
此外，化學部分與蛋白質相連或取代暴露于蛋白水解的氨基酸可有效阻斷與蛋白水解酶的接觸，否則該蛋白水解酶將導致該蛋白發生蛋白水解。
如上所述，由于蛋白水解導致的不穩定性是目前的rhFVIIa治療的已知問題。蛋白水解因此是獲得與凍干產品相反的溶液中的制備物的主要障礙。獲得穩定可溶性制備物的優點在于使得患者更容易使用，并且在緊急情況下，能迅速起作用，這很可能會拯救生命。通過在主要蛋白水解位點的定點誘變來防止蛋白水解的努力已經公開于WO 88/10295。
WO 01/58935公開多種導致AUCiv，功能性體內半壽期和/或血清半壽期增加的修飾。WO 01/58935中公開的變體是通常用于開發改進的FVII或FVIIa分子的新策略的結果，所述策略也可用于本發明的親代FVII或FVIIa多肽。
更具體地，通過在FVII或FVIIa多肽中去除和/或導入包括非-多肽部分連接基團的的氨基酸殘基，可特異性改造所述多肽使得所述分子更易于與所選非多肽部分偶聯，從而優化偶聯模式(例如保證非-多肽部分在FVII或FVIIa多肽變體表面的最佳分布和數量，并保證僅僅意圖被偶聯的連接基團存在于該分子中)，并由此獲得新的偶聯分子，其具有解酰胺活性以及與rhFVIIa相比而言一或多種改良的特性。
在本發明感興趣的實施方案中，位于Gla結構域以外的一種以上的氨基酸殘基被改變，例如所述改變包括去除以及導入含有用于所選非-多肽部分的連接基團的氨基酸殘基。除外去除和/或導入氨基酸殘基，所述多肽變體可包含與導入和/或去除包含用于非多肽部分的連接基團的氨基酸殘基無關的其它取代。
所述多肽變體還可附著于絲氨酸蛋白酶抑制物以抑制所述多肽變體的催化位點。可選，存在于所述催化位點中的一或多種氨基酸殘基(S344，D242和H193)可被突變以使得所得變體無活性。所述突變的一個實例是S344A。
包含用于非-多肽部分的連接基團的氨基酸殘基無論是被去除還是導入，其基于所選非-多肽部分的性質，在大多數情況中，基于將實現多肽變體與非多肽部分之間的偶聯的方法來選擇。例如，當所述非多肽部分是聚合物分子諸如聚乙二醇或聚烯烴氧化物衍生的分子，包含連接基團的氨基酸殘基選自以下殘基組成的組賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，組氨酸，以及酪氨酸，優選賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸以及谷氨酸，更優選賴氨酸和半胱氨酸，具體是半胱氨酸。
只要將非-多肽部分的連接基團導入親本多肽或從親本多肽中去除，將被修飾的氨基酸殘基的位置優選位于親本FVII或FVIIa多肽的表面，更優選被這樣的氨基酸殘基所占據，所述氨基酸殘基的側鏈有至少25％暴露于表面(如本文實施例1中定義的)，優選其側鏈的至少50％暴露于表面(如本文實施例1中定義的)。所述位置已經基于對hFVII或hFVIIa分子的3D結構的分析來鑒定，如WO 01/58935所述。
此外，待修飾的位置優選選自FVII或FVIIa分子的一部分，其位于組織因子結合位點以外，和/或活性位點區域以外，和/或活性位點結合裂隙的脊以外。這些位點/區域在本文的實施例1以及WO 01/58935中鑒定。
在去除連接基團的情況中，包括這樣的基團并占據如上定義的位置的相關氨基酸殘基優選被不包含用于目的非多肽部分的連接基團的不同的氨基酸殘基取代。通常，待去除的氨基酸殘基是對其而言偶聯是不利的殘基，例如位于所述多肽功能位點或其附近的氨基酸殘基(因為在所述位置的偶聯由于例如受體識別受損而導致產生的偶聯物失活或活性降低)。在本發明背景中，術語“功能位點”意圖指對于FVII或FVIIa的功能或作用而言必不可少或者參與到其中的一或多種氨基酸殘基。所述氨基酸殘基是功能位點的一部分。所述功能位點通過本領域已知方法測定，并優選通過分析FVIIa-組織因子復合體(見Banner et al.，Nature 1996；38041-46)的結構鑒定。
對于導入連接基團的情況，包含所述基團的氨基酸殘基被導入相關位置，優選通過取代占據所述位置的氨基酸殘基來導入。
FVII或FVIIa多肽中存在并可用于偶聯的連接基團的確切數目有賴于需要通過偶聯實現的效應。待獲得的效應例如依賴偶聯的性質和程度(例如非多肽部分的性質，需要或可能與所述多肽變體偶聯的非多肽部分的數目，它們應當被偶聯或應避免偶聯的情況，等)。
位于親本FVII或FVIIa多肽中Gla結構域以外的待修飾的氨基酸殘基總數(與氨基酸序列SEQ ID NO1相比)通常不超過10個。優選，FVII或FVIIa變體包含這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID NO1中的氨基酸殘基s 46-406在1-10氨基酸殘基中不同，通常在1-8或2-8氨基酸殘基，例如1-5或2-5個氨基酸殘基，諸如1-4或1-3個氨基酸殘基中不同，例如與SEQ ID NO1中的氨基酸殘基46-406有1，2或3個氨基酸殘基不同。
類似地，本發明的多肽變體可含有1-10個(另外的)非-多肽部分，通常1-8或2-8個(另外的)非-多肽部分，優選1-5或2-5個(另外的)非-多肽部分，諸如1-4或1-3個(另外的)非-多肽部分，例如1，2或3個(另外的)非-多肽部分。應理解所述另外的非-多肽部分與位于Gla結構域外的連接基團共價相連。
非-多肽部分是糖部分的本發明的多肽變體本發明優選實施方案中，糖部分的連接位點，諸如糖基化位點，具體是體內糖基化位點，諸如體內N-糖基化位點，已經被導入Gla結構域外的位置和/或從所述位置去除，優選導入所述位置。
本發明術語“天然存在的糖基化位點”包括位置N145，N322，S52和S60的糖基化位點。術語“天然存在的體內O-糖基化位點”包括位置S52和S60，術語“天然存在的體內N-糖基化位點”包括位置N145和N322。
因此，在本發明非常感興趣的實施方案中，所述非-多肽部分是糖部分且導入的連接基團是糖基化位點，優選體內糖基化位點，諸如體內O-糖基化位點或體內N-糖基化位點，具體是體內N-糖基化位點。通常導入1-10個糖基化位點，具體是體內N-糖基化位點，優選1-8，1-6，1-4或1-3糖基化位點，具體是體內N-糖基化位點，被導入Gla結構域外的一或多個位置。例如1，2或3個糖基化位點，具體是體內N-糖基化位點，可被導入Gla結構域外，優選通過取代來導入。
應理解為制備包含一或多個糖基化位點的多肽變體，所述多肽變體必須在這樣的宿主細胞中表達，所述宿主細胞能夠在糖基化位點連接糖(寡糖)部分或者可選發生體外糖基化。糖基化型宿主細胞的實例見下文題為“偶聯于糖部分”這一部分中。
導入了糖基化位點，具體是體內N-糖基化位點的位置的實例包括這樣的氨基酸殘基，其側鏈有至少25％暴露于表面(如本文實施例1所述)，諸如至少50％的側鏈暴露于表面。所述位置優選選自分子的一部分，其位于組織因子結合位點，和/或活性位點區域以外，和/或活性位點結合裂隙的脊以外。應理解術語“其側鏈有至少25％(或至少50％)暴露于表面”用于體內N-糖基化位點的導入時，該術語指在實際連接的糖部分的位置中氨基酸側鏈的表面可接近性。在許多情況下，需要在相對于實際連接了糖部分的精氨酸殘基而言的位置+2中導入絲氨酸或蘇氨酸殘基，導入了絲氨酸或蘇氨酸殘基的這些位置被被允許埋藏，即其側鏈有少于25％暴露于表面。
產生體內N-糖基化位點的所述取代的具體優選的實例包括選自以下組的取代A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其組合。更優選，所述體內N-糖基化位點通過選自以下取代組成的組的取代導入A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T，S314N+K316T，R315N+V317T，K316N+G318T，G318N，D334N及其組合。更優選，體內N-糖基化位點通過選自以下取代組成的組的取代導入T106N，A175T，I205T，V253N，T267N+S269T及其組合，具體是T106N，I205T和V253N中的一個，兩個或三個。
一個實施方案中，僅有一個體內N-糖基化位點通過取代導入。其它實施方案中，兩個或更多個(諸如兩個)體內N-糖基化位點通過取代導入。產生兩個體內N-糖基化位點的優選取代的實例包括選自以下取代組成的組的取代A51N+G58N，A51N+T106N，A51N+K109N，A51N+G124N，A51N+K143N+N145T，A51N+A175T，A51N+I205T，A51N+V253N，A51N+T267N+S269T，A51N+S314N+K316T，A51N+R315N+V317T，A51N+K316N+G318T，A51N+G318N，A51N+D334N，G58N+T106N，G58N+K109N，G58N+G124N，G58N+K143N+N145T，G58N+A175T，G58N+I205T，G58N+V253N，G58N+T267N+S269T，G58N+S314N+K316T，G58N+R315N+V317T，G58N+K316N+G318T，G58N+G318N，G58N+D334N，T106N+K109N，T106N+G124N，T106N+K143N+N145T，T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，T106N+S314N+K316T，T106N+R315N+V317T，T106N+K316N+G318T，T106N+G318N，T106N+D334N，K109N+G124N，K109N+K143N+N145T，K109N+A175T，K109N+I205T，K109N+V253N，K109N+T267N+S269T，K109N+S314N+K316T，K109N+R315N+V317T，K109N+K316N+G318T，K109N+G318N，K109N+D334N，G124N+K143N+N145T，G124N+A175T，G124N+I205T，G124N+V253N，G124N+T267N+S269T，G124N+S314N+K316T，G124N+R315N+V317T，G124N+K316N+G318T，G124N+G318N，G124N+D334N，K143N+N145T+A175T，K143N+N145T+1205T，K143N+N145T+V253N，K143N+N145T+T267N+S269T，K143N+N145T+S314N+K316T，K143N+N145T+R315N+V317T，K143N+N145T+K316N+G318T，K143N+N145T+G318N，K143N+N145T+D334N，A175T+1205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，A175T+S314N+K316T，A175T+R315N+V317T，A175T+K316N+G318T，A175T+G318N，A175T+D334N，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T，I205T+S314N+K316T，I205T+R315N+V317T，I205T+K316N+G318T，I205T+G318N，I205T+D334N，V253N+T267N+S269T，V253N+S314N+K316T，V253N+R315N+V317T，V253N+K316N+G318T，V253N+G318N，V253N+D334N，T267N+S269T+S314N+K316T，T267N+S269T+R315N+V317T，T267N+S269T+K316N+G318T，T267N+S269T+G318N，T267N+S269T+D334N，S314N+K316T+R315N+V317T，S314N+K316T+G318N，S314N+K316T+D334N，R315N+V317T+K316N+G318T，R315N+V317T+G318N，R315N+V317T+D334N和G318N+D334N。更優選，所述取代選自T106N+A175T，T106N+I205T，T106N+V253N，T106N+T267N+S269T，A175T+I205T，A175T+V253N，A175T+T267N+S269T，I205T+V253N，I205T+T267N+S269T和V253N+T267N+S269T組成的組，更優選選自T106N+I205T，T106N+V253N和I205T+V253N組成的組。
另一實施方案中，三個或更多個(諸如三個)體內N-糖基化位點通過取代導入。產生三個體內N-糖基化位點的優選取代的實例選自I205T+V253N+T267N+S269T和T106N+I205T+V253N組成的組。
如上所述，優選體內N-糖基化位點被導入這樣的位置，其不形成本文所述組織結合位點、活性位點區域或活性位點結合裂隙的脊的一部分。
應理解上述部分中所述的任何修飾可互相結合，還可與位置34和/或36中的上述取代，具體是A34E/L和/或R36E組合，優選與位置10和/或32中的上述取代，具體是P10Q和/或K32E組合。用于導入體內N-糖基化位點的修飾中，優選的修飾包括T106N，I205T和V253N中的一種，兩種或三種，具體是這些修飾中的兩種，即T106N+I205T，與T106N+V253N或I205T+V253N。
因此，本發明一個優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含修飾P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
如上所述，這些修飾的任何一或多種還可與至少一種氨基酸殘基通常是單氨基酸殘基在位置3和4之間的插入組合，其中所插入的殘基優選為疏水氨基酸殘基。最優選所述插入是A3AY。因此，本發明另一優選實施方案中，FVII或FVIIa變體包含選自下組的修飾A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T；A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N；A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N；A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T；A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N；A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N；A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T；A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N；A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
Gla結構域外的其它修飾本發明另一實施方案中，FVII或FVIIa變體除了含有本文以上部分所述的修飾以外，還可含有已知可增加多肽內在活性的突變，例如WO02/22776中所述的那些。
例如，所述變體可包含至少一種位于選自以下位置中的修飾157，158，296，298，305，334，336，337或374。優選的取代的實例包括選自下組的取代V158D，E296D，M298Q，L305V或K337A。更優選，所述取代選自V158D+E296D+M298Q+L305V+K337A，V158D+E296D+M298Q+K337A，V158D+E296D+M298Q+L305V，V158D+E296D+M298Q，M298Q，L305V+K337A，L305V或K337A。
本發明另一實施方案中，FVII或FVIIa變體除了含有本文以上部分所述的修飾以外，還可含有其它突變，諸如Neuenschwander et al，Biochemistry，1995；348701-8707公開的取代K341Q。其它可能的另外的取代包括D196K，D196N，G237L，G237GAA及其組合。
對于FVII和FVIIa變體與非-多肽部分的偶聯的其它詳述見WO01/58935和WO 03/093465，上述文件為對比文件并包含在此作為參考。
制備本發明偶聯的變體的方法通常，本發明偶聯的變體可通過以下方法制備在可誘導所述變體多肽表達的條件下培養合適的宿主細胞，回收所述變體多肽，其中a)所述變體多肽包含至少一個N-或O-糖基化位點，所述宿主細胞是能夠進行體內糖基化的真核宿主細胞，和/或b)所述變體多肽與非-多肽部分在體外偶聯。
與聚合物分子的偶聯與多肽偶聯的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或雜聚物，通常所述分子的分子量范圍約為Da，如約500-20000Da，更優選約為500-15000Da，甚至更優選的范圍約為2-15kDa，如約為3-10kDa。當此處所用術語“約”涉及某一分子量時，術語“約”就表示大約的平均分子量，且反映這樣一個事實，即在一定的聚合物制品中通常有一定的分子量分布。
均聚物的實例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。雜聚物是包含不同的偶聯基團，如羥基基團和氨基基團的聚合物。
合適的聚合物分子的實例包括選自以下的聚合物分子組成的組聚環氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共馬來酸酐，聚苯乙烯共馬來酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它適于降低免疫原性和/或增加功能性體內半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物。聚合物分子的另一實例是人白蛋白或另一種豐富的(abundant)血漿蛋白。一般來說，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、無毒的、無抗原性的、無免疫原性的，具有各種水溶性特性并易于從活的生物中排出。
PEG是優選的聚合物分子，因為其與例如多糖諸如葡聚糖相比僅僅具有極少量能夠交聯的反應性基團。具體地，感興趣的是單功能PEG，如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因為其偶聯的化學相對簡單(僅僅一個反應基團可用于與多肽上的連接基團偶聯)。因此，交聯的危險被消除，所得偶聯的變體更均一，并且聚合物分子與變體多肽的反應更易于控制。
為了使聚合物分子與變體多肽共價結合，聚合物分子的羥基末端基團必須為活化的形式，即具有反應性功能基團(其實例包括伯胺基團、酰肼(HZ)、巰基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰亞胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。適當活化的聚合物分子可購得，例如可得自Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
用于本發明的活化的線性和分支的聚合物分子的具體實例在NektarMolecule Engineering Catalog 2003(Nektar Therapeutics)中描述，其包含在本文作為參考。
活化的PEG聚合物的具體實例包括下列線性PEGNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，和支鏈PEG如PEG2-NHS和US 5,932,462和US 5,643,575中所公開的那些，將兩篇參考文獻包含在本文供參考。公開了有用的聚合物分子，PEG化化學以及偶聯方法的其它公開出版物在WO 01/58935和WO 03/093465中列出。
尤其優選用于與半胱胺酸殘基偶聯的活化的PEG聚合物的具體實例，包括以下線性PEG乙烯基砜-PEG(VS-PEG)，優選乙烯基砜-mPEG(VS-mPEG)；馬來酰亞胺-PEG(MAL-PEG)，優選馬來酰亞胺-mPEG(MAL-mPEG)和正吡啶基(orthopyridyl)-二硫-PEG(OPSS-PEG)，優選直吡啶基-二硫-mPEG(OPSS-mPEG)。通常，所述PEG或mPEG聚合物的大小約5kDa，約10kD，約12kDa或約20kDa。
本領域技術人員技術人員會知道根據所述變體多肽的連接基團(以上已給出實例)以及聚合物的功能基團(例如，是氨基、羥基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亞胺，馬來酰亞胺，乙烯砜(vinysulfone)或鹵代乙酸基團)來使用激活方法和/或偶聯化學。PEG化可以與變體多肽上的所有可利用的基團(即，暴露于多肽表面的連接基團)偶聯，或可以與一個或多個特定的連接基團如，N-末端氨基(如US5985265描述的)或與半胱氨酸殘基偶聯。而且，偶聯可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)來完成。
為對半胱胺酸殘基PEG化(見上文)，通常在PEG化前用還原劑諸如二硫蘇糖醇處理FVII或FVIIa變體。所述還原劑隨后通過常規方法去除，諸如通過脫鹽。PEG與半胱胺酸殘基的偶聯通常在適宜緩沖液中、pH6-9、4℃-25℃進行達16小時的時間。
將理解PEG化被設計為使得產生就連接的PEG分子數目、所述分子的大小和形式(例如它們是否是線性或支化的)以及所述變體多肽中的連接位點而言最佳的分子。將要使用的聚合物的分子量可根據待實現的所需效果來選擇。
對于與蛋白質上的僅僅單個連接基團(例如N-末端氨基基團)的偶聯，優選所述聚合物分子，其可為線性或支化的，具有高分子量，優選約10-25kDa，諸如約15-25kDa，例如約20kDa。
通常，聚合物偶聯在目的在于使盡可能多的可得聚合物連接基團與聚合物分子反應的條件下進行。這通過使得所述聚合物的摩爾數相對于多肽的摩爾數有適宜的過量來實現。通常，活化的聚合物分子與多肽的摩爾比達約1000-1，諸如達約200-1，或達約100-1。然而一些情況中，所述比例可更低，諸如達約50-1，10-1，5-1，2-1或1-1以獲得最佳反應。
還涉及根據本發明通過接頭偶聯聚合物分子與多肽。適宜接頭是本領域技術人員已知的；也見WO 01/58935。
偶聯后，殘余的活化的聚合物分子根據本領域已知的方法封閉，例如通過將伯胺加入反應混合物，并且通過適宜的方法去除產生的失活的聚合物分子。
將理解根據情況，例如變體多肽的氨基酸序列，所用活化的PEG化合物的性質以及具體的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比，可獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通常利用較高的PEG與變體多肽的比例獲得。然而，得自任何給定的PEG化方法的PEG化的變體多肽將通常包含PEG化程度稍有不同的的偶聯的多肽變體的隨機分布。
與糖組分的偶聯為了實現包含一個或多個糖基化位點的FVII分子的體內糖基化，編碼該變體多肽的核苷酸序列必須被插入到糖基化型真核表達宿主中。表達宿主細胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲、或動物細胞，或選自轉基因植物細胞。在一個實施方案中，所述宿主細胞是哺乳動物細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞或HEK細胞，如HEK293細胞，或昆蟲細胞，如SF9細胞，或者酵母細胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或任何下文進一步描述的宿主細胞。
糖部分(諸如葡聚糖)與所述變體多肽的氨基酸殘基的體外共價偶聯可如例如WO 87/05330和Aplin et al.，CRC Crit Rev.Biochem，pp.259-306，1981中所述進行。也參見WO 03/093465中關于FVII或FVIIa的變體的體外糖基化的其它信息。
絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接可根據WO 96/12800中所述方法進行。
制備本發明的多肽變體的方法本發明的多肽變體，可選為糖基化的形式，可通過本領域已知的任何適宜方法制備。所述方法包括構建編碼所述變體多肽的核苷酸序列并在適宜的經轉化或轉染的宿主中表達所述序列。優選，所述宿主細胞是gamma-羧化型宿主細胞諸如哺乳動物細胞。然而，盡管效率較低，多肽本發明的變體可通過化學合成或化學合成的組合或化學合成與重組DNA技術的組合來制備。
編碼本發明多肽的核苷酸序列可通過以下方法構建分離并合成編碼親本FVII，諸如具有氨基酸序列SEQ ID NO1的hFVII的核苷酸序列，然后改變所述核苷酸序列使得實現相關氨基酸殘基的導入(即插入或取代)或去除(即刪除或取代)。
根據常規方法通過定點誘變方便地修飾核苷酸序列。可選通過化學合成例如通過利用寡核苷酸合成物制備核苷酸序列，其中寡核苷酸基于所需多肽的氨基酸序列設計，并優選選擇在產生重組多肽的宿主細胞中有利的那些密碼子。例如數種編碼部分所需多肽的小寡核苷酸可通過PCR(聚合酶鏈反應)、接合或接合鏈反應(LCR)(Barany，Proc Natl Acad Sci USA88189-193，1991)合成并集合。單獨的寡核苷酸通常含有5’和3’突出端用于互補集合。
一旦集合(通過合成，定點誘變或其它方法)，編碼所述多肽的核苷酸序列被插入重組載體并可操作連接于在所需的經轉化的宿主細胞中表達FVII所需的控制序列。
本領域技術人員將能夠選擇適宜載體，表達控制序列以及宿主用于表達所述多肽。所述重組載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體復制，例如質粒。另外，導入宿主細胞時，該載體可整合到宿主細胞基因組中并且與其整合到其中的染色體一起復制。
所述載體優選是表達載體，其中編碼本發明多肽變體的核苷酸序列可操作地連接于核苷酸序列轉錄所需的另外的片段。所述載體通常來源于質粒或病毒DNA。許多用于在本文所述宿主細胞中表達的表達載體是可商購的或在文獻中描述。用于表達FVII的適宜載體的詳細信息見WO 01/58935，包含在本文作為參考。
術語“控制序列”在本文中包括對本發明多肽表達必需的或有利的所有成分。每個控制序列對編碼該多肽變體的核苷酸序列來說可以是天然的或外來的。這些控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、增強子或上游活化序列、信號肽序列和轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子。
本發明可以使用各種各樣的表達控制序列，例如WO 01/58935公開的任何控制序列所述文獻包含在本文作為參考。
本發明編碼多肽變體的核苷酸序列，無論是通過定點誘變、合成、PCR或其他方法制備的，可選擇地包括編碼信號肽的核苷酸序列。如多肽變體需要從表達它的細胞中分泌則需要信號肽。這種信號肽，如果存在，應該能被選擇用于表達所述多肽的細胞識別。該信號肽可與所述多肽同源(如，通常與hFVII相連)或異源(如其起源于不是hFVII的其它來源)，或者可以與宿主細胞同源或異源，即通常所述信號肽是自該宿主細胞表達的信號肽或者通常其不是自該宿主細胞表達的信號肽。
可以使用任何合適的宿主產生本發明的多肽變體，包括細菌(但不是特別優選的)、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系，以及轉基因動物或植物。細菌宿主細胞的實例包括革蘭氏陽性細菌諸如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈霉菌屬的菌株，或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌菌株。合適的絲狀真菌宿主細胞的實例包括曲霉屬菌株，如米曲霉、黑曲霉或構巢曲霉，鐮刀菌屬(Fusarium)或木霉菌屬。合適的酵母宿主細胞的實例包括糖酵母屬的菌株，如釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica、漢遜酵母屬，如多形漢遜酵母或Yarrowia。合適昆蟲宿主細胞的實例包括鱗翅目細胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細胞(High Five)(US5077214)。合適的哺乳動物宿主細胞的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細胞(如，NS/O)、倉鼠幼鼠腎臟(BHK)細胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))。另外合適的細胞系在本領域中是已知的并可購自公共的保藏中心如美國典型培養物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)可按US5047335所述方法進行改性來表達唾液酸轉移酶，如，1，6-唾液酸轉移酶，以便改進變體多肽的糖基化。
為了增加分泌，使本發明多肽與內切蛋白酶，具體是PACE(配對的堿性氨基酸轉化酶)(如US5986079中所述)，諸如Kex2內切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起制備是有利的。
用于將外源DNA導入上述細胞類型的方法以及關于FVII變體的表達、制備和純化的其它信息見WO 01/58935，包含在本文作為參考。
本發明的藥物組合物及其用途另一個方面，本發明涉及組合物，具體涉及藥物組合物，其包含本發明的變體多肽以及可藥用的載體或賦形劑。
本發明的多肽變體或藥物組合物可用做藥物。
用于上述改進的性質，本發明的多肽變體，或本發明的藥物組合物尤其可用于治療外傷患者、血小板減少癥患者、抗凝治療的患者以及患有靜脈曲張所致的出血或其它上胃腸道出血的肝硬化患者、接受常位肝移植或肝切除(允許無輸血手術)或血友病患者中的失控出血事件。
外傷定義為外來因素導致的活體組織損傷。它在美國是導致死亡的第四位原因并對經濟造成了較大的財政負擔。
外傷分類為鈍性或穿透性。鈍性外傷導致內部擠壓，器官損傷和內部出血，而穿透性外傷(作為穿透身體并破壞組織，血管和器官的因素的結果)導致外部出血。
外傷可由多種事件導致，例如交通事故，槍傷，跌到，機器事故以及刺傷。
肝硬化可由直接肝損傷，包括長期酗酒，慢性病毒性肝炎(乙型肝炎、丙型肝炎和丁型肝炎)和自身免疫性肝炎，以及由膽道損傷導致的直接損傷，包括原發性膽管硬化，原發性硬化性膽管炎和膽道閉鎖導致。肝硬化較不常見的原因包括遺傳疾病導致的直接肝損傷，諸如囊性纖維化，alpha-1-抗胰蛋白酶缺乏，血色素沉著病，Wilson病，半乳糖血癥以及糖原儲存疾病。移植是治療晚期肝硬化患者的關鍵的介入措施。
因此，本發明另一方面涉及本發明的多肽變體，其用于制備治療需血凝塊形成的疾病或病癥的藥物。本發明另一方面涉及治療患有需要血凝塊形成的疾病或病癥的哺乳動物的方法，包括給予需要的哺乳動物有效量的本發明的多肽變體或藥物組合物。
需要增加的凝塊形成的疾病/病癥的實例包括，但不限于，出血，包括腦出血，以及患有嚴重的失控的出血，諸如外傷的患者。其它實例包括接受活體移植的患者，接受切除的患者以及患有靜脈曲張所致的出血的患者。本發明的多肽可用于增加其中的血凝塊形成的其它廣泛的疾病/病癥是血友病，例如yon Willebrand病，血友病A，血友病B或血友病C。
以治療有效劑量給予本發明的多肽變體，所述劑量大約與用rFVII如NovoSeven治療所采用的劑量相同或更高。本文中“治療有效劑量”是指對所治疾病狀態足以產生預期效果的劑量。給藥的準確劑量取決于具體情況，可通過本領域技術人員通過公知的方法加以確定。一般來說，所述劑量應當能夠防止或減小被治療疾病或癥狀的嚴重性或擴散。對本領域技術人員顯而易見的是本發明多肽變體或組合物的有效量取決于疾病、劑量、給藥時間表、多肽變體或組合物是單獨給藥還是與其它治療劑聯合給藥、組合物的血清半壽期和患者的總體健康狀況。
本發明的多肽變體優選以組合物形式給藥，其中包括可藥用載體或賦形劑。“可藥用”意指在給藥的患者中不引起任何不利作用的載體或賦形劑。這些可藥用載體和賦形劑在本領域中是公知的(參見，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
本發明的多肽變體可以“原形(as is)”使用和/或以其鹽的形式使用。合適的鹽包括但不限于與堿金屬或堿土金屬如鈉、鉀、鈣和鎂形成的鹽，以及如鋅鹽。這些鹽或復合物可作為晶體和/或無定形結構存在。
本發明的藥物組合物可單獨給予也可以與其他治療制劑聯合給予。這些制劑可以作為同一藥物組合物中的一個組成部分給予，或者與本發明多肽變體同時或依照一定的治療時間表分別給予。此外，本發明的多肽變體或藥物組合物可用做其他治療的佐劑。
本發明中“患者”包括人和其他哺乳動物。因此所述方法醫用獸用均可。
本發明多肽變體的藥物組合物可以多種形式配置，如以液體，凝膠，凍干的或壓制的固體形式。優選的形式根據治療的具體需要而異，這對于本領域技術人員是顯而易見的。
尤其，本發明多肽變體的藥物組合物以凍干的形式或穩定溶液形式配制。所述多肽變體可通過多種公知方法凍干。多肽變體可通過將本文所述蛋白酶解位點去除或掩蓋，制備成穩定的溶液形式。獲得穩定溶液的優點在于更便于患者使用，而且在緊急情況時，作用更快，這可能可以救生。優選的形式根據治療的具體需要而異，這對于本領域技術人員是明顯的。
本發明制劑可以多種方式給藥，包括但不限于，口服、經皮下、靜脈內、小腦內、鼻內、真皮內、腹腔內、肌肉內、肺內、經陰道、經直腸、眼內或以任何其它適宜的方式。制劑可連續灌注給予，盡管大藥丸注射(bolus injection)是可接受的，但需利用本領域公知技術，如泵或植入。一些情況下所述制劑可以溶液或噴霧直接給予。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的優選實例是設計成非腸道給藥的溶液。盡管在很多情況下，藥物溶液制劑可以以適用于立即使用的液體形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者的情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩定性，正如本領域技術人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應物更穩定。所述凍干制劑在使用前通過加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。
在非胃腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，這通過將具有所需純度的多肽與一種或多種本領域常用的可藥用載體、賦形劑或穩定劑(統稱為“賦形劑”)進行適當混合來制備，所述可藥用載體、賦形劑或穩定劑如緩沖劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑或去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑諸如膨脹劑或填充劑，鰲合劑，抗氧化劑和助溶劑。
有關適于給藥FVII變體的胃腸外制劑以及持續釋放的制劑的詳細信息見WO 01/58935和WO 03/093465，所述文獻包含在本文中作為參考。
本發明還通過以下非限制性實施例描述。
材料和方法活性位點區活性位點區定義為任何這樣的殘基，所述殘基在催化三聯體(殘基H193，D242，S344)內任何原子的10距離內具有至少一個原子。
對蛋白酶解降低的敏感性的檢測蛋白酶解可通過US5580560的實施例5中說明的方法檢測，其中所述蛋白水解是自主蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性標記的樣品在體內模型中進行檢測，通過取血樣，并對這些血樣進行SDS-PAGE和放射自顯影來對比rhFVIIa和本發明多肽變體的蛋白酶解作用。
無論使用何種分析確定蛋白酶解，“降低的蛋白酶解”是指與利用rhFVIIa獲得的裂解相比，裂解的明顯降低，這是通過對考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE凝膠的凝膠掃描、HPLC來測定的，或利用下述組織因子非依賴性活性測定發通過相對于野生型的保守的催化活性來測定的。
對多肽變體的分子量的確定多肽變體的分子量是通過SDS-PAGE、凝膠過濾、Western印跡、基質輔助的激光解吸(matrix assisted laser deserption)、質譜分析或平衡離心，如SDS-PAGE根據Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)所述測定的。
測定磷脂膜結合親和力磷脂膜結合親和力如Nelsestuen et al.，Biochemistry，1977；30；10819-10824或US 6,017,882的實施例1所述測定。
TF-非依賴性因子X活化測定法該測定法在Nelsestuen et al.，J Biol Chem，2001；27639825-39831的第39826頁中描述。
簡而言之，待側定的分子(hFVIIa，rhFVIIa或活化的形式的本發明的多肽變體)與磷脂來源(優選磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸比例為8∶2)以及再脂化的(relipidated)因子X在含有BSA的Tris緩沖液中混合。保溫規定的時間后，反應通過加入過量EDTA終止。因子Xa的濃度隨后通過在加入生色原底物(S-2222，Chromogenix)之后于405nm的吸光度改變來測定。相對于背景校正以后，rhFVIIa(awt)的組織因子非依賴性活性作為10分鐘后的吸光度改變來測定，本發明的多肽變體(a變體)的組織因子非依賴性活性作為10分鐘后的吸光度改變來測定。活化的形式的多肽變體的活性與rhFVIIa的活性的比例定義為a變體/awt。
凝血測定法FVIIa及其變體的凝固活性在一階段測定法中測定，凝固時間記錄在Thrombotrack IV凝血計(Medinor)上。溶解因子VII-耗盡的人血漿(AmericanDiagnostica)并在室溫平衡15-20分鐘。隨后將50微升血漿轉移到血凝計杯中。
FVIIa及其變體在Glyoxaline緩沖液(5.7mM巴比妥酸鹽，4.3mM檸檬酸鈉，117mM NaCl，1mg/ml BSA，pH 7.35)中稀釋。將50μl樣品加入血凝計杯中并在37℃保溫2分鐘。
促凝血酶原激酶(Medinor)用水溶解，并加入CaCl2至終濃度4.5mM。通過加入100μl促凝血酶原激酶啟動反應。
為測定缺乏TF時的凝固活性，使用相同測定法而不加入促凝血酶原激酶。數據利用PRISM軟件分析。
全血測定法FVIIa及其變體的凝固活性在一階段測定法中測定，凝固時間記錄在Thrombotrack IV凝血計(Medinor)上。100μl FVIIa或其變體在含有10mMglycylglycine，50mM NaCl，37.5mM CaCl2，pH 7.35的緩沖液中稀釋并轉移到反應杯。凝血反應通過加入含有10％ 0.13M檸檬酸三鈉作為抗凝劑的50μl血液啟動。數據利用Excel或PRISM軟件分析。
解酰按測定法變體切割小肽底物的能力利用生色原底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide)測定。在測定緩沖液(50mM Na-Hepes pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl2，0.1％BSA，1U/ml肝素)中將FVIIa稀釋到約10-90nM。此外，可溶性TF(sTF)在測定緩沖液中稀釋到50-450nM。120μl測定緩沖液與20μl FVIIa樣品以及20μl sTF混合。輕柔震搖下在室溫保溫5分鐘，然后在37℃保溫10分鐘以后，所述反應通過加入S-2288底物到1mM啟動，并在數個時間點測定405nm的吸光度。
ELISA測定法FVII/FVIIa(或變體)濃度通過ELISA測定。微量滴定板的孔用針對蛋白酶結構域的抗體、利用2μg/ml的PBS溶液(100μl每孔)包被。在R.T.(室溫)包被過夜后，用THT緩沖液(100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.20.05％Tween-20)洗滌孔四次。隨后，每孔加入200μl 1％酪蛋白(利用100mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 7.2，通過稀釋2.5％母液制備)進行封閉。在R.T.保溫1hr以后，倒空孔，加入100μl樣品(可選在稀釋緩沖液(THT+0.1％酪蛋白)中稀釋)。再在室溫保溫1hr以后，用THT緩沖液洗滌孔四次，并加入100μl針對EGF-樣結構域(1μg/ml)的生物素標記的抗體。再在R.T.保溫1小時，然后用THT緩沖液再洗滌4次，加入100μl鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶(DAKO A/S，Glostrup，Denmark，1/10000稀釋)。再在R.T.保溫1小時，然后用THT緩沖液再洗滌4次，加入100μl TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine)，Kem-en-Tech A/S，Denmark)。在R.T.、暗處保溫30分鐘，加入100μl 1M H2SO4并測定OD450nm。利用rhFVIIa(NovoSeven)制備標準曲線。
可選，FVII/FVIIa或變體可通過Gla結構域而不是通過蛋白酶結構域定量。在該ELISA模式中，用抗EGF樣結構域抗體包被孔過夜，并且為檢測，使用鈣依賴性單克隆抗Gla結構域抗體(2μg/ml，100μl每孔)。在該步中，將5mM CaCl2加入THT和稀釋緩沖液。
凝血圖測定法hFVIIa，rhFVIIa或FVIIa變體對人血漿凝血酶生成的影響在Hemker etal.(2000)Thromb Haemost 83589-91中589頁所述的改良版本的測定法中檢測。簡而言之，待測定的分子(either hFVIIa，rhFVIIa或變體)與含有再脂化的組織因子(諸如Dade Behring的Innovin)或磷脂(比例為8∶2的磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，或比例為4∶2∶4的磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸與磷脂酰乙醇胺)的FVII-耗盡的血小板貧乏血漿(PPP)混合。
反應通過加入產熒光凝血酶底物和氯化鈣啟動。連續測定熒光，凝血酶解酰胺活性通過計算熒光曲線的斜率(熒光隨時間的增加)來測定。在這種方法中，獲得達最大凝血酶解酰胺活性的時間(Tmax)，以及凝血酶生成速率(凝血酶活性的最大增加)，并可計算總凝血酶功(曲線下面積(AUC))。
冷凍檸檬酸化FVII-耗盡的血漿在谷物胰蛋白酶抑制劑(100μg/ml血清)存在以抑制凝血接觸途徑的條件下解凍。向96孔板的每個孔中加入80μl血漿和20μl含有終濃度0.1-100nM的受試rhFVII或變體的緩沖液。將重組人組織因子(rTF)加入5μl測定緩沖液至終濃度1pM。測定緩沖液為含有20mMHepes，150mM NaCl和60mg/ml BSA的蒸餾水溶液。所述反應通過加入含有0.1M氯化鈣的20μl底物溶液啟動。所述測定板和試劑預加熱到37℃，反應在此溫度進行。所用熒光計是BMG Fluormeter，其具有390nm的激發濾波器和460nm的發射濾波器。以20-40秒的間隔在30-180分鐘內測定96孔凈底板(96-well clear bottom plates)的每個孔中的熒光。數據利用PRISM軟件分析。
組織因子結合表面胞質團共振測定法(Biacore測定法)
表面胞質團共振分析用于測定野生型因子VIIa及其變體與可溶性組織因子的相對結合。含有細胞外結構域的重組可溶性組織因子通過NHS/EDC偶聯而偶聯于Biacore CM5芯片上的270反應單元。可溶性組織因子在pH4.5偶聯以使得能與芯片表面反應。
在該測定法中，因子VII蛋白的組織因子結合在單個FVIIa或變體濃度下，比較以允許所述變體與野生型的相對比較。該濃度通過在芯片上流動的、濃度75和0μg/ml的野生型FVIIa的標準曲線來測定。加入10mMEDTA去除FVIIa。通過這種方式測定濃度15μg/ml產生線性范圍內的結合。FVIIa變體隨后以15μg/ml在芯片上流動以測定FVIIa或變體與組織因子的相對結合強度。
實施例實施例1將Banner et al.，J Mol Biol，1996；2852089的與可溶性組織因子復合的hFVIIa的X光結構用于該實施例。關于該實施例中計算的其它信息見WO 01/58935。
表面暴露進行分級ASA計算，確定以下殘基有超過25％的側鏈暴露于其表面A1，N2，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F24，E25，E26，R28，E29，F31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，SI03，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F275，V276，R277，F278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406(A1-S45位于Gla結構域內，其余位置位于Gla結構域外)。
確定以下殘基有超過50％的側鏈暴露于其表面A1，A3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35，R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119，L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F275，R277，F278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406(A1-S43位于Gla結構域內，其余位置位于Gla結構域外)。
組織因子結合位點通過ASA計算，FVII中的以下殘基在復合物中改變其ASA。這些殘基被定義為組成受體結合位點的殘基L13，K18，F31，E35，R36，L39，F40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F71，C72，L73，P74，F76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F275，V276，R277，F278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位點區活性位點區是具有至少一個與催化三聯體(殘基H193，D242，S344)中任何原子的間距在10范圍內的原子的任何殘基I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位點結合槽的脊活性位點結合槽的脊通過對FVIIa結構1FAK.pdb的目測觀察定義為N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
實施例2設計用于在哺乳動物細胞中表達人凝血因子VII的表達盒用于表達rhFVII的表達盒的設計和克隆見WO 01/58935的實施例2。
實施例3構建編碼本發明變體的表達盒序列突出端延伸(SOE)PCR用于通過標準方法產生構建體，其具有變體FVII開放讀框，其中含有取代的密碼子。
實施例4在CHO K1細胞中表達多肽變體在T-25培養瓶中接種50％滿底的細胞系CHO K1(ATCC#CCL-61)，該培養瓶含有MEMα，10％FCS(Gibco/BRL Cat#10091)，P/S和5μg/ml植醌，使細胞生長直到滿底。滿底的單層細胞用5μg上述相關質粒，以Lipofectamine 2000為轉染試劑(Life technologies)，按照生產商的方法進行轉染。轉染后24小時對培養液取樣，并利用利用識別hFVII的EGF1結構域的ELISA定量。在此時間點，可對細胞進行相關選擇(例如潮霉素B)以產生穩定轉染體的集合。使用CHO K1細胞并用潮霉素B抗性基因作為質粒上的選擇標記的情況下，通常在1周之內完成。
實施例5制備穩定表達多肽變體的CHO K1細胞將一小瓶CHO-K1轉染子集落解凍，并將細胞接種于含25ml MEMα，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100U/l青霉素，100μg/l鏈霉素的175cm2組織培養瓶中，生長24小時。收集細胞，將其稀釋并以-1個細胞/孔的密度鋪96孔微滴定平板。生長一周后，約20-100個細胞的集落出現于孔中，將僅包含一個集落的那些孔進行標記。再生長2周后，用200μl新鮮培養基替換含有僅一個集落的所有孔中的培養基。24小時后，取出培養基樣品并通過例如ELISA分析。選出高產量克隆并用于大規模制備FVII或變體。
實施例6多肽變體的純化和隨后的活化FVII和FVII變體如下純化所述方法在4℃進行。從大規模生產收獲的培養基利用具有30kDa截留Pellicon膜的Millipore TFF系統超濾。濃縮所述培養基以后，加入檸檬酸鹽至5mM，調節pH到8.6。如果有必要，降低傳導率至10mS/cm。隨后將所述樣品上樣于Q-sepharose FF柱，所述柱用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6平衡。用100mM NaCl，10mM Tris pH 8.6，然后用150mM NaCl，10mM Tris pH 8.6洗滌后，用10mM Tris，25mM NaCl，35mM CaCl2，pH 8.6洗脫FVII。
對于第二個層析步驟，通過將單克隆鈣依賴性抗Gla結構域抗體與CNBr活化的SepharoseFF偶聯來制備親和柱。約5.5mg抗體偶聯于每ml樹脂。該柱用10mM Tris，100mM NaCl，35mM CaCl2，pH 7.5平衡。將NaCl加入樣品至濃度100mM NaCl，pH調節到7.4-7.6。樣品的O/N應用后，用100mM NaCl，35mM CaCl2，10mM Tris pH 7.5洗柱，用100mM NaCl，50mM檸檬酸鹽，75mM Tris pH 7.5洗脫FVII蛋白。
對于第三次層析，如必要，使樣品的導電率降低到低于10mS/cm，pH調節到8.6。隨后以密度約3-5mg蛋白每ml凝膠將樣品加于Q-sepharose柱(用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6平衡)以獲得有效的活化。應用后，用50mM NaCl，10mM Tris pH 8.6洗柱約4小時，流率為3-4柱體積(cv)每小時。FVII蛋白利用0-100％ 500mM NaCl，10mM Tris pH 8.6的梯度在40cv洗脫。匯集含有FVII的級分。
對于最后的層析步驟，導電率降低到低于10mS/cm。隨后，將樣品以濃度3-5mg蛋白每ml凝膠加于Q-sepharose柱(用140mM NaCl，10mMglycylglycine pH 8.6洗滌)。所述柱隨后用140mM NaCl，10mM glycylglycinepH 8.6洗滌，FVII用140mM NaCl，15mM CaCl2，10mM glycylglycine pH 8.6洗脫。洗脫物稀釋到10mM CaCl2，pH調節到6.8-7.2。最后，加入Tween-80至0.01％，調節pH至5.5，儲存在-80℃。
實施例7試驗結果-FX活化活性對本發明的變體進行“TF-非依賴性因子X活化測定法”，得到以下結果(所述結果表示為參比P10Q+K32E變體的活性的百分比)

表1如上述結果所示，本發明的變體顯示與rhFVIIa以及[P10Q+K32E]rhFVIIa相比，其FX活化活性有實質的改善。
實施例8試驗結果-“全血測定法”中的凝固活性對本發明的變體進行“全血測定法”顯示，它們與rhFVIIa以及[P10Q+K32E]rhFVIIa相比顯示明顯增加的凝固活性(即降低的凝固時間)。試驗結果顯示在圖1以及下表2中。

表2實施例9試驗結果-“凝血測定法”中的凝固活性當在TF依賴性凝血測定法(上文材料和方法部分所述的“凝血測定法”)中檢測時，很明顯地，具有R36E取代的本發明變體的凝固活性與rhFVII或本發明的其它變體相比明顯降低。見下表3。然而，如上文實施例7所述，具有取代R36E的變體在“TF-非依賴性因子X活化測定法”中具有明顯降低的凝固活性。


表3實施例10試驗結果-凝血圖測定法中的凝血酶生成利用磷脂(PL)-依賴性和組織因子(TF)-依賴性凝血圖(將上文凝血圖測定法中的描述)，在不同變體蛋白濃度下測定FVIIa變體的最大凝血酶生成速率。通過對最大凝血酶生成速率(表示為FU(熒光單位)每秒2)作為以pM表示的變體濃度的函數繪圖，獲得顯示在圖2中(最大組織因子-依賴性凝血酶生成速率)和圖3(最大磷脂-依賴性凝血酶生成速率)中的結果。
從這些結果明顯可見，根據所述反應為PL依賴性或TF依賴性的，FVIIa變體P10Q K32E A34E R36E具有不同的凝血酶生成能力。該變體的最大TF-依賴性凝血酶生成速率與FVIIa變體P10Q K32E或A3AY P10Q K32EA34L相比降低大約10倍(圖2中的點線)。P10Q K32E A34E R36E的滯后時間，達峰時間，峰高度和(較小程度上)AUC與其它變體(結果為顯示)相比降低。與TF依賴的活性相反，P10Q K32E A34E R36E變體的PL依賴的活性等同于實施例中所檢測的其它變體的所述活性(見圖3)，即，該變體即使在TF依賴的活性基本上降低的情況下也具有完全的PL活性。
在相同試驗中，將變體P10Q K32E A34E R36E與變體P10Q K32EA34E P74S直接比較，后者具有圖2所示的高TF-依賴性凝血酶生成速率。這兩種變體的TF-結合的差異(即變體P10Q K32E A34E R36E的降低的TF-結合)據信是由于R36E取代的存在直接導致的，其可能與A34E取代協同作用。
實施例11試驗結果-Biacore測定法中FVIIa與組織因子的結合利用TF芯片，在Biacore系統上，如材料和方法部分所述，通過表面胞質團共振對本發明的變體進行檢測，得到以下結果

表4*n＝2與來自凝血圖測定法(實施例10)的TF-依賴性凝血酶生成速率數據一致，表4中的結果表明R36E取代與組織因子的結合較弱。
在相同的測定法中，也檢測具有與表4所示變體相同的修飾以及另外兩種導入兩個糖基化位點的修飾(T106N和V253N或I205T)的FVIIa變體，與組織因子的結合。結果顯示在下表5中。

表5
這些結果與表4的一致并顯示與表4中沒有其它糖基化位點的相同的變體(或野生型)相比，表5的變體中兩種新糖基化位點的存在使得組織因子結合(進一步)減弱。與表4的變體的情況一樣，糖基化變體中T36E取代的存在也導致組織因子結合水平基本上低于沒有所述取代的其它糖基化變體的組織因子結合。
序列表<110>Maxygen ApS馬克西根控股公司(Maxygen Holdings Ltd.)Haaning，Jesper MortensenAndersen，Kim VilbourBorns，Claus<120>因子FVII或FVIIa的Gla結構域變體<130>0274wo310<150>US 60/479,780<151>2003-06-19<150>DK PA 2004 00930<151>2004-06-15<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>406<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu1 5 10 15Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys20 25 30Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln50 55 60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65 70 75 80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly85 90 95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys100 105 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr115 120 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg130 135 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln165 170 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala180 185 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu195 200 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg210 215 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225 230 235 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp245 250 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr260 265 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu275 280 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg290 295 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305 310 315 320Pro Ash Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser325 330 335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr340 345 350hrg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys355 360 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile370 375 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385 390 395 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro40權利要求
1.因子VII(FVII)或因子VIIa(FVIIa)多肽變體，其具有這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括相對于具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的人因子VII(hFVII)或人因子VIIa(hFVIIa)的1-15個氨基酸的修飾，所述變體包含選自下組的至少一種修飾(a)通過位置34中的取代導入疏水氨基酸殘基，或(b)位置36中的氨基酸取代。
2.權利要求1的變體，其中疏水氨基酸殘基通過位置34中的取代導入。
3.權利要求2的變體，其中所述取代選自A34I，A34L，A34M，A34V，A34F，A34Y和A34W組成的組。
4.權利要求3的變體，其中所述取代選自A34I，A34L和A34V組成的組。
5.權利要求4的變體，其中所述取代是A34L。
6.權利要求2-5之一的變體，還包括位置36中的氨基酸取代。
7.權利要求6的變體，其中帶負電的氨基酸殘基通過位置36中的取代導入。
8.權利要求7的變體，其中所述取代是R36E。
9.權利要求8的變體，包括取代A34L+R36E。
10.權利要求1的變體，其中所述氨基酸序列包含位置36中的氨基酸取代。
11.權利要求10的變體，其中帶負電的氨基酸殘基通過位置36中的取代導入。
12.權利要求11的變體，其中所述取代是R36D。
13.權利要求11的變體，其中所述取代是R36E。
14.權利要求10-13之一的變體，還包括位置34中的氨基酸取代。
15.權利要求14的變體，其中帶負電的氨基酸殘基通過位置34中的取代導入。
16.權利要求15的變體，其中所述取代是A34E。
17.權利要求16的變體，包括取代A34E+R36E。
18.前述任意權利要求的變體，還包括位置10和/或32中的氨基酸取代。
19.權利要求18的變體，包括取代K32E。
20.權利要求18的變體，包括取代P10Q。
21.權利要求18的變體，包括取代P10Q+K32E。
22.權利要求21的變體，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E。
23.權利要求21的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L。
24.權利要求21的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E。
25.前述任一權利要求的變體，其中包括用于非-多肽部分的連接基團的至少一個氨基酸殘基已被導入位于Gla結構域外的位置。
26.權利要求25的變體，其中所述連接基團是體內糖基化位點。
27.權利要求26的變體，其中所述糖基化位點是通過取代導入的體內N-糖基化位點。
28.權利要求27的變體，其中所述體內N-糖基化位點通過選自A51N，G58N，T106N，K109N，G124N，K143N+N145T，A175T，I205S，I205T，V253N，T267N，T267N+S269T，S314N+K316S，S314N+K316T，R315N+V317S，R315N+V317T，K316N+G318S，K316N+G318T，G318N，D334N及其組合所組成的組的取代導入。
29.權利要求28的變體，包括至少一種選自T106N，I205T和V253N組成的組的取代。
30.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
31.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
32.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
33.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T。
34.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N。
35.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N。
36.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
37.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
38.權利要求29的變體，包括取代P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
39.前述任一權利要求的變體，還包括位于位置3和4之間的至少一個氨基酸殘基的插入。
40.權利要求39的變體，包括位于位置3和4之間的一個氨基酸殘基的插入。
41.權利要求39或40的變體，其中疏水氨基酸殘基被插入位置3和4之間。
42.權利要求41的變體，其中所述插入是A3AY。
43.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E。
44.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L。
45.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E。
46.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+I205T。
47.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+T106N+V253N。
48.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34E+R36E+I205T+V253N。
49.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+I205T。
50.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+T106N+V253N。
51.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+I205T+V253N。
52.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+I205T。
53.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+T106N+V253N。
54.權利要求42的變體，包括修飾A3AY+P10Q+K32E+A34L+R36E+I205T+V253N。
55.前述任一權利要求的變體，其中在相對于SEQ ID NO1的位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35中沒有進行修飾。
56.前述任一權利要求的變體，其中所述變體是其活化的形式。
57.前述任一權利要求的變體，其中當在本文所述“TF-非依賴性因子X活化測定法”中測定時，所述變體的活化形式的FX活化活性與rhFVIIa的FX活化活性的比例為至少約5。
58.核苷酸序列，其編碼權利要求1-57之一所定義的變體。
59.表達載體，包含權利要求58的核苷酸序列。
60.宿主細胞，包含權利要求58的核苷酸序列或權利要求59的表達載體。
61.權利要求60的宿主細胞，其中所述宿主細胞是能夠進行體內糖基化的gamma-羧化細胞。
62.組合物，包括權利要求1-57之一的變體以及至少一種可藥用的載體或賦形劑。
63.權利要求1-57之一定義的變體或權利要求62定義的組合物作為藥物的用途。
64.權利要求1-57之一定義的變體在制備用于治療需要凝塊形成的疾病或病癥的藥物中的用途。
65.根據權利要求64的用途，其中所述疾病或病癥選自出血，包括腦出血，嚴重的失控的出血，諸如外傷，接受移植或切除術的患者中的出血，靜脈曲張所致的出血，和血友病組成的組。
66.根據權利要求65的用途，其中所述疾病或病癥是外傷。
67.根據權利要求65的用途，其中所述疾病或病癥是血友病。
68.治療患有需要凝塊形成的疾病或病癥的哺乳動物的方法，包括給藥需要的哺乳動物有效量的權利要求1-57之一定義的變體或權利要求62的組合物。
69.權利要求68的方法，其中所述疾病或病癥選自出血，包括腦出血，嚴重的失控的出血，諸如外傷，接受移植或切除術的患者中的出血，靜脈曲張所致的出血，和血友病組成的組。
70.權利要求69的方法，其中所述疾病或病癥是外傷。
71.權利要求69的方法，其中所述疾病或病癥是血友病。
全文摘要
人因子VII或人因子VIIa的Gla結構域變體，包括相對于人因子VII或人因子VIIa的1－15個氨基酸的修飾，其中通過位置34中的取代導入疏水氨基酸殘基，或具有位置36中的氨基酸取代，或具有位置10和32中的氨基酸取，以及選自位置74、77或116中的至少一種其它氨基酸取代。
文檔編號A61K38/37GK1839203SQ200480023777
公開日2006年9月27日 申請日期2004年6月18日 優先權日2003年6月19日
發明者杰斯珀·M·哈寧, 金·V·安德森, 克勞斯·博尼斯 申請人:馬克西根控股公司