專利名稱：淋巴細胞冷凍保存的方法
技術領域：
本發明涉及一種淋巴細胞分離、保存的方法。
背景技術：
目前的細胞療法，生物療法是用患者現時點的材料，如細胞、組織等，甚至使用他人的材料進行治療。這種方法存在著一些缺點。比如，現時的患者是一個病人，當然其身體狀況會反映到所使用的治療用的材料上。癌癥的患者其細胞有可能對癌細胞的殺傷活性已經很低，病毒感染的患者有可能淋巴細胞已經被侵染，老年病人的機體、組織、細胞都有可能已經出現老化等等。癌癥患者在經過手術治療、或放射線治療、化學治療之后，機體已經是很虛弱，細胞也有可能在數量上、質量上已經受到了嚴重的損傷。如果在用其他的方法治療之后再進行生物治療的準備，又可能需要花去相當多的時間，而延誤治療的時機。利用他人的材料可以解決材料老化、病弱等問題，但是有可能受到材料提供者的疾病的傳染，更有可能出現異體移植而發生的拒絕反應。
如果把人的將來有可能需要的細胞或是組織，在其年輕力壯、細胞或是組織活性最大時加以保存，以供需要之時，通常是年老體弱，罹患疾病之時使用，就可以很好地解決上述問題。

發明內容
為了解決患者，特別是癌癥、免疫學疾病、各種感染癥的患者，在需要細胞治療之時，能夠提供一種健康或較為健康的、有較大活性的治療材料，本技術提供一種方法，將健康人或是病期處于初期的患者，比如癌癥患者手術之前，或放射線療法、化學療法之前，將健康人或患者的細胞取出體外，用適當的方式加以保存，用于將來患者本身疾病的預防或治療。
要解決的技術問題目前尚未有一種從根本上解決上述問題的方法。本技術方案為解決上述問題提供了可能。通過采取健康或是比較健康時志愿者的細胞，采用體外激活、增殖、保存的方法，可以將健康人的細胞保存20年以上的時間。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，用于人的淋巴細胞保存。首先志愿者為細胞保存提出申請，申請者的血液檢查，靜脈采血，自靜脈血中通過密度離心法分離淋巴細胞，淋巴細胞的激活和培養，活性化淋巴細胞的回收，淋巴細胞的冷凍保存，使用時冷凍細胞的解凍復原等過程。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于癌癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于免疫低下癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于各種感染癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于各種過敏癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于先天性免疫不全癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于后天性免疫不全癥的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。用于各種自己免疫性疾病的預防或治療。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自健康人的淋巴細胞。作為各種生物治療的原材料。
本技術提供了一種細胞的保存方法，在優選的技術方案中，其中保存來自手術之前的癌癥病人、或是病情早期病人的細胞，或是其他疾患患者的早期，淋巴細胞較為健康時的細胞。作為治療的原材料。
為證明本發明技術方案的有效性，可按照下列方法進行試驗實施方式1.志愿者簽訂血液細胞保存同意書。同意書中規定志愿者的細胞沒有志愿者的同意不可挪用。
2.對志愿者的血液進行常規檢查。為保證細胞的質量，在細胞分離培養之前要對血液進行常規的檢查。其中包括艾滋病病毒檢查，肝炎病毒的檢查，梅毒檢查，以及其他有可能影響細胞質量及患者健康的項目的檢查。
3.靜脈血液的采取。用加有肝素的注射器，18G的注射針頭，用通常的方法自志愿者靜脈中抽取血液5-100ml。肝素的量根據取血的多少決定。
4.血液的處理。將裝有血液的注射器用酒精消毒之后，置于無菌操作臺中，將血液輕輕注入離心管或適當的容器中。采取的血液用等量的生理鹽水稀釋，混勻后待用。
5.細胞的分離。將比重分離液Ficoll(Lymphosepar I)(d＝1.01-1.10)2-20ml加入離心管中，用移液管吸取上述步驟4稀釋過的血液，輕輕地重層于比重分離液之上。將離心管輕輕放入離心機中，在室溫brake off的狀態下，1000-2000rpm離心5-30分鐘。
6.細胞的回收離心機完全停穩之后，將離心管輕輕地取出，用吸管將上層溶液吸出棄去，或另行保存作細胞培養時的血清用。中間層用吸管輕輕吸出，回收于一新離心管中。
7.細胞的洗凈。往回收的細胞中加入10-40ml生理鹽水，放入離心機中，在室溫brake on的狀態下，1000-2000rpm離心5-30分鐘。上清液棄去后，再加入10-40ml生理鹽水，用臺式混合器混合后，在同樣條件下再離心一次。
8.細胞的調配洗凈后的細胞用含有1-10％的人血清和 U/ml IL-2的RPMI-1640 5-50ml懸浮，備用。
9.培養瓶的準備平底培養瓶中加入用生理鹽水或是PBS(-)溶解的1-40μg/ml的抗CD3抗體1-10ml，4℃-室溫靜置1-24小時。棄去溶液后用生理鹽水或是PBS(-)溶液洗滌3次，備用。
10.細胞的培養將步驟8的細胞溶液移入步驟9處理過的培養瓶中，置于37℃ 5％CO2培養箱中培養1-3天。
11.冷凍保存液的準備將5ml DMSO加入到RPMI-1640 40ml中，在加入人血清1-5ml。
12.保存細胞的調整將步驟10培養后的細胞洗凈后，計數。用步驟11的細胞冷凍保存液將細胞的濃度調整為1×107-1×108，移入試管中保存。每試驗管中保存1-10ml細胞液。
13.細胞的保存將盛有細胞的試管置于程控保溫杯中，放入4℃冰箱，1-12小時后，轉入-80℃冰箱，4-24小時后，放入液氮保存。
14.細胞的解凍在需要時，將冷凍保存的細胞從液氮中取出，置于37℃水浴鍋中使之快速解凍。解凍后的細胞用RPMI-1640洗滌兩次之后，加入所需要的培養液中培養。
有益效果本技術可以為健康人的將來提供一個治療多種疾病的選擇，或是為病程初期的患者保留一些比較健康且安全的治療材料。
權利要求
1.一種血液細胞的保存方法，涉及將人的淋巴細胞進行保存。其內容包括志愿者為細胞保存提出申請，申請者的血液檢查，靜脈采血，自靜脈血中通過密度離心法分離淋巴細胞，淋巴細胞的激活和培養，活性化淋巴細胞的回收，淋巴細胞的冷凍保存，使用時冷凍細胞的解凍復原等過程。
2.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療癌癥。
3.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療各種免疫低下癥。
4.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療各種感染癥。
5.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療各種過敏癥。
6.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療各種先天性免疫不全癥。
7.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療后天性免疫不全癥。
8.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于預防或是治療各種自己免疫性疾病。
9.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存健康人的淋巴細胞，用于作為各種生物治療的原材料。
10.權利要求1所述的血液細胞的保存方法，保存癌癥病人手術之前、或是病情早期的細胞，或是其他疾患的患者的早期，淋巴細胞較為健康時的細胞，用于作為治療疾病的原材料。
全文摘要
一種細胞分離、保存的方法，是將健康或較為健康的、有較大活性的細胞取出體外，進行分離、激活、增殖，然后冷凍保存或不進行冷凍保存，以期在需要的時候，提供一個有效的、且安全可靠的、疾病預防或治療的材料。其內容包括志愿者為細胞保存提出申請，申請者的血液檢查，靜脈采血，通過密度離心法自靜脈血中分離淋巴細胞，淋巴細胞的激活和培養，活性化淋巴細胞的回收，淋巴細胞的冷凍保存，使用時冷凍細胞的解凍復原等過程。
文檔編號A61K35/12GK1715400SQ20041006223
公開日2006年1月4日 申請日期2004年7月1日 優先權日2004年7月1日
發明者宋清華 申請人:宋清華