專利名稱：應用il－21治療過敏性癥狀的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過IL-21的施用控制、治療和預防過敏性反應、過敏性疾病和過敏性癥狀。進一步地，本發明涉及通過對感染了寄生蟲的受試者施用IL-21治療寄生蟲病。
背景技術：
IL-21(也稱Zalpha11)是一種細胞因子，已被證明在抗-CD3、佛波酯加上離子霉素的刺激后，由活化的CD4+T淋巴細胞生成(Parrish-Novak等，自然408，57-63(2000))。
許多研究表明，嗜酸性粒細胞在哮喘和其它過敏性疾病的發展過程中起重要作用(綜述見于Foster等，TRENDS in Molecular Medicine(分子醫學趨勢)8，162-167(2002))。嗜酸性粒細胞在骨髓中響應IL-5和eotaxin由干細胞產生(‘eosinopoiesis’)，嗜酸性粒細胞經血液遷移至肺，并在此被活化。這樣的活化的嗜酸性粒細胞釋放促炎分子和顆粒狀蛋白，它們可損傷肺組織并導致呼吸道過激反應。普遍認為，所謂的T2輔助淋巴細胞(‘TH2’)在肺中通過釋放TH2細胞因子(即IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13)協調大部分細胞反應。據此觀點，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞只是作用為效應細胞(綜述見于Wills-Karp等，Annu.Rev.Immunol.17，255(1999))。令人驚訝的是，我們現已發現，IL-21由人嗜酸性的顆粒細胞(下文稱‘嗜酸性粒細胞’)生成、貯存并釋放。已證明IL-21作用為T和B淋巴細胞增殖的共刺激細胞因子。因此，嗜酸性粒細胞除了它們作為原始效應細胞的損傷呼吸上皮作用，也通過釋放IL-21起另一種保護性的作用，而這點尚未被意識到。從嗜酸性粒細胞釋放的IL-21(下文稱‘嗜酸性粒細胞的IL-21’)反過來可直接或是與其它細胞因子相呼應，防止與過敏性反應有關的細胞分化和活化，因此有助于減少過敏性反應的嚴重性。根據此觀點，嗜酸性粒細胞在過敏性反應方面起雙重作用。一方面，嗜酸性粒細胞釋放的顆粒狀蛋白可以損傷組織，但另一方面，嗜酸性粒細胞IL-21的釋放通過作用于其它細胞而減輕過敏性反應。近二十年來，哮喘的流行、發病率和死亡率不斷上升，強烈需求改善哮喘和其它過敏性疾病的治療方法。
上述對哮喘中嗜酸性粒細胞的中心作用的簡要描述被認為普通適用于過敏性反應。過敏性癥狀或疾病的清單(該清單無論如何不意在限制本發明的范圍)包括哮喘、過敏性反應、藥物反應、食物過敏、昆蟲毒液過敏、過敏性鼻炎、風疹、濕疹、過敏性皮炎、接觸性過敏反應、過敏性結膜炎。這些過敏性反應、過敏性疾病和過敏性癥狀可以通過施用IL-21而被控制、治療或預防。
此外，嗜酸性粒細胞在對抗寄生蟲病(包括但不局限于蠕蟲感染)有著重要作用。
本發明涉及通過施用IL-21治療、預防和/或控制過敏性疾病或病癥的方法。
發明概述目前發現，嗜酸性粒細胞合成、貯存和/或分泌IL-21。嗜酸性粒細胞可參與針對過敏性反應、疾病或病癥的保護性應答。本發明涉及通過施用IL-21控制、治療和預防過敏性反應、狀態和疾病。
定義“多肽”是由氨基酸殘基以肽鍵相連的聚合體，可以天然地或合成性地制備。少于約10個氨基酸殘基的多肽常稱作“肽”。
“蛋白質”是含有一個或多個多肽鏈的大分子，可以天然地或合成性的制備。蛋白質還可以包括非肽的成分，如糖基或其它非肽的取代基。糖和其它非肽取代基可以由產生該蛋白質的細胞加到蛋白質上，并且隨著細胞的類型而變化。糖和其它非肽取代基還可以在該蛋白質基于細胞合成后再合成性添加。在此定義的蛋白質根據其氨基酸主鏈的結構而命名；取代基如糖基或其它非肽取代基一般不列入，但依然可以存在。
國際專利申請號PCT/US06067，公開號WO 00/53761，2000年9月14日公布，全部引入本申請，其中公開了IL-21(“細胞因子Zalpha11配基”)為SEQ ID NO.2，在此全文引入本申請，在本申請也表示為SEQID NO.2，該申請還公開了制備它及其抗體的方法，以及編碼IL-21的多核苷酸序列，顯示為SEQ ID NO.1。本發明也構思于IL-21多肽的用途，此外所用的多肽是指與SEQ ID NO.2多肽具有序列同一性的多肽，或它們的直向同源物，包括至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或多于95％。本發明也包括如下多肽的用途，該多肽具有與SEQ IDNO.2的氨基酸序列殘基1至162、殘基30至162、或殘基33至162至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性。測定同一性百分比的方法將在下文描述。本發明的IL-21多肽保留了全部或部分IL-21的生物活性，該生物活性使IL-21在治療過敏性反應、過敏性疾病和過敏性癥狀中起作用。其中的某些多肽還可能有比IL-21更高的生物活性。
“嗜酸性的粒細胞”、“嗜酸性的顆粒細胞”或“嗜酸性粒細胞”被定義為這樣的淋巴細胞，其含有染紅的嗜酸性顆粒(例如用瑞特或蘇木精-曙紅染料)。嗜酸性粒細胞與正常的生理反應及疾病的進程均有關。包括在此定義中，但不局限在此定義中，嗜酸性粒細胞是(i)骨髓中的嗜酸性粒細胞，(ii)循環在外周血中的嗜酸性粒細胞，(iii)與過敏性反應(包括但不局限于哮喘、過敏性反應、藥物反應、食物過敏、昆蟲毒液過敏、過敏性鼻炎、風疹、濕疹、過敏性皮炎、接觸性過敏反應、過敏性結膜炎)有關的嗜酸性粒細胞，(iv)與惡性疾病(何杰金氏淋巴瘤、蕈樣真菌病、慢性骨髓性白血病、以及肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或子宮癌等非限定性實例)有關的嗜酸性粒細胞，(v)與自身免疫反應有關的嗜酸性粒細胞，(vi)與膠原血管疾病(類風濕性關節炎和動脈周炎，非限定性實例)有關的嗜酸性粒細胞，(vii)與蠕蟲感染有關的嗜酸性粒細胞，和/或(vii)與治療性紊亂有關的嗜酸性粒細胞。還包括呂氏綜合癥、嗜酸性粒細胞過多-肌痛綜合癥和先天性嗜酸性粒細胞過多綜合癥中的嗜酸性粒細胞。
“嗜酸性粒細胞的IL-21”，如在此所使用的，應該是指由嗜酸性顆粒細胞所合成、貯存和/或分泌的IL-21。
在此使用的術語‘治療方法’和‘治療’是指處理和護理病人用于對抗如疾病或失調的狀態。該術語意在包括治療給定病癥的全部范圍，從病人患病開始，如病癥的預防，延遲疾病、失調和癥狀的進展，緩和和減輕癥狀及并發癥，和/或治愈或消除疾病、失調和癥狀。接受治療的受試者優選為哺乳動物，特別是人類。
附圖描述

圖1a原位雜交顯示，伴有嗜酸性粒細胞浸潤的何金杰氏淋巴瘤標本中IL-21mRNA的表達。同一視野的圖像顯示，左邊方格為明視野，右邊的方格為暗視野。可見在暗視野中IL-21mRNA的信號為明亮斑點。
圖1b原位雜交顯示，伴有嗜酸性粒細胞浸潤的何杰金氏淋巴瘤標本中IL-21mRNA的表達。在右邊高放大倍數的圖上可見IL-21mRNA的信號，為黑銀色粒狀遍布于嗜酸性粒細胞(箭頭)。
圖2原位雜交顯示，在淋巴細胞占優勢的何杰金氏淋巴瘤的標本中IL-21mRNA的表達。同一視野的圖像顯示，左邊方格為明視野，右邊方格為暗視野。可見在暗視野圖像中IL-21mRNA的信號為明亮的斑點，遍布于包圍著里德-斯特思伯格細胞的淋巴細胞(箭頭)。
圖3原位雜交顯示，在嗜酸性粒細胞浸潤的何金杰氏淋巴瘤標本(上面的方格)中，或在淋巴細胞占優勢的何杰金氏淋巴瘤標本(下面的方格)中，IL-21受體mRNA的微弱表達。同一視野的圖像顯示，在左邊方格為明視野，在右邊方格為暗視野。在暗視野可見IL-21RmRNA的微弱信號為明亮斑點彌散于整個組織。
圖4SEQ ID NO.1編碼IL-21的DNA序列。
圖5SEQ ID NO.2IL-21的氨基酸序列發明描述目前發現，嗜酸性粒細胞合成、貯存和/或分泌IL-21。嗜酸性粒細胞可參與過敏性反應、疾病和癥狀中的保護性應答。
在一個實施方案中，本發明涉及通過對需要的受試者施用IL-21治療其中嗜酸性粒細胞參與保護性應答的疾病或病癥，包括但不局限于過敏性反應或癥狀。
在一個實施方案中，本發明涉及通過對需要的受試者施用IL-21治療過敏性反應、癥狀和疾病。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用IL-21多肽治療其中嗜酸性粒細胞參與保護性應答的疾病或病癥，包括但不局限于過敏性反應或癥狀，其中所述IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2多肽或其直向同源物至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性。本發明還包括多肽的用途，該多肽包含與SEQ ID NO.2的氨基酸殘基1至162、殘基30至162或殘基33至162的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％序列同一性的氨基酸序列。測定同一性百分比的方法將在下文中描述。如上述本發明與SEQ ID NO.2多肽或其直向同源物具有序列同一性的多肽保留了IL-21的全部或部分生物活性，使IL-21可用于治療過敏性反應、過敏性疾病和過敏性癥狀。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用IL-21多肽治療過敏性反應、癥狀和疾病，所述IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2多肽或其直向同源物至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性。本發明還包括如下多肽的用途，該多肽包含與SEQ ID NO.2的氨基酸殘基1至162、殘基30至162、或殘基33至162的序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性的氨基酸序列。測定同一性百分比的方法將在下文中描述。本發明的與SEQID NO.2多肽或其直向同源物具有序列同一性的多肽保留了IL-21的全部或部分生物活性，使IL-21可用于治療過敏性反應、過敏性疾病和過敏性癥狀。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用IL-21模擬物治療疾病或病癥，這些疾病或病癥與嗜酸性粒細胞有關，包括但不局限于過敏性疾病或病癥，所述模擬物為化合物，其不是上述的IL-21多肽，但具有IL-21的生物活性。IL-21模擬物可以是肽，如多肽或寡肽，或者可以是非蛋白質，如較小的有機分子。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用IL-21模擬物治療其中嗜酸性粒細胞參與保護性應答的疾病或病癥，包括但不局限于過敏性反應或病癥，所述模擬物為化合物，其不是上述的IL-21多肽，但具有IL-21的生物活性。IL-21模擬物可以是肽，如多肽或寡肽，或者可以是非蛋白質，如較小的有機分子。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用編碼IL-21的多核苷酸或IL-21多肽治療其中嗜酸性粒細胞參與保護性應答的疾病或病癥，包括但不局限于過敏性反應或病癥，所述IL-21多肽與SEQ ID NO.2多肽或其直向同源物具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性。在進一步的實施方案中，本發明涉及通過施用編碼如下多肽的多核苷酸控制、治療和預防過敏性反應、癥狀和疾病，所述多肽包含與SEQ ID NO.2的氨基酸殘基1至162、殘基30至162、或殘基33至162的序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性的氨基酸序列。這種多核苷酸的一個例子如SEQ ID NO.1所示，編碼具有SEQ ID NO.2中所示序列的多肽。
在一個實施方案中，本發明涉及通過施用編碼IL-21的多核苷酸或IL-21多肽治療過敏性反應、癥狀和疾病，所述IL-21多肽具有與SEQID NO.2多肽或其直向同源物至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％的序列同一性。在進一步的實施方案中，本發明涉及通過施用編碼多肽的多核苷酸控制、治療和預防過敏性反應、癥狀和疾病，所述多肽包含與SEQ ID NO.2氨基酸的殘基1至162、殘基30至162、或殘基33至162的序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或多于95％同一性的氨基酸序列。
在兩個氨基酸序列之間的同一性百分率通過Needelman-Wunsch比對確定，可用于蛋白質和DNA比對。對于蛋白質比對，使用的默認記分矩陣是BLOSUM50，間隔中一個殘基的罰為-12，對于間隔中另外的殘基的罰為-2，比對可由FASTA包，版本為v20u6的排列軟件完成(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，“生物序列分析的改進工具”，PNAS 852444-2448；及W.R.Pearson(1990)“用FASTP和FASTA快速和敏感的序列比較”，酶學方法18363-98)。
根據本發明，用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21或其它IL-21多肽可以單獨施用或與其它已經建立的治療方法聯合施用，如β2-拮抗劑、色甘酸、白細胞三烯受體拮抗劑、皮質類固醇細胞因子、細胞因子拮抗劑，白細胞介素及白細胞介素拮抗劑，這些僅提供作為非限定的例子。
藥物組合物根據本發明用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21或其它IL-21多肽，可以以單個劑量或多重劑量單獨施用，或與制藥上可接受的載體或賦形劑聯合施用。用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的包含IL-21或其它IL-21多肽的本發明藥物組合物，可以與制藥上可接受的載體或稀釋液以及其它任何已知的佐劑或賦形劑，依照那些如公布在雷明頓藥物學的科學與實踐，第19版，Gennaro，Ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1995上的傳統技術一起配制。組合物可以表現為傳統的形式，例如膠囊、藥片劑、氣霧劑、溶液或懸浮液。
藥物組合物可以特別地配制用于由任何適合的途徑施用，如口服，直腸，鼻，肺，局部(包括頰和舌下)，經皮膚的，腦池內的，腹膜內的，陰道的，腸胃外的(包括皮下的，肌內的，鞘內的，靜脈內的和真皮內的)途徑。應當理解，優選的途徑將依賴于接受治療的對象的總體狀況和年齡，所要治療的癥狀和類型和所選用的活性成分。施用途徑可以為任何一種途徑，只要其可以使活性成分有效地運輸到達適宜的或期望的作用位點。
用于口服施用的藥物組合物包括固體劑型，如硬的或軟的膠囊，片劑，含片，糖衣丸，丸劑，錠劑，粉劑和粒劑。只要合適，它們在制備時可加上包被，如腸溶衣，或是根據該領域公知的方法配制，使得可以控制活性成分的釋放，如持續地或延長地釋放。
用于口服施用的液體劑型包括溶液，乳劑，水性的或油性的懸液，糖漿和酏劑。
用于腸胃外施用的藥物組合物，包括無菌的水性和非水性可注射溶液、分散體、懸液或乳劑，以及無菌的粉劑，在使用前于無菌的注射用溶液或分散體中重構。貯存注射用制劑，也在本發明構思的范圍內。
其它適宜的施用方式包括栓劑，噴霧劑，軟膏，乳膏，凝膠，吸入劑，皮膚貼片，植入物等。
典型的口服劑量是在從每天約0.001至約100mg/kg體重的變化范圍內，比如每天從約0.01至約50mg/kg體重，例如從約0.05至約10mg/kg體重施用1個劑量或多個劑量，如1至3個劑量。確切的劑量取決于所選用的IL-21多肽的類型，施用的頻率和方式，接受治療的對象的性別、年齡、體重和總體狀況，所治療的癥狀的類型和嚴重性，待治療的任何伴發疾病和本領域技術人員已知的其它因素。
該制劑可以通過本領域公知的方法方便地表現為單位劑量形式。用于口服施用每天1次或多次(如每天1至3次)典型的劑量形式可以包含從0.05至約1000mg，例如從約0.1至約500mg，如從約0.5mg至約200mg。
對于腸胃外的途徑如靜脈內的、鞘內的、肌內的及類似的施用，典型的劑量大約為口服施用的劑量的一半。
根據本發明用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的非蛋白質IL-21模擬物通常以游離的物質或是其制藥上可接受的鹽的形式被利用。實例有利用具有游離堿的化合物之酸加成鹽以及利用具有游離酸的化合物之堿加成鹽。術語“制藥上可接受的鹽”指非毒性的鹽，所述化合物通常由游離堿與適當的有機或無機酸反應，或酸與適當的有機或無機堿反應而制備。當該化合物含有游離堿，該鹽以傳統方法制備，方法是用制藥上可接受的酸的化學等價物處理該化合物的溶液或懸液。當該化合物中含有游離酸，該鹽以傳統方式制備，方法是通過用制藥上可接受的堿的化學等價物處理該化合物的溶液或懸液。含有羥基的化合物的生理上可接受的鹽，包括所述化合物的陰離子與適當的陽離子相結合，如鈉離子或銨離子。其它的不是制藥上可接受的鹽可在本發明的化合物的制備中起作用，它們構成了本發明的又一方面。
在蛋白質為固體或結晶的形式時，IL-21多肽的鹽特別相關。
對于腸胃外施用，IL-21多肽溶液或IL-21模擬物的無菌水性溶液，水性丙二醇或芝麻油或花生油均可采用。如果需要，這種水性溶液應適當地進行緩沖，而且液體稀釋劑首先要用充足的生理鹽水或葡萄糖調成等滲。水性溶液特別適合于靜脈內、肌內、皮下和腹膜內施用。通過該領域技術人員公知的標準技術，采用的無菌水性介質均可容易地得到。
適宜的藥物載體包括惰性固體稀釋劑或填充物、無菌水性溶液和多種有機溶劑。例如固體載體有乳糖、石膏粉、蔗糖、環糊精、滑石粉、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯樹膠、硬脂酸鎂、硬脂酸和纖維素低級烷基醚。液體載體的實例有糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧乙烯和水。類似地，載體或稀釋劑可以包括任何的本領域公知的持續釋放物質，如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯，單獨使用或與蠟混合使用。根據本發明用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的通過組合IL-21多肽或IL-21模擬物與制藥上可接受的載體形成的藥物組合物可以適合于公開的施用途徑的多種劑量形式方便地施用。制劑可以通過制藥領域公知的方法方便地表現為單位劑量形式。
對于經鼻施用，制劑可以含有IL-21多肽或IL-21模擬物，其溶解或分散于液體載體中，特別是水性載體，用于氣霧劑應用。載體中可以包含添加劑，如增溶劑(例如丙二醇)、表面性活劑、吸收增強劑(例如卵磷脂(磷脂酰膽堿)或環糊精)或防腐劑(例如parabenes)。
根據本發明適合于口服施用用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21多肽或IL-21模擬物的制劑可以呈不連續的單位，如膠囊或片劑，每個單位包含預先確定的活性成分的量，還可以包括適合的賦形劑。此外，可口服的制劑可以為如下形式粉劑或顆粒，水性或非水性液體中的溶液或懸液，或水包油或油包水的液體乳劑。
準備用于口服施用的組合物可以根據任何已知的方法配制，該組合物可以包含一種或多種選自如下的添加劑甜味劑、增香劑、增色劑和防腐劑，以使其成為制藥上適宜的和適口的制劑。片劑可以包括活性成分與非毒性的制藥上可接受的賦形劑混合，所述賦形劑適合于片劑的生產。例如這些賦形劑可以為惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化劑和崩解劑，例如玉米淀粉或藻酸；粘合劑，如淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；以及潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。這些片劑可以不包被或是可以通過已知的技術包被，用于延緩在胃腸道的分解與吸收，因而能在較長的時間段內持續作用。例如，可以采用時間延緩物質如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。它們還可以通過美國專利4,356,108、4,166,452和4,265,874(此處引用作為參考)所描述的技術進行包被，而形成用于可控制的釋放滲透治療片劑。
用于口服使用的制劑還可表現為硬的明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土；或是軟的明膠膠囊，其中活性成分與水或油性介質混合，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。
水性懸液可以包含IL-21多肽或IL-21模擬物，其與適合于生產水性懸液的賦形劑混合。此賦形劑為懸浮劑，例如羧甲酸纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散或濕潤劑可以為天然存在的磷脂，如卵磷脂，或環氧烷烴與脂肪酸的縮合產物，如聚氧乙烯硬脂酸酯，或是氧化乙烯與長鏈脂族醇的縮合產物，如十七烷亞乙基氧基十六醇，或是氧化乙烯與部分脂肪酸衍生酯和己糖醇的縮合產物，如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或是氧化乙烯與部分脂肪酸衍生酯和己糖醇酐的縮合產物，如聚乙烯失水山梨醇單油酸酯。水性懸液還可以包括一種或多種增色劑，一種或多種增香劑和一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。
油性懸液可以通過將活性成分分散于植物油(如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或是分散于礦物油(如液體石蠟)而配制。油性懸液可以包括粘稠劑，例如蜂蠟，硬石蠟或鯨蠟醇。可以加入如上述所列的甜味劑及增香劑以制成適口的口服制劑。這些組合物可以通過添加抗氧化劑(如抗壞血酸)而保存。
適合于通過加入水而制備水性懸液的可分散的粉劑或粒劑使活性化合物與分散或濕潤劑、懸浮劑和一種或幾種防腐劑混合。適合的分散或濕潤劑和懸浮劑可以用上面已經提到的作為示例。其它的賦形劑，如甜味劑、增香劑、增色劑也可以使用。
根據本發明，用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21多肽或IL-21模擬物的藥物組合物還可以為水包油乳劑的形式。油相可以為植物油(例如橄欖油或花生油)，或是礦物油(如液體石蠟)，或是它們的混和物。適合的乳化劑可以是天然存在的樹膠，如阿拉伯樹膠或黃蓍膠；天然存在的磷脂，如大豆，卵磷脂，脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯或是部分酯，例如失水山梨醇單油酸酯，和所述的部分酯與氧化乙烯的縮合產物，例如聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯。乳劑也可以包含甜味劑和增香劑。
糖漿和酏劑可以與甜味劑一起配制，例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖。此制劑還可以包含緩和劑、防腐劑、增香劑和增色劑。藥物組合物可以為無菌的可注射用水性或油質懸液的形式。該懸液可以根據已知的方法配制，使用上述的分散或濕潤劑和懸浮劑。該無菌可注射用制劑也可以是非毒性的胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑制成無菌的可注射用的溶液或懸液，如1，3-丁二醇中的溶液。可接受的媒介物或溶劑中采用的為水、林格溶液和等滲的氯化鈉溶液。此外，無菌固定油也可方便地采用作為溶劑或懸浮介質。為此，任何采用合成甘油一酯或甘油二酯的溫和固定油均可利用。此外，脂肪酸(如油酸)在可注射物的制備上可使用。
組合物還可以以栓劑的形式，用于直腸內施用本發明的化合物。這些組合物可以通過將藥物與適合的非刺激性賦形劑混合而制備，所述賦形劑在普通溫度下為固體，但在直腸溫度下液化，因而在直腸內融化以釋放藥物。這樣的物質包括例如可可油和聚乙烯乙二醇。
對于外用，構思了含有本發明化合物的乳霜、軟膏、膠凍、懸浮液溶液等。對于此應用的目的，外用應包括口腔沖洗和含漱劑。
根據本發明用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21多肽或IL-21模擬物也可以以脂質體輸送系統的形式施用，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質體可以由不同的磷脂構成，如膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿。
此外，根據本發明，用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的部分IL-21多肽或IL-21模擬物可以與水或普通有機溶劑形成溶劑化物。這種溶劑化物也包括在本發明的范圍內。
如果是固體載體用于口服施用，制劑可以是片劑，以粉劑或小球的形式置于硬的明膠膠囊內，或是含片或錠劑的形式。固體載體的量會有很大的變化，但通常是從約25mg至約1g。如果使用液體載體，制劑可以為糖漿、乳液、軟明膠膠囊或無菌可注射液體的形式，如水性的或非水性的液體懸液或溶液。
根據本發明用于治療哮喘或其它過敏性癥狀的IL-21多肽或IL-21模擬物可以施用于需要此治療的哺乳動物，特別是人類。哺乳動物還包括動物，無論是馴服的動物(例如家養的寵物)還是非馴服的動物(如野生動物)。
包含根據本發明的化合物的藥物組合物，可以每天或每周施用一次或多次，在吃飯時方便地施用。該藥物組合物的有效的量為達到臨床上明顯效果的量。該劑量部分依賴于所需治療的特殊病癥、受試者的年齡、體重和總體健康狀況及該領域技術人員明顯考慮到的其它因素。
實施例IL-21和IL-21R mRNA在何杰金氏淋巴瘤中的表達對組織微矩陣載片的原位雜交分析(DAKO腫瘤多重載片(multislide)，DAKO目錄號T1064)，揭示IL-21和IL-21R mRNA在何杰金氏淋巴瘤標本中表達。在數個不同的何杰金氏病受試者的標本中可以看到信號。在多重載片中顯示的所有其它類型的癌(大約20種不同的類型)中IL-21或IL-21R mRNA不表達。
探針制備，雜交條件和嚴格沖洗探針制備原位雜交是用探針來完成，該探針由質粒體外轉錄而生成，所述質粒包含下面的cDNA片段人IL-21 PCR片段，含有堿基對344至堿基對833(acc.no.AF254069(見表A))，與公開序列相比含有1個錯配，被克隆至轉錄載體pCRBlunt II(Invitrogen)。
雜交S-35標記的探針的比活性在終雜交混合物(由如下組成10×SALTS，去離子甲酰胺，50％硫酸葡聚糖，t-RNA(10mg/ml)，1.0MDTT)中為80000cpm/ml。載片于47℃雜交過夜。
嚴格沖洗切片在50％甲酰胺，1×SALTS(300mM NaCl，10mM Tris(pH6.8)，10mM NaPO4，5mM EDTA，0.02％ Ficoll 400，0.02％聚乙烯吡咯烷酮和0.02％ BSA)和10mM二硫蘇糖醇中洗片，57℃1小時，62℃ 1小時。37℃ RNA酶A(20μg/ml RNA酶A溶于0.5M NaCl，10mMTris-Cl(pH7.2)，1mM EDTA)處理30分鐘后，切片在室溫以0.1×SSC洗30分鐘。切片浸入放射自顯影乳劑中曝光21天。
結果屬于組織形態學上定義的嗜酸性粒細胞浸潤的何杰金氏淋巴瘤亞群的標本中，IL-21mRNA主要在嗜酸性顆粒細胞中表達(圖1a)。原位雜交后載片以蘇木精-曙紅(H&E)復染，由此可以在形態學上確定IL-21mRNA陽性細胞為嗜酸性粒細胞(圖1b箭頭)。在淋巴細胞占優勢的樣本中，IL-21mRNA在包圍著林格-斯特恩伯格細胞的小簇淋巴細胞中有表達(圖2)在組織病理學中嗜酸性的和淋巴細胞類型的淋巴細胞中IL-21RmRNA均彌散地表達(圖3)結論IL-21在嗜酸性粒細胞中的表達表明，所述嗜酸性粒細胞的IL-21發揮了保護性的作用。根據此觀點，在特定的失調或疾病或癥狀下，嗜酸性粒細胞的浸潤或在體液和/或組織中數目的增加表明，所述嗜酸性粒細胞通過釋放IL-21而起保護性的作用，IL-21可以反過來減輕過敏性反應或過敏性疾病。因此，其中嗜酸性粒細胞參與保護性作用的疾病(包括但不限于過敏性疾病)可以通過施用IL-21多肽或IL-21模擬物來治療。
IL-21和IL-21受體可能在何杰金氏淋巴瘤的病理生理學方面起作用，IL-21信號傳導可以因此而成為何杰金氏病藥理學干預的靶點。
特別的是，IL-21在緊鄰包圍惡性林格-斯特恩伯格細胞的淋巴細胞中的明顯表達提示，IL-21mRNA的表達參與林格-斯特恩伯格細胞與周圍的淋巴細胞之間的對話(cross-talk)，IL-21的表達甚至可能由林格-斯特恩伯格誘導。
證明IL-21和IL-21R在嗜酸性粒細胞樣的細胞系HL-60中IL-21和IL-21R表達的方法HI-60細胞在有丁酸存在的條件下培養以誘導出嗜酸性粒細胞樣的表型，隨后與細胞因子或生長因子(非限定的實例為GM-CSF、eotaxin、IL-4、IL-5和IFN-γ)一起培養，在培養1至72小時后收獲細胞，通過RT-PCR分析IL-21和IL-21R mRNA的表達，通過ELISA分析IL-21蛋白質的表達，通過流式細胞計量術分析IL-21和IL-21R蛋白質的表達。
證明在嗜酸性粒細胞中IL-21和IL-21R表達的方法嗜酸性粒細胞從人血液中分離，并與細胞因子或生長因子(非限定的實例為GM-CSF、eotaxin、IL-4、IL-5和IFN-γ)一起培養，如Woerly等，J.Leukoc.Biol.72769-779，2002；Schmid-Grendelmeier等，J Immunol1691021-1027，2002所描述的方法在培養1-72小時后收獲細胞，RT-PCR分析IL-21和IL-21R mRNA的表達，ELISA分析IL-21蛋白質表達，用流式細胞計量術分析IL-21和IL-21R蛋白質的表達。
證明在過敏性疾病受試者中的嗜酸性粒細胞中IL-21和IL-21R異常表達的方法從患有過敏性疾病的受試者血液中和健康供血者的血液中分離嗜酸性粒細胞，如前述RT-PCR、ELISA或流式細胞計量術直接分析離體IL-21和IL-21R的表達，或在分析IL-21和IL-21R表達之前，用生長因子或細胞因子刺激。
證明在過敏性疾病受試者的嗜酸性粒細胞中IL-21和IL-21R的異常表達的方法過敏性疾病受試者和正常捐獻者用相關抗原攻擊后取活組織進行切片，免疫組織化學染色分析IL-21和IL-21R的表達，同時用相應的標志物確定細胞的類型，例如EG-2作為嗜酸性粒細胞的標志物。
證明缺乏IL-21會導致小鼠哮喘模型疾病加重的方法IL-21缺失型和野生型小鼠用卵白蛋白免疫，隨后通過鼻內滴注卵白蛋白攻擊，測定其呼吸道反應，支氣管肺泡灌洗的細胞成分及細胞因子、趨化因子和IgE水平，方法如Hogan等，J Immunol 1712644-2651(2003)或Medoff等，J Immunol 1685278-5286，2002或Denzler等，J Immunol1655509-5517(2000)或Ishimitsu等，J Immunol 1661991-2001(2001)。在IL-21缺失的小鼠中疾病嚴重性增加，提示IL-21可能在治療哮喘方面起作用。
證明中和IL-21在小鼠哮喘模型中會導致疾病加重的方法小鼠用卵白蛋白免疫隨后通過鼻內滴注卵白蛋白激發。在卵白蛋白攻擊之前、之后或同時，對小鼠中和IL-21抗體。測定其呼吸道反應、支氣管肺泡灌洗的細胞成分、和細胞因子、趨化因子和IgE水平，方法同Hogan等，J Immunol 1712644-2651(2003)或Medoff等，J Immunol1685278-5286，2002或Denzler等，J Immunol 1655509-5517(2000)或Ishimitsu等，J Immunol 1661991-2001(2001)。在中和IL-21抗體處理的小鼠中疾病嚴重性增加提示IL-21在治療哮喘方面起作用。
證明在小鼠哮喘模型中IL-21處理導致疾病嚴重性降低的方法小鼠用卵白蛋白免疫，隨后用鼻內滴注卵白蛋白攻擊。在卵白蛋白激發之前、之后或同時，小鼠用IL-21蛋白、編碼IL-21的質粒或緩沖液或對照質粒進行處理。測定其呼吸道反應、支氣管肺泡灌洗的細胞成分、細胞因子、趨化因子和IgE水平，方法同Hogan等，J Immunol1712644-2651(2003)或Medoff等，J Immunol 1685278-5286，2002或Denzler等，J Immunol 1655509-5517(2000)或Ishimitsu等，J Immunol1661991-2001(2001)。
證明在蠕蟲感染中缺乏IL-21導致疾病嚴重性增加的方法IL-21缺失型和野生型小鼠用已殺死的(冷凍的)微絲蚴免疫，隨后靜脈注射活的微絲蚴，測定其過敏性反應，方法如Hall等人，Infect.Immum.664425-4430(1998)所述。
證明IL-21可能在治療蠕蟲感染方面起作用的方法小鼠用已殺死的(冷凍的)微絲蚴免疫，隨后靜脈注射活的微絲蚴。在注射活的微絲蚴之前、之后或同時，小鼠用IL-21蛋白、編碼IL-21的質粒或緩沖液或對照質粒進行處理。測定其過敏性反應，方法同上，在上面提到的Hall等的文章所描述。
表A人IL-21cDNA片段生成白細胞介素21(IL-21)蛋白登記號Q9HBE4白細胞介素21(IL-21)來源DNA登記號AF254069探針序列489bpATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTACCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCTGAembl|af254069|af254069 人白細胞介素21 (IL-21)mRNA完整CDS長度＝642得分＝961點(485)，預期＝0.0同一性＝488/489(99％)鏈＝加/加Query1 atgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttg 60||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct47 atgagatccagtcctggcaacatggagaggattgtcatctgtctgatggtcatcttcttg 106Query61 gggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgt 120||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct107 gggacactggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgt 166Query121 caacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaattt 180||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct167 caacttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaattt 226Query181 ctaccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcag 240||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct227 ctgccagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgttttcag 286Query241 aaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaatt 300||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct287 aaggcccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaatt 346Query301 aaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagacta 360||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct347 aaaaagctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagacta 406Query361 acatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattc 420||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct407 acatgcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattc 466Query421 aaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaa 480||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct467 aaatcacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaa 526Query481 gattcctga 489|||||||||Sbjct527 gattcctga 535
表B人IL-21氨基酸序列蛋白登記號Q9HBE4，也表示為SEQ ID NO.2，包括含有殘基1至29的信號肽1...MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLK...5051..NYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSI...100101.KKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQ...150151 HLSSRTHGSEDS
權利要求
1.IL-21用于制造治療需要所需治療的受試者如下疾病或病癥的藥物的用途，所述疾病或病癥中嗜酸性粒細胞參與保護性應答。
2.IL-21用于制造治療需要所述治療的受試者的過敏性癥狀的藥物的用途。
3.根據權利要求1和權利要求2的用途，其中過敏性癥狀為哮喘、過敏性鼻炎或皮膚過敏性疾病。
4.IL-21用于制造治療需要所述治療的受試者之寄生蟲病的藥物的用途。
5.根據權利要求4的用途，其中寄生蟲病為蠕蟲感染。
6.IL-21多肽用于制造治療需要所述治療的受試者的如下疾病或病癥的藥物的用途，所述疾病或病癥中嗜酸性粒細胞參與保護性應答，所述IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQ ID NO.2的殘基30至162至少70％的序列同一性。
7.IL-21多肽用于制造治療需要所述治療的受試者之過敏性癥狀的藥物的用途，所述IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQID NO.2的殘基30至162至少70％的序列同一性。
8.根據權利要求7的用途，其中過敏性癥狀為哮喘、過敏性鼻炎或皮膚過敏性疾病。
9.IL-21多肽用于制造治療需要所述治療的受試者之寄生蟲病的藥物的用途，所述IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQ IDNO.2的殘基30至162至少70％的序列同一性。
10.根據權利要求9的用途，其中寄生蟲病為蠕蟲感染。
11.根據權利要求6至權利要求10的任意一項的用途，其中IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQ ID NO.2的殘基30至162至少80％的序列同一性。
12.根據權利要求11的用途，其中IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQ ID NO.2的殘基30至162至少90％的序列同一性。
13.根據權利要求12的用途，其中IL-21多肽具有與SEQ ID NO.2的多肽、或與SEQ ID NO.2的殘基30至162至少95％的序列同一性。
全文摘要
本發明涉及用于控制、治療和預防其中嗜酸性粒細胞參與保護性應答的疾病或病癥的IL－21的施用，例如過敏性反應、過敏性疾病、過敏性癥狀和寄生蟲病。
文檔編號A61PGK1703237SQ200380101288
公開日2005年11月30日 申請日期2003年10月13日 優先權日2002年10月11日
發明者J·羅默爾, N·P·H·莫勒, K·斯卡克 申請人:諾沃挪第克公司