專利名稱：用加工的脂肪抽吸細胞來治療患者的系統和方法
相關領域的交叉參考本申請要求于2001年12月7日提交的發明名稱為“加工的脂肪抽吸細胞以及脂肪衍生干細胞的臨床裝置、系統和應用”的第60/338,856號U.S.臨時申請的優先權，該申請的整個內容引入本文以供參考。
背景技術：
1.發明領域本發明一般涉及衍生自脂肪組織的細胞，更具體來說，涉及脂肪衍生干細胞，使用脂肪衍生干細胞的方法，含有脂肪衍生干細胞的組合物，以及制備和使用脂肪衍生干細胞的系統。
2.相關技術的描述再生醫療可定義為以臨床目標方式利用身體的再生機制，以不是正常痊愈機制的一部分的方式使用它們，或者人工放大正常機制。該過程的一個經典實例是在骨髓移植中發現的過程，其中從供體收獲造血干細胞和祖細胞，置于其中正常造血機制已經被切除或基本上排除或損害的接受者內，由此代替或再生接受者的造血能力(Thomas 1994)。在最近的臨床和臨床前研究中，該方法已經延伸到了骨髓的非造血干細胞組分，試驗了再生(或試圖再生)組織，包括骨(Connolly 1998；Horwitz，Prockop等人，1999；Horwitz，Prockop等人，2001)、心臟(Fukuda 2001；Orlic，Kajstura等人，2001；Orlic，Kajstura等人，2001；Strauer，Brehm等人，2002)和肝臟(Avital，Inderbitzin等人，2001)。這些研究是基于檢測骨髓中非造血干細胞與內皮前體細胞的存在(Prockop，Azizi等人，2000)(Pittenger，Mackay等人，1999)(Shi，Rafii等人1998；Carmeliet和Luttun 2001)。
這些研究使用的是骨髓移植物接受動物，其中供體和宿主細胞可通過遺傳標記區別開，以表明接受者中的某些新血管發育是衍生自供體骨髓細胞(Carmeliet和Luttun 2001)(Takahashi，Kalka等人，1999；Murayama，Tepper等人，2002)。雖然該研究確定性地證實了骨髓含有這樣的細胞，但是通常將其意思延伸為骨髓是含有相應數目的這樣的細胞的唯一組織，以至于當研究人員檢測循環中的內皮前體細胞(EPC)或骨髓干細胞(MSC)時，自動假定這些細胞必然是骨髓衍生的。因此，沒有人提出這樣的觀點，即其它組織的細胞群體可能代表另一或者也許是更好的治療相關細胞群體來源。
已經有人證實了脂肪組織含有多能干細胞群體(Huang，Beanes等人，2002；Mizuno，Zuk等人，2002)(Zuk，Zhu等人，2001).Zuk等人，(Zuk等人，(In Press)Human Adipose Tissue Is A Source Of MultipotentStem Cells，Molecular Biology of the Cell)，并且其它人已表明該組織是內皮細胞來源(Kern，Knedler等人，1983；Hutley，Herington等人，2001)[U.S.專利5,372,945 Alchas等人，1994]，但是后面這些文獻沒有檢驗以及沒有以任何方式提及內皮前體細胞。
干細胞是身體的主要細胞。已知得自胚胎的干細胞或胚胎干細胞(ESC)變成身體的很多—如果不是全部的話—細胞和組織類型。這些早期胎兒細胞不僅含有個體的所有遺傳信息，而且具有變成200+細胞和身體組織的新生能力。正在進行的研究表明，這些細胞具有非常大的科學和臨床價值。
然而，ESC的應用具有理論上的有限性。如果在臨床上使用，它們必須衍生自另一個體、胚胎。當衍生自他們的干細胞或組織被移植到另一個人體內時，細胞接受者可能需要毒性免疫抑制藥物來防止排斥反應。此外，另一個體的細胞可能攜帶可被傳染給接受者的病毒或其它少見但顯著的疾病。而且，已知ESC樣細胞(例如畸胎瘤)會形成腫瘤。
最近，已經鑒定了非胚胎或成人干細胞，并且它們是代替ESC臨床應用的重要可能供選擇對象。這些細胞靜息地位于很多-如果不是全部的話-組織中，假定它們在等待對創傷或其它破壞性疾病過程作出反應，這樣它們可愈合損傷的組織。出現的科學證據表明，每一個體攜帶一些這樣的干細胞，它們可以與ESC共享變成很多—如果不是全部的話—類型細胞和組織的能力。
據表明，成人干細胞群體存在于皮膚、肌肉、骨髓、肝臟、腦和脂肪組織當中的一個或多個中。迄今為止所提出的這樣的細胞在組織工程中的應用包括通過細胞純化和細胞培養方法來提高細胞數目、純度和成熟度。這些步驟是補償大部分組織中干細胞稀少所必需的。例如，據估計骨髓中間充質干細胞的比例為1/100,000有核細胞-1/100,000,0有核細胞。類似地，從皮膚中提取干細胞包括需要數周的一系列復雜細胞培養步驟。在心臟病臨床試驗中使用骨骼肌衍生干細胞采用2-3周的培養期，其中細胞數目增加至臨床相關數目，并且細胞分化成肌肉的過程也得到了促進。
這些擴展和分化步驟可提供提高的細胞數目、純度和成熟度，但是達到這樣需要付出代價。代價可包括一個或多個以下代價由于細胞老化而損失細胞功能，損失可能有用的非干細胞的細胞群體，延遲可能的細胞在患者中的應用，經濟成本增加，和在培養期間細胞被環境微生物污染的危險性增大。雖然現在通過未被加工過而是作為基本上全骨髓使用的骨髓衍生細胞可獲得關于人的數據(Horwitz，Prockop等人，1999；Horwitz，Prockop等人，2001)(Strauer，Brehm等人，2002)，但是所帶來的臨床益處是次最佳的，這是幾乎肯定與從骨髓獲得的有限的細胞劑量和純度有關的結果。
已經開發了多種用于從脂肪組織收獲細胞的裝置，但是這些裝置具有一個或多個以下缺點，不能最佳地提供抽吸裝置來取出脂肪組織從脂肪組織收獲階段到所有組織加工階段期間缺乏部分或完全的自動化，缺乏大于100ml脂肪組織的體積容量，從脂肪組織收獲階段到所有組織加工階段期間缺乏部分或完全封閉的系統，不能一次性處理部件來減輕樣本彼此之間交叉污染的伴發危險性。
需要這樣的替代方法，其中可以迅速且可靠地以高收率、一致性和/或純度獲得活性細胞群體，和因此可降低或排除細胞的提取后操作。理想情況是，細胞群體以適于將它們直接置于接受者體內的方式獲得。
發明概述本發明涉及用以使用衍生自脂肪組織的細胞的組合物、方法和系統，所述細胞與提高、產生或支持治療、結構或美容有益效果所需的添加劑一起被直接置于接受者體內。
在一個實施方案中，脂肪組織加工在保持封閉、無菌流體/組織路徑的系統中進行。這是通過使用預先裝配、連接的封閉無菌容器和管線裝置組合，讓組織和流體成分在封閉的路徑內傳遞來實現的。可將該加工裝置組合與插入到可控制試劑加入、溫度和加工時間的裝置內的一系列加工試劑(例如鹽水、酶等)連接，由此省去對人工控制加工的操作人員的需求。在優選的實施方案中，從組織提取到加工再到放置到接受者的整個過程都在相同裝置內，實際上甚至在經歷該過程的患者的相同房間內進行。
根據本發明的一個方面，將原始脂肪組織加工以基本上除去成熟的脂肪細胞和結締組織，由此獲得適于放置在接受者體內的不均一的多種脂肪組織衍生細胞。可將所得細胞與其它細胞、組織、組織片段或其它細胞生長和/或分化刺激劑一起置于接受者體內。在優選的實施方案中，將細胞與任何上述添加劑一起置于在一次手術操作中由其獲得它們的人體內，以給接受者帶來治療、結構或美容有益效果。
在一個實施方案中，治療患者的方法包括以下步驟a)提供組織取出系統；b)使用組織取出系統將脂肪組織從患者體內取出，所述脂肪組織具有一定濃度的干細胞；c)加工至少一部分脂肪組織以獲得濃度與加工前脂肪組織的干細胞濃度不同的干細胞；和d)將干細胞施用給患者，其中在施用給患者之前不將干細胞從組織取出系統中取出。
在另一個實施方案中，治療患者的方法包括以下步驟a)提供組織取出系統；b)使用脂肪組織取出系統將脂肪組織從患者體內取出，所述脂肪組織具有一定濃度的干細胞；c)加工脂肪組織以提高脂肪組織中的干細胞濃度；d)將具有該濃縮的干細胞的脂肪組織與另一單位部分的脂肪組織混和；和e)將具有提高的干細胞濃度的該脂肪組織施用給患者。
本文中公開的本發明系統包括a)組織收集容器，其包括i)用以接收從患者中取出的脂肪組織的組織收集入口；和ii)安置在容器內，并且用以保持從患者中取出的脂肪組織和讓從患者中取出的非脂肪組織通過的濾器；b)與組織收集容器連接的混和容器，該混和容器用以接收從脂肪組織獲得的干細胞，而不將干細胞從組織取出系統中取出，并包括用于施用至少一種添加劑以與包含在其中的干細胞混和的添加口；和c)用以讓混和容器中的干細胞離開組織收集系統以施用給患者的出口。
本發明組合物包括兩部分脂肪組織，第一部分是具有一定濃度干細胞的從患者中取出的脂肪組織，第二部分是干細胞濃度大于第一部分脂肪組織的從患者中取出的脂肪組織。
本文所描述的任何特征或特征組合都包括在本發明范圍內，只要包括在任何這樣的組合中的特征不互相矛盾即可，這可從上下文、本說明書和本領域技術人員的知識中顯而易見地看出。通過以下詳細描述，本發明的其它優點和方面將變得顯而易見。
附圖簡述附

圖1描繪了用于加工脂肪組織的組織取出系統。
附圖2描繪了附圖1的組織取出系統的組織收集容器。
附圖3是附圖2的組織收集容器的部分橫截面視圖。
附圖4描繪了用于自動操作組織取出系統的加工裝置。
附圖5是描繪移植物重量與細胞劑量的關系的圖。
附圖6是描繪加工的脂肪抽吸物對于酒精處理的小鼠的影響的圖。
附圖7是接受加工的脂肪抽吸物的酒精處理的小鼠的肝臟組織的顯微照片。
本發明優選實施方案的詳細描述下面詳細描述本發明的優選實施方案，其實例在附圖中說明。只要是可能的，在附圖以及關于附圖的說明或類似部分中使用相同或相似的參考編號。應當注意，附圖是簡化形式，而不是精確規模。在本文的公開內容中，僅為了方便和清楚起見，關于附圖使用方向術語例如頂部、底部、左面、右面、向上、向下、在上面、在上方、在下面、在下方、后面和前面。這樣的方向術語不應當理解為是以任何方式對本發明的限制。
雖然本文的公開提供了一些舉例說明的實施方案，但是應當理解，提供這些實施方案只是為了舉例說明，而不是限制性的。雖然討論了示例性實施方案，但是應當理解，以下詳細描述的目的是包括在如通過權利要求書所限定的本發明實質和范圍內的所有變型、替代方案和等同實施方案。可以結合本領域常用的各種細胞或組織分離技術來實施本發明，將所有這樣的常用加工步驟包括在本文中只是因為這是理解本發明所必需的。
本發明涉及存在于脂肪組織中的細胞群體，用于將所述細胞群體施用給人或動物患者的系統和方法。脂肪組織的細胞群體可用作治療和美容應用的細胞來源。除了別的應用以外，這樣的細胞還可用于再生醫療，例如用于可用再生細胞治療的疾病。如本文所述，可在沒有其它脂肪細胞或結締組織的情況下將該細胞群體施用給患者，或者可將細胞群體以濃縮量與脂肪組織一起混和來施用。
已經發現，脂肪組織是尤其富含干細胞的來源。該發現可至少是部分由于易于將脂肪組織的主要非干細胞組分—脂肪細胞除去。因此，在人和動物試驗中，加工的脂肪抽吸物(PLA)含有濃度為至少0.1％，并且通常大于0.5％的干細胞。在本發明的一些實施方案中，已獲得了含有約2-12％干細胞的PLA。在其它實施方案中，加工PLA以獲得其中干細胞占細胞群體最高達100％的細胞群體。依據本文所公開的本發明獲得的干細胞的數量顯著大于以前公開的在骨髓中的1/100,000(0.001％)的濃度(Castro-Malaspina，Ebell等人，1984)(Muschler，Nitto等人，2001)。此外，和脂肪組織收集品有關的發病率低于類似體積的骨髓(Nishimori，Yamada等人，2002)。另外，脂肪組織含有內皮前體細胞，它們能夠給患者提供治療(參見例如Masuda，H.，C.Kalka，和T.Asahara，Endothelial progenitor cells for regeneration.Hum Cell，2000.13(4)p.153-60；Kaushal，S.，等人，Functional small-diameterneovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo.Nat Med，2001.7(9)p.1035-40；和Kawamoto，A.，等人，Therapeuticpotential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardialischemia.Circulation，2001.103(5)p.634-7)。
本文所用的“脂肪組織”是指含有多種類型細胞，包括脂肪細胞和微血管細胞的組織。脂肪組織包括干細胞和內皮前體細胞。因此，脂肪細胞是指貯存脂肪的脂肪，包括結締組織。
本文所用的“單位脂肪組織”是指分散的或可測定量的脂肪組織。一個單位脂肪組織可通過確定該單位的重量和/或體積來測定。根據上面確定的數據，一個單位從患者中取出的加工的脂肪抽吸物具有這樣的細胞組成，其中至少0.1％的細胞組分是干細胞。根據本文的公開內容，一個單位脂肪組織可指從患者中取出的脂肪組織的全部量，或小于從患者中取出的脂肪組織的全部量的量。因此，可將一個單位脂肪組織與另一個單位脂肪組織合并，以形成重量或體積是各單位之和的一個單位脂肪組織。
本文所用的“部分”是指小于全部的材料的量。一小部分是指小于50％的量，一大部分是指大于50％的量。因此，小于從患者中取出的脂肪組織的全部量的一個單位脂肪組織是一部分取出的脂肪組織。
本文所用的“干細胞”是指多能細胞，其有分化成多種其它細胞類型的能力，具有一種或多種特殊功能，并且能夠自我更新。某些本文所公開的干細胞可以是多能的。
本文所用的“加工的脂肪抽吸物”(PLA)是指已經被加工過以將活性細胞組分(例如含有干細胞的組分)與成熟脂肪細胞和結締組織分離開的脂肪組織。PLA通常是指通過洗滌和將細胞與脂肪組織分離開而獲得的細胞團。細胞團一般是通過將細胞懸浮液離心，以使細胞聚集在離心容器的底部而獲得的。
在實施本發明公開的方法過程中，施用給患者的細胞是從脂肪組織獲得的。脂肪組織可通過本領域技術人員已知的任何方法獲得。例如，可通過抽吸輔助脂肪抽吸術、超聲輔助脂肪抽吸術和脂肪切除術將脂肪組織從患者中取出。此外，操作可包括這些技術的組合，例如脂肪切除術與抽吸輔助的脂肪抽吸術的組合。因為打算將組織或某些其級份再植入到患者體內，所以應當以這樣的方式收集脂肪組織，即保持細胞組分的活力，將組織被可能的傳染性生物體例如細菌和/或病毒污染的可能性降至最低。因此，組織提取應當以滅菌或無菌方式進行，以把污染降至最低。對于將脂肪組織從患者中取出，抽吸輔助脂肪抽吸術是可取的，因為它提供了侵害性最輕的收集組織的方法，將可能與其它技術例如超聲輔助脂肪抽吸術有關的干細胞損害的可能性降至最低。
對于抽吸輔助脂肪抽吸術，脂肪組織是這樣收集的將插管插入到患者中存在的脂肪組織貯庫內或者插入到脂肪組織貯庫附近，然后將脂肪抽吸到吸入裝置內。在一個實施方案中，可將小插管與注射器連接，并且可用手工力抽吸出脂肪組織。為了收集相對中等量的脂肪組織(例如0.1ml至幾百毫升脂肪組織)，使用注射器或其它類似裝置是可取的。采用這些較小裝置的操作的優點在于，操作僅用局部麻醉就可以進行，而不用全身麻醉。超出該范圍的較大體積的脂肪組織(例如大于幾百毫升)可能需要全身麻醉，這由供體以及進行收集操作的人決定。當希望取出較大體積的脂肪組織時，可在操作中使用較大的插管和自動抽吸裝置。
脂肪切除術操作包括但不限于這樣的操作，其中將含有脂肪組織的組織(例如皮膚)作為操作的附帶部分取出；也就是說，手術的主要目的是除去組織(例如在肥胖或美容手術中的皮膚)，其中脂肪組織與主要想除去的組織一起被取出。
從患者中取出的脂肪組織被收集到用以進一步加工的裝置內。如本文所公開的那樣，在一個實施方案中，裝置被設計成目的是專用于收集組織，以制備加工的脂肪組織細胞群體，包括干細胞和/或內皮前體細胞。在其它實施方案中，裝置可以是一般用于通過醫師進行提取操作來收集組織的任何常規裝置。
收集的組織的量將取決于多個變量，包括但不限于供體的體重指數、可進入的脂肪組織收獲位點的可用性、伴行和先前存在的藥物治療和病癥(例如抗凝血治療)和收集組織的臨床目的。用造血干細胞移植物(用于再生接受者的血細胞形成能力的骨髓或臍帶血液衍生的干細胞)進行的實驗表明，植入物是細胞劑量依賴性的，并且具有閾值作用。因此，可能“越多越好”這一大體原則將在由其它變量所設定的限度內適用，并且可行的是，收獲將收集盡可能多的組織。
已經發現，從體瘦個體中提取的100ml脂肪組織的干細胞百分比大于從肥胖供體中提取的100ml脂肪組織的干細胞百分比(表1)。這反映了在肥胖個體中的增加的脂肪含量的稀釋效應。因此，根據本發明的一個方面，可取的是，與從體瘦患者中抽取的組織的量相比，從過重個體中獲得更大量的組織。這一觀察還意味著，本發明的應用不限于具有大量脂肪組織的個體。
表1體重指數對組織和細胞收量的影響
根據本發明進行治療的患者接受的干細胞濃度與采用脂肪組織或得自脂肪組織的干細胞的其它治療不同。因此，將從患者中取出的脂肪組織加工以改變施用給患者的干細胞濃度。在優選的本發明實施方案中，患者接受其濃度高于通常存在于脂肪組織移植物和其它類似的基于干細胞的治療中的干細胞濃度的干細胞。可將濃縮的干細胞在基本上不含成熟脂肪細胞和結締組織的包含脂肪衍生干細胞和/或內皮前體細胞的組合物中施用，或者，作為另一實例，可將濃縮的干細胞在具有提高的量的干細胞的包含一個單位脂肪組織的組合物中施用。本發明組合物包含濃度大于在等單位未加工的脂肪組織中發現的干細胞濃度的干細胞。在一些實施方案中，組合物具有這樣的細胞組成，其中至少0.1％的細胞是干細胞。在其它實施方案中，組合物具有這樣的細胞組成，其中干細胞占細胞組分的約2％-12％。高濃度，例如最高達100％的干細胞也包含在不同組合物中。組合物可包含另外的組分，例如在本文中描述的細胞分化因子、生長促進劑、免疫抑制劑或醫療裝置。為了獲得其中組合物主要含有一種類型細胞(例如脂肪衍生干細胞或脂肪衍生內皮前體細胞)的組合物，可采用適于分離不同細胞類型的任何方法，例如使用能識別和結合存在于干細胞或內皮前體細胞上的抗原的細胞特異性抗體。
對于大部分應用，需要除去活性細胞群體制備物中的包含成熟脂肪的脂肪組織的脂肪細胞組分。這一般是通過一系列洗滌和解聚步驟實現的，其中首先洗滌組織以減少游離脂質(從破碎的脂肪細胞中釋放出來)和周圍血液成分(從在組織收獲期間切斷的血管中釋放出來)，然后解聚以將完整的脂肪細胞和其它細胞群體從結締組織基質中釋放出來。在一些實施方案中，將整個脂肪細胞組分或非干細胞組分與脂肪組織的干細胞組分分離開。在其它實施方案中，僅將一部分或幾部分脂肪細胞組分與干細胞分離開。因此，在一些實施方案中。可將干細胞與內皮前體細胞一起施用。
洗滌是任選、但優選的步驟，其中將組織與溶液混和以洗去游離脂肪和單細胞組分例如在血液中的單細胞組分，留下完整的脂肪組織片段。在一個實施方案中，將從患者中取出的脂肪組織與等滲鹽水或其它生理溶液(例如Baxter Inc的Plasmalyte或Abbott Labs的Normoso)混合。可通過本領域技術人員已知的任何方法，包括但不限于過濾、傾析、沉降或離心將完整的脂脂肪組織片段與游離脂質和細胞分離開。在舉例說明的本發明實施方案中，如本文所述，通過使用放置在組織收集容器內的濾器來將脂肪組織與非脂肪組織分離開。在其它實施方案中，使用組織收集容器來將脂肪組織與非脂肪組織分離開，其中所述容器使用傾析、沉積和/或離心技術來分離物質。
然后使用任何常規技術或方法將完整的組織片段解聚，這些技術或方法包括機械力(切碎力或剪切力)，用一種或組合的蛋白酶例如膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、如U.S.專利5,952,215中公開的釋放酶(liberase)H1和胃蛋白酶進行酶消化或機械和酶方法的組合。例如，可通過以下方法將完整組織片段的細胞組分解聚使用膠原酶介導的脂肪組織離解的方法，該方法類似于如在U.S.專利5,372,945中公開的用于收集脂肪組織中的微血管內皮細胞的方法。可用于本發明的使用膠原酶的其它方法公開在U.S.專利5,830,714和5,952,215，以及Williams，S.K.，S.McKenney，等人，(1995).“Collagenase lot selection andpurification for adipose tissuedigestion.”Cell Transplant 4(3)281-9中。類似地，可使用中性蛋白酶來代替膠原酶，如在Twentyman，P.R.和J.M.Yuhas(1980).“Use of bacterial neutralprotease fordisaggregation of mouse tumours and multicellular tumor spheroids.”Cancer Lett 9(3)225-8中公開的方法。此外，方法可采用酶的組合，例如膠原酶與胰蛋白酶的組合，如在Russell，S.W.，W.F.Doe，等人，(1976).“Inflammatory cells in solid murine neoplasms.I.Tumordisaggregation and identification of constituent inflammatory cells.”IntJ Cancer 18(3)322-30中公開的方法；或酶例如胰蛋白酶與機械離解的組合，如在Engelholm，S.A.，M.Spang-Thomsen，等人(1985).“Disaggregation of human solid tumours by combined mechanical andenzymatic methods.”Br J Cancer 51(1)93-8中公開的方法。
然后，通過減少成熟脂肪細胞的存在，可由解聚的組織片段獲得活性細胞群體(加工的脂肪細胞抽吸物)。讓其中脂肪組織被解聚的加工的脂肪抽吸物與液體的懸浮液流到另一容器例如細胞收集容器中。通過使用泵，例如蠕動泵，懸浮液可流經一個或多個導管以到達細胞收集容器，其中泵將懸浮液從組織收集容器中抽吸出來，并驅動懸浮液到達細胞收集容器。其它實施方案可使用重力或真空，同時保持封閉的系統。分離懸浮液中的細胞可通過以下技術來實現浮力密度沉降、離心、淘析、有差別的與固相的粘著和從固相上洗脫、抗體介導的選擇、電荷的不同；免疫磁性珠、熒光激活細胞分選(FACS)或其它技術。這些不同技術以及進行這些技術的裝置的實例可參見emstreet，G.P.，3rd，P.G.Enoch,等人，(1980).“Tissue disaggregation of human renalcell carcinoma with further isopyknic and isokinetic gradientpurification.”Cancer Res 40(4)1043-9；Schweitzer，C.M.，van,等人，(1995).“Isolation and culture of human bone marrow endothelial cells.”Exp Hematol 23(1)41-8；Gryn，J.，R.K.Shadduck，等人，(2002).“Factorsaffecting purification of CD34(+)peripheral blood stem cells using theBaxter Isolex 300i.”J Hematother Stem Cell Res 11(4)719-30；Prince，H.M.，J.Bashford,等人，(2002).“Isolex 300i CD34-selected cells tosupport multiple cycles of high-dose therapy.”Cytotherapy 4(2)137-45；Watts，M.J.，T.C.Somervaille,等人，(2002).“Variable product purityand functional capacity after CD34 selectiona direct comparison of theCliniMACS(v2.1)and Isolex 300i(v2.5)clinical scale devices.”Br JHaematol 118(1)117-23；Mainwaring，G.和A.F.Rowley(1985).“Separation of leucocytes in the dogfish(Scyliorhinus canicula)usingdensity gradient centrifugation and differential adhesion to glasscoverslips.”Cell Tissue Res 241(2)283-90；Greenberg，A.W.和D.A.Hammer(2001).“Cell separation mediated by differential rollingadhesion.”Biotechnol Bioeng 73(2)111-24；和U.S.專利6,277,060；6,221,315；6,043,066；6,451,207；5,641,622；和6,251,295。在舉例說明的實施方案中，使用旋轉膜濾器將懸浮液中的細胞與懸浮液的其它細胞組分分離開。在其它實施方案中，使用離心機將懸浮液中的細胞與細胞組分分離開。在一個這樣的示例性實施方案中，細胞收集容器可以是其結構適于放置在離心機內(例如用手放置或者采用自動系統放置)的柔性袋。在其它實施方案中，不使用柔性袋。如本文所述，離心后，細胞組分形成團，然后可用緩沖溶液將細胞團重新懸浮，這樣可讓細胞通過一個或多個導管到達混和容器。可通過任何合適的技術提供重懸液體。例如，可將緩沖液注射到細胞收集容器的端口中，或者細胞收集容器可包括緩沖液的儲備物，可通過破壞儲備物來將緩沖液與細胞團混和。當使用旋轉膜濾器時，重懸是任選的，因為分離操作之后，細胞保留在液體中。
雖然一些本發明實施方案涉及將脂肪組織完全解聚以將活性細胞與成熟脂肪細胞和結締組織分離開的方法，但是另外一些本發明實施方案涉及其中脂肪組織僅部分解聚的方法。例如，部分解聚可用一種或多種酶來進行，其中在酶把組織完全解聚的時間之前，將酶從至少一部分脂肪組織中取出。這樣的方法可需要較少的加工時間。
在一個具體實施方案中，將組織用無菌緩沖等滲鹽水洗滌，與膠原酶以足以提供充分解聚的膠原酶濃度、溫度和時間培養。在優選的實施方案中，所用的膠原酶應當得到相關機構(例如美國食品和藥品監督管理局)的批準應用于人。合適的膠原酶制劑包括重組和非重組膠原酶。非重組膠原酶可得自F.Hoffmann-La Roche Ltd，Indianapolis，IN和/或Advance Biofactures Corp.，Lynbrook，NY。重組膠原酶還可以按照U.S.專利6,475,764中公開的方法獲得。
在一個實施方案中，溶液含有濃度為約10μg/ml-約50μg/ml的膠原酶，并且在約30℃-約38℃培養約20分鐘-約60分鐘。這些參數將根據膠原酶的來源而改變，通過經驗實驗優化，以確證該系統在合適的時間框架中提取所需細胞群體方面是有效的。特別優選的濃度、時間和溫度是將20μg/ml膠原酶(Blendzyme 1，Roche)在約37℃培養45分鐘。在特別優選的實施方案中，所用的膠原酶得到了相關機構(例如美國食品和藥品監督管理局)的批準應用于人。所用的膠原酶應當不含微生物和污染物例如內毒素。
解聚后，可將活性細胞群體洗滌/沖洗以除去添加劑和/或解聚加工的副產物(例如膠原酶和新釋放出的游離脂質)。然后可通過離心或上述本領域技術人員已知的其它方法將活性細胞群體濃縮。這些加工后洗滌/濃縮步驟可單獨或同時施行。
在一個實施方案中，通過讓細胞群體連續流過旋轉膜系統或類似系統例如在U.S.專利5,034,135和5,234,608中公開的系統來將細胞濃縮和除去膠原酶。
除了上述方法以外，還有很多洗滌后方法可用于進一步純化活性細胞群體。這些包括正選擇(選擇目標細胞)、負選擇(選擇性地除去不需要的細胞)或其組合。
在一個實施方案中，在所有細胞洗滌步驟之后，將具有所選粘著性質的固相材料插入到系統內，這種粘著性質使得對于加工的脂肪抽吸物內的細胞亞群體的粘著和/或洗脫能力有差別。該一般方法已經在臨床輸血中使用過，其中使用具有不同捕獲白細胞能力的濾器來除去摻雜在白血病中的輸入的紅細胞(Soli，M.，等人，A multicentre evaluationof a new filtration protocol for leucocyte depletion of high-haematocritred blood cells collected by an automated blood collection system.VoxSang，2001.81(2)p.108-12；Smith，J.W.，Apheresis techniques andcellular immunomodulation.Ther Apher，1997.1(3)p.203-6)。該類型濾器是通過Pall Bedical(Leukogard RS and Purecell RCQ)和Asahi(RS2000)分配。差別粘著還已用于單核細胞的正選擇(Berdel，W.E.，等人，Purification of human monocytes by adherence to polymericfluorocarbon.Characterization of the monocyte-enriched cell fraction.Immunobiology，1982.163(5)p.511-20)和表皮干細胞的正選擇(Bickenbach，J.R.和E.Chism，Selection and extended growth of murineepidermal stem cells in culture.Exp Cell Res，1998.244(1)p.184-95)。在該實施方案中，讓加工的脂肪抽吸物在預先確定的流動和緩沖條件下通過濾器，以提高目標細胞與不需要的細胞群體的差別粘著。對于正選擇，濾器材料和條件將使得目標細胞優先粘著，而不需要的材料能自由地通過濾器，并且可用過量緩沖液洗去。通過改變條件例如流速、pH、離子強度和/或粘著所需的陽離子存在，可將目標細胞從濾器上洗脫下來。濾器材料可呈三維網狀物、小顆粒填充盒、中空纖維或具有高表面積的其它構造形式。在優選的實施方案中，該濾器裝置可以是如附圖1所示的一次性整體部分，并且將插到附圖4所示的裝置內。設置和裝置都必須根據具體附圖所示的實例進行輕微改變；附圖1包括濾器和遮蓋物，附圖4使得插入保持封閉、無菌流動線路所需的濾器遮蓋物和管線(包括閥)。或者，可分別用裝置配件和濾器/遮蓋物代替混和室(附圖4的部件108；附圖1的部件30)。
差別粘著方法的另一個實施方案包括使用能夠識別在目標和不需要的細胞上差別表達的表面分子的抗體和/或抗體組合。基于特異細胞表面標志物(或其組合)的表達而做的選擇是另一種常用技術，其中抗體附著(直接或間接)在固相載體結構上(Geiselhart，A.，等人，Positiveselection of CD56+lymphocytes by magnetic cell sorting.Nat Immun，1996.15(5)p.227-33；Formanek，M.，等人，Magnetic cell separation forpurification of human oral keratinocytesan effective method forfunctional studies without prior cell subcultivation.Eur ArchOtorhinolaryngol，1998.255(4)p.211-5；Graepler，F.，U.Lauer和M.Gregor，Magnetic cell sorting for parietal cell purification using a newmonoclonal antibody without influence on cell function.J BiochemBiophys Methods，1998.36(2-3)p.143-55；Kobari，L.，等人，CD133+cellselection is an alternative to CID34+cell selection for ex vivo expansionof hematopoieticstem cells.J Hematother Stem Cell Res，2001.10(2)p.273-81；Mohr，M.，等人，，Simultaneous immunomagnetic CD34+cellselection and B-eell depletion in peripheral blood progenitor cell samplesof patients suffering from B-cell non-Hodgkin′s lymphoma.Clin CancerRes，2001.7(1)p.51-7；和Pugh，R.E.，等人，CD19 selection improves thesensitivity of B cell lymphom detection.J Hematother，1998.7(2)p.159-68)。該方法在其中例如殘余白細胞可通過使用CD45抗體來除去的正和負選擇中都有明顯應用。類似地，Reyes等人已使用抗體的復雜混合物來從人骨髓中選擇多能成熟祖細胞(Reyes，M.，等人，Purificationand ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermalprogenitor cells.Blood，2001.98(9)p.2615-25)。例如，可特異性地與脂肪細胞結合的抗體例如AP2(Joyner，C.J.，等人，Development of amonoclonal antibody to the aP2 protein to identify adipocyte precursorsin tumours of adipose differentiation.Pathol Res Pract，1999.195(7)p.461-6)可用于優先除去殘余的脂肪細胞(包括不成熟的脂肪細胞和脂肪母細胞)。正選擇可通過使用對目標細胞群體有特異性的抗體來應用。例如，Quirici等人已使用抗神經生長因子受體的抗體來富集骨髓衍生的間充質干細胞(Quirici，N.，等人，Isolation of bone marrowmesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies.Exp Hematol，2002.30(7)p.783-91)。
在基于抗體的方法的一個實施方案中，將抗體(例如AP2)或抗體混合物(例如AP2、CD3、CD19、CD11b)加到加工的脂肪抽吸物中。本領域技術人員知道很多其它抗體和抗體組合，并且提供這些抗體只是為了舉例說明。培養后，在預先確定以讓這些抗體與其相應抗原最佳結合的條件下，讓細胞通過旋轉膜濾器或細胞洗滌室的其它實施方案來洗滌細胞，以除去未結合的過量抗體。然后讓細胞通過固相結構，該固相結構類似于上面的實施方案中描述的結構，但是固相已附著了二級抗體，該二級抗體能夠以高親和力與結合在細胞表面上的初級抗體附著。目標細胞，例如脂肪組織衍生的干細胞將自由地通過該濾器，這是因為沒有表達被所選抗體(抗體混合物)識別的細胞表面抗原，由此產生負選擇系統所致。在該實施方案中，對一次性設置(附圖3)和裝置(附圖4)進行非常類似于上面實施方案所述的較小改變。
通過包括促進細胞與固相載體脫離的第三種添加劑，可以以非常類似的方式實現抗體介導的正選擇實施方案。在該實施方案中，可加入酶木瓜蛋白酶或cymopapain以裂解掉抗體分子和將細胞從固相載體上釋放下來(Civin，C.I.，等人，Positive stem cell selection--basic science.Prog Clin Biol Res，1990.333(387)p.387-401；討論402)。另一實施方案是如Tseng-Law等人在US專利6,017,719中所述，使用能與細胞表面抗原競爭結合抗體的特異性肽。
在另一個實施方案中，可將細胞團重懸，在液體材料上面(下面)分層以形成連續或不連續的密度梯度，并放置在離心機中以基于細胞密度來分離細胞群體。適于形成這樣的梯度的介質的實例包括Percoll和Ficoll-Paque(Qian，X.，L.Jin，和R.V.Lloyd，Percoll Density Gradient-Enriched Populations of Rat Pituitary CellsInterleukin 6 Secretion.Proliferative Activity，and Nitric Oxide Synthase Expression.EndocrPathol，1998.9(1)p.339-346；Smits，G.，W.Holzgreve，和S.Hahn，Anexamination of different Percoll density gradients and magneticactivated cell sorting(MACS)for the enrichment of fetal erythroblastsfrom maternal blood.Arch Gynecol Obstet，2000.263(4)p.160-3)或Ficoll-Paque(Lehner，M.和W.Holter，Endotoxin-free purification ofmonocytes for dendritic cell generation via discontinuous densitygradient centrifugation based on diluted Ficoll-Paque Plus.Int ArchAllergy Immunol，2002.128(1)p.73-6)。Van Merris等人(Van Merris，V.，等人，Separation of bovine bone marrow into maturation-relatedmyeloid cell fractions.Vet Immunol Immunopathol，2001.83(1-2)p.11-7)采用不連續的三步Percoll梯度來根據其成熟度分離牛髓樣細胞。該實施方案將能夠把一些殘余的血細胞群體和不成熟的脂肪細胞(原脂肪細胞)從細胞群體中分離出來。
在類似的實施方案中，還可以使用連續流動方法例如apheresis(Smith，J.W.，Apheresis techniques and cellular immunomodulation.Ther Apher，1997.1(3)p.203-6)和淘析(采用或不采用反流)(Lasch，J.，G.Kullertz，和J.R.Opalka，Separation of erythrocytes into age-relatedfractions by density or size？Counterflow centrifugation.Clin Chem LabMed，2000.38(7)p.629-32；Ito，Y.和K.Shinomiya，A new continuous-flow cell separation method based on cell densityprinciple，apparatus，and preliminary application to separation of human buffy coat.J ClinApheresis，2001.16(4)p.186-91；Dlubek，D.，等人，Enrichment ofnormal progenitors in counter-flow centrifugal elutriation(CCE)fractions of fresh chronic myeloid leukemialeukapheresis products.EurJ Haematol，2002.68(5)p.281-8)。這樣的機制已用于分離血細胞，包括基于成熟度來分離紅細胞(Lasch，J.，G.Kullertz，和J.R.Opalka，Separation of erythrocytes into age-related fractions by density or size？Counterflow centrifugation.Clin Chem Lab Med，2000.38(7)p.629-32)，并且應用該一般方法來進一步從加工的脂肪抽吸物中純化所需細胞對于本領域技術人員來說將是顯而易見的。該實施方案可能需要改變附圖4中的裝置和一次性設置(附圖3)，這樣給該裝置集成了能夠提供apheresis或淘析能力的另一裝置。
與塑料粘著，然后是一段短時間的細胞擴增也已用于骨髓衍生的成熟干細胞群體(Jaiswal，N.，等人，Osteogenic differentiation of purified，culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.J CellBiochem，1997.64(2)p.295-312；Hou，L.，等人，Study of in vitroexpansion and differentiation into neuron-like cells of human umbilicalcord blood mesenchymal stem cells.Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi.2002.23(8)p.415-9)。該方法使用培養條件以優先擴增一個群體，同時其它群體由于缺乏所需生長條件而保持不變(并且由于被生長的所需細胞稀釋而減少)或喪失。Sekiya等人已描述了可在這方面用于骨髓衍生干細胞的條件(Sekiya，I.，等人，Expansion of Human Adult Stem Cells fromBone Marrow StromaConditions that Maximize the Yields of EarlyProgenitors and Evaluate Their Quality.Stem Cells，2002.20(6)p.530-41)。該方法(采用或不采用與組織培養塑料的差別粘著)可用于本發明的另一個實施方案中。在該實施方案中，將細胞從附圖4所示的裝置中取出，置于提供細胞培養組分的另一裝置內。該裝置可呈常規實驗室組織培養器或生物反應器型裝置，例如Tsao等人在US專利6,001,642中描述的裝置和Armstrong等人在US專利6,238,908中描述的裝置形式。在另一個實施方案中，組合部件(附圖4所示裝置的部件108；附圖3中的部件30)可用能夠進行加工的脂肪抽吸物的短期粘著和/或細胞培養的生物反應器部件代替。該實施方案將容許給裝置整合生物反應器部件，并且省去了將細胞從該裝置中取出和置于另一裝置內的需要。
在一個實施方案中，將活性細胞群體直接施用到患者體內。換句話說，將活性細胞群體(例如干細胞和/或內皮前體細胞)施用給患者，在施用給患者之前不用從系統中取出或暴露于系統的外部環境中。提供封閉的系統降低了施用給患者的生物材料被污染的可能性。因此，在封閉的系統中加工脂肪組織提供了優于現有方法的優點，因為活性細胞群體更有可能是無菌的。在這樣的實施方案中，干細胞和/或內皮前體細胞暴露于外部環境或從系統中取出的唯一時間是，將細胞抽到施用裝置內和施用給患者時。在一個實施方案中，施用裝置也可以是封閉系統的一部分。因此，在這些實施方案中使用的細胞沒有進行培養加工或冷凍保存。
已經如上所述濃縮過的活性細胞可不用進一步加工直接施用給患者，或者可在與其它組織或細胞混和后施用給患者。在一些實施方案中，將濃縮的活性細胞(例如干細胞或內皮前體細胞)與沒有進行類似加工的一個或多個單位脂肪組織混和。因此，通過實施本發明方法，可將具有高濃度活性細胞的包含脂肪組織的組合物施用給患者。不同脂肪組織單位的體積可能不同。例如，一個單位脂肪組織體積可能比另一個單位脂肪組織的體積大至少25％。此外，一個單位脂肪組織體積可能比另一個單位脂肪組織的體積大至少50％，例如至少100％，甚至150％或更多。另外，所需組合物可通過將具有濃縮的活性細胞群體(其可以是含有活性細胞的細胞團)的第一個單位脂肪組織與一個或多個其它單位脂肪組織混和來獲得。在一些實施方案中，這些其它單位不具有高濃度的干細胞，或者換句話說，它們的活性細胞濃度小于包含在第一個單位脂肪組織中的活性細胞濃度。在其它實施方案中，一個單位是含有例如高濃度活性細胞的冷凍保存材料。
在其它實施方案中，將至少一部分活性細胞群體貯存以用于以后植入/輸入。可將細胞群體分成一個以上的等份試樣，這樣將一部分干細胞和/或內皮前體細胞群體保存以用于以后施用，而將一部分細胞群體立即施用給患者。將所有或一部分細胞在細胞庫中進行中到長期貯存也在本發明范圍內，發明名稱為“得自非造血組織的非胚胎細胞的保存”的于2002年9月12日提交的第10/242,094號U.S.專利申請公開了有關內容，該申請要求屬于同一申請人的于2001年9月14日提交的第60/322,070號U.S.臨時專利申請的優先權，并且該申請引入本文以供參考。在這樣的實施方案中，可將細胞與一個或多個單位的新鮮或保存的脂肪組織混和，以提供含有干細胞，并且干細胞的濃度高于加工前的單位脂肪組織的組合物。
在加工結束時，可將濃縮的細胞負載到遞送裝置例如注射器中，以通過皮下、靜脈內、肌內或腹膜內技術放置在接受者體內。換句話說，可通過本領域技術人員已知的任何技術將細胞置于患者體內，例如可將細胞注射到血管內以全身或局部遞送，注射到組織(例如心肌或骨骼肌)內，注射到真皮內(皮下)，注射到組織空間(例如心包或腹膜)內，或注射到多個組織(例如尿道周圍區域)內或其它位置。優選的實施方案包括通過針頭或導管來放置，或者通過與添加劑例如預先形成的基質有關的直接手術植入來放置。
可將活性細胞群體單獨施用或者與其它細胞，組織，組織片段，去礦質的骨，生長因子例如胰島素，或藥物例如thiaglitazone類藥物，生物活性或惰性化合物，可重吸收的塑料支架或其它用于提高細胞群體的遞送、效力、耐受性或功能的添加劑。還可以通過以下方法修飾細胞群體插入DNA，或放置在細胞培養物中以改變、提高或補充細胞功能，從而用于美容、結構或治療目的。例如，用于干細胞的基因轉移技術是本領域技術人員已知的，例如公開在Mosca，J.D.，J.K.Hendricks，等人，(2000).“Mesenchymal stem cells as vehicles for genedelivery.”Clin Orthop(379 Suppl)S71-90中，并且可包括病毒轉染技術，更具體來說，腺相關病毒基因轉移技術，例如公開在Walther，W.和U.Stein(2000).“Viral vectors for gene transfera review of their usein the treatment of human diseases.”Drugs 60(2)249-71，和Athanasopoulos，T.，S.Fabb，等人，(2000).“Gene therapy vectors basedon adeno-associated viruscharacteristics and applications to acq uiredand inherited diseases(review).”Int J Mol Med 6(4)363-75中。也可以按照Muramatsu，T.，A.Nakamura，等人，(1998).“In vivo electroporationa powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues ofliving animals(Review).”Int J Mol Med 1(1)55-62中公開的方法實施非基于病毒的技術。
在一個方面，可將細胞與脂肪組織的未加工片段混和，并使用大號針頭或脂肪抽吸插管將其放回接受者體內。轉移自體固有脂肪，并且不補充加工的細胞是整形和整復手術中的常用操作。然而，結果可能是不可預知的，因為轉移的材料往往會迅速重吸收，導致不穩定的移植物。例如基本上不含成熟脂肪細胞的本發明脂肪組織衍生細胞可提供支持移植物延長的存活和功能的環境。
在另一個方面，可將細胞群體放置在接受者體內，并由可重吸收的塑料護套例如由MacroPore Biosurgery，Inc.生產的護套環繞(U.S.專利6,269,716和5,919,234)。在該設置中，護套可防止肌肉和其它軟組織脫出到骨折區域內，由此安放了加工的脂肪組織衍生細胞以促進骨折的修復。在這方面，通過補充另外的組分例如原成骨蛋白生長因子或生物或人工支架，可提高有益作用。
在另一個方面，可將細胞與編碼原成骨蛋白生長因子的基因結合，其中所述原成骨蛋白生長因子使得細胞能夠在骨愈合或融合期間起它們自己的生長因子源的作用。基因的加入可通過本領域已知的任何技術來進行，包括但不限于腺病毒轉導、“基因槍”、脂質體介導的轉導和逆轉錄病毒或慢病毒屬病毒介導的轉導。
特別是，當把細胞和/或含有細胞的組織施用給不是由其獲得該細胞和/或組織的患者的患者時，可給接受該細胞和/或組織的患者施用一種或多種免疫抑制劑，以減輕，優選防止移植物排斥作用。適用于本發明方法的免疫抑制劑的實例包括能抑制T-細胞/B-細胞共同刺激途徑的活性劑，例如在U.S.專利出版物20020182211中公開的干擾T-細胞和B-細胞經由CTLA4和B7途徑的偶聯的活性劑。其它實例包括環孢菌素、myophenylate mofetil、雷帕霉素和抗胸腺細胞球蛋白。
在本發明的一些實施方案中，將細胞與一種或多種細胞分化劑例如細胞因子和生長因子一起施用給患者。不同細胞分化劑的實例公開在以下文獻中Gimble，J.M.，C.Morgan，等人，(1995).“Bonemorphogenetic proteins inhibit adipocyte difierentiation by bonemarrow stromal cells.”J Cell Biochem 58(3)393-402；Lennon，D.P.，S.E.Haynesworth，等人，(1995).“A chemically defined medium supports invitro proliferation and maintains the osteochondral potential of ratmarrow-derived mesenchymal stem cells.”Exp Cell Res 219(1)211-22；Majumdar，M.K.，M.A.Thiede，等人，(1998).“Phenotypic and functionalcomparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs)and stromal cells.”J Cell Physiol 176(1)57-66；Caplan，A.I.和V.M.Goldberg(1999).“Principles of tissue engineered regeneration ofskeletal tissues.”Clin Orthop(367 Suppl)S12-6；Ohgushi，H.和A.I.Caplan(1999).“Stem cell technology and bioceramicsfrom cell to geneengineering.”J Biomed Mater Res 48(6)913-27；Pittenger，M.F.，A.M.Mackay，等人，(1999).“Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells.”Science 284(5411)143-7；Caplan，A.I.和S.P.Bruder(2001).“Mesenchymal stem cellsbuilding blocks for molecularmedicine in the 21st century.”Trends Mol Med 7(6)259-64；Fukuda，K.(2001).“Development of regenerative cardiomyocytes from mesenchymalstem cells for cardiovascular tissue engineering.”Artif Organs 25(3)187-93；Worster，A.A.，B.D.Brower-Toland，等人，(2001).“Chondrocyticdifierentiation of mesenchymal stem cells sequentially exposed totransforming growth factor-betal in monolayer and insulin-like growthfactor-I in a three-dimensional matrix.”J Orthop Res 19(4)738-49；Zuk，P.A.，M.Zhu，等人，(2001).“Multilineage cells from human adiposetissueimplications for cell-based therapies.”Tissue Eng 7(2)211-28；和Mizuno，H.，P.A.Zuk，等人，(2002).“Myogenic differentiation byhuman processed lipoaspirate cells.”Plast Reconstr Surg 109(1)199-209；討論210-1。
通過給患者施用干細胞和/或內皮前體細胞，可治療多種疾病，包括但不限于骨相關病癥、疾病或損傷，包括慢性/未愈合骨折、骨質疏松(與年齡有關或者化療引起的)、遺傳骨疾病(成骨不全)；與脂肪有關的病癥或疾病；肝臟相關疾病、病癥或損傷，包括肝臟衰竭、乙型肝炎和丙型肝炎；心肌梗塞，包括心臟病發作或慢性心力衰竭；腎疾病或腎損傷；視網膜疾病或損傷或壞死；傷口愈合(例如手術后傷口愈合或糖尿病性潰瘍愈合)；創傷性和遺傳性骨骼肌病癥；創傷性和自身免疫性軟骨和關節修復；肺損傷；糖尿病；腸病癥；神經系統病癥、疾病或損傷，例如中樞神經系統病癥、疾病或損傷，包括脊柱損傷、帕金森病、阿爾茨海默氏病和中風。
還可以出于美容原因將干細胞施用給患者，例如提高或改善身體特征，包括減少皺紋、提高器官質量等。
附圖1顯示了用于將脂肪組織從患者中取出的組織取出系統。在寬范圍的實施方案中，組織取出系統10包括組織收集容器12和與組織收集容器12連接的混和容器30。在混和容器30與組織收集容器12直接的連接優選限定了封閉系統，其中從組織收集容器12傳遞到混和容器30的組織沒有暴露于外部環境。系統10還包括出口32，出口32的結構使得濃縮的干細胞能從組織收集系統10中取出以施用給患者。組織收集容器12包括組織收集入口14和濾器16。濾器16安放在容器內，并且其結構使得在例如將組織從患者中取出時，保留脂肪組織和讓非脂肪組織通過。更具體來說，在開始收獲脂肪組織期間或者—在另一個實施方案中—在收獲脂肪組織之后，濾器16讓游離脂質、血液和鹽水通過，而保留脂肪組織片段。在這方面，濾器16包括多個孔，這些孔具有相同或不同的孔徑，并且孔徑為約20μm-5mm。在優選的實施方案中，濾器是醫用級的聚酯網狀物，其厚度約為200μm，孔徑約為265μm，并且約有47％的開放面積。該材料在洗滌期間保留組織，但是在組織解聚之后讓細胞通過網孔。因此，當從患者中抽吸出組織時，可將非脂肪組織與脂肪組織分離開。混和容器30包括添加口31，添加口31的結構使得使用者能夠將添加劑施加到混和容器30中以與包含在混和容器30中的干細胞混和。在優選的實施方案中，組織收集容器12的容量應當是這樣的，其能夠在濾器內保留約1升組織片段。在其它實施方案中，組織收集容器12可具有保留更大或更小體積的組織片段的容量；例如，組織收集容器可具有貯存至少100mL脂肪組織片段，最高達約2L脂肪組織片段的容量。
參見附圖1的系統10中存在的其它特征，組織入口14經由管線22與插管24連接以限定組織取出線。在該舉例說明的實施方案中，插管24是集成的、一次性使用的脂肪抽吸導管，并且管線是柔性管線。插管具有能夠插入到患者體內以將脂肪組織從患者中取出的大小。在該系統中使用的管線22應當能夠經得起與抽吸輔助脂肪抽吸術有關的負壓以減小塌陷的可能性。組織收集容器12還包括安放在濾器16的組織入口14對面一側上的抽吸口18。抽吸口18的結構使得其與可手動或自動操作的抽吸裝置20連接。抽吸裝置20可以是注射器，或者可以是電動真空等。抽吸裝置20應當能夠提供足夠的負壓以使容器12和插管24從患者中抽吸出組織。如附圖所示，抽吸裝置20經由管線22與抽吸口18連接。
如附圖所示，組織取出系統10還包括位于組織收集容器12與混和容器30之間的細胞收集容器26。細胞收集容器26位于系統10內部，這樣細胞例如干細胞從組織收集容器12流到細胞收集容器26中，然后再流到混和容器30中。在該舉例說明的實施方案中，細胞收集容器26經由細胞收集口48與組織收集容器12。在系統10的一個實施方案中，細胞收集容器26包括促進細胞在懸浮液中分離的細胞濃縮器(未顯示)。細胞濃縮器的一個實例是離心機裝置，該裝置可根據例如細胞的大小和密度來將細胞與其它材料分離開。另一實例是如上所述的旋轉膜濾器，如附圖所示，系統10還包括濾器28，濾器28的結構使得細胞能從細胞收集容器26到達混和容器30，和防止例如比細胞大的材料通過。細胞收集容器26還包括通向廢棄物容器36的出口。包含在細胞收集容器26中的材料的流動方向由一個或多個閥的位置決定，閥可控制材料是流向廢棄物容器36還是流向混和容器30。
在該舉例說明的實施方案中，細胞濾器28包括直徑或長度小于200μm的多個孔。在一些實施方案中，孔可具有小于200μm的直徑。在其它實施方案中，孔具有20-200μm的直徑。細胞濾器28可與細胞收集容器26隔開，或者可包含在細胞收集容器26內。細胞濾器28還可以在細胞收集容器26中集成形成。系統10的另外的實施方案不包括濾器28。細胞收集容器可由任何合適的材料制成。例如，細胞收集容器26可以是塑料袋，例如在血庫中常用于加工血液的塑料袋；或者在其它實施方案中，其可以是在結構上剛性的。在一些實施方案中，細胞收集容器26可包括組分制備室和細胞洗滌/分離室。
在一些實施方案中，組分制備室包括一個或多個用于加入下述物質的口可促進用于施用給患者的干細胞分離過程的物質，例如如上所述的生長因子或用于重懸細胞的緩沖液。在這些實施方案中，組分制備室優選包括混和裝置，以將細胞和添加劑在容器中混和或攪拌。組分制備室還包括一個或多個用于將收集在其中的細胞取出的口。一個口可用于讓細胞朝著混和容器30流動。其它口可用于讓細胞或一部分細胞流向其它目標物例如植入材料，包括骨片，或流向培養或純化裝置。在一個實施方案中，細胞洗滌/分離室包括旋轉膜濾器部件，其可用作除離心機裝置以外的細胞濃縮器，或優選用作用以替代離心機裝置的細胞濃縮器。
如附圖所示，系統10還包括組織挽回管線34，其提供了從組織收集容器12到混和容器30的導管。因此，組織挽回管線34讓包含在組織收集容器12中的組織流向或將其導向混和容器30，在混和容器30中，可將組織與得自細胞收集容器26的細胞混和。在該舉例說明的實施方案中，組織挽回管線34延伸到組織容器12內以將包含在濾器16中的脂肪組織取出。使用一個或多個泵或抽吸裝置，經由組織挽回管線34讓組織通過或流過，以讓已經洗滌過，但是無需解聚的脂肪組織通過。
在一個實施方案中，系統10包括溫控裝置，該溫控裝置位于系統10中以調節包含在組織收集容器12中的材料的溫度。在一些實施方案中，溫控裝置是加熱器，在其它實施方案中，溫控裝置是冷卻器。在另外的實施方案中，溫控裝置能夠在加熱器與冷卻器之間切換。溫控裝置可以是調節包含在組織收集容器12中的脂肪組織的溫度的裝置，或者可以是用于改變正在遞送到組織收集容器12中的液體的溫度的裝置。已經發現，將脂肪組織加熱有助于促進組織解聚，從而提高活性細胞組分的分離。此外，在一些實施方案中，希望將一部分組織，優選活性細胞組分冷卻，以給細胞提供保護。即使將細胞輕微冷卻，也可以提供合適的保護，從而提高在加工期間的細胞存活。
如附圖所示，組織取出系統10的出口32是混和容器30的部件。在另外的實施方案中，出口32與混和容器30隔開。出口32優選包括維持組織取出系統10的密封結構的封閉部件，并且在一些實施方案中，出口32包括液體不能滲透的膜(例如液體和氣體不能滲透的膜)。出口32的結構應當能讓混和容器30中的組合物在合適的條件下到達患者。例如，如果使用注射器來抽出組合物，出口32應當能夠容納注射器的針頭，并且不影響系統或組合物的無菌性。在另外的實施方案中，如果出口與用以施用組合物，但是不抽出組合物的裝置，例如通過施加正壓以經由插管轉移組合物來施用組合物的插管連接時，出口32的配置應當能夠讓包含在混和容器30中的組合物流到插管內。在其它實施方案中，出口32可包括用以施用組合物的裝置，例如注射器針頭或用于通過施加正壓來施用組合物的插管，或者以密封系統方式與這樣的裝置連接。
如附圖所示，組織取出系統還包括廢棄物容器36，該容器用于從組織收集容器12收集廢棄物。在該舉例說明的實施方案中，廢棄物容器36的連接和位置還使得其能夠從細胞收集容器26接受廢棄物。還提供洗滌容器38，該洗滌容器38與洗滌管線39以流體能通過的方式連接，以將洗滌液體例如鹽水或任何其它合適的緩沖液經由洗滌口46遞送到組織收集容器12中。組織收集容器12還包括用于控制在組織收集容器12內的壓力的氣體入口40。在組織收集容器12上提供添加管線以容許將添加劑加到組織收集容器12中。根據本文所公開的方法，提供添加管線42以將一種或多種酶遞送到組織收集容器12中，從而有助于將活性細胞組分與包含在濾器16中的其余脂肪組織分離開。如附圖所示，添加管線42包括針頭44。針頭44可用于從合適的容器中接受酶。
附圖2和3顯示了組織取出系統10的部件的具體實施方案，其中同樣的數字代表同樣的部件。在附圖2和3的具體實施方案中，組織收集容器12包括當給容器施加抽吸時能保持其形式的殼體。更具體來說，組織收集容器12包括剛性殼體，例如由醫用級聚碳酸酯制成的殼體，其中含有由醫用級聚酯制成的，篩孔尺寸為275μm的大體圓錐形濾器袋。該剛性組織收集容器的大小可以是高約8英寸，直徑約5英寸；壁厚可以為約0.125英寸。圓柱體內部可具有以下入口兩個用于抽吸管線的口，兩個用于經由無菌進入技術連接的具有管線的口，以及用于經由橡膠隔膜讓針頭刺入的兩個口。可用不同材料、篩孔尺寸和口數目以及類型來實現相同功能。例如，小于100μm或大至幾千微米的篩孔尺寸可實現讓鹽水和血細胞通過，而保留脂肪組織聚集物和片段的同一目的。類似地，裝置目的可通過以下手段實現使用另一種剛性塑料材料，用非一次性多用途無菌插管代替一次性插管，或本領域技術人員已知的其它改進。然而，在組織取出系統10的其它實施方案中，組織收集容器12可包括可收縮的殼體，例如組織收集袋。在這樣的系統中，優選給這樣的袋提供支持物例如內部或外部框架，這樣的支持物有助于減小在給袋施加抽吸時袋塌陷的可能性。
為了減小在組織取出系統10中的污染，可在不同管線或導管上提供一個或多個夾子23，以控制材料經由管線向系統的不同部件的流動。夾子23使得使用者能有效地將組織取出系統10的不同區域密封。在優選的實施方案中，系統10的一個或多個部件是一次性的。在該實施方案中，避免重復使用部件有助于減小可能與反復使用不同部件有關的污染。此外，在一次性設置中提供部件具有能夠將所有部件在單一時間滅菌的優點，這可以顯著縮短實施本發明方法所需的時間。在全部或部分自動化的實施方案中，除了夾子23以外，或者作為夾子23的替代，可施用計算機控制的閥。
另外，組織取出系統10可包括另外的裝置或部件，所述裝置或部件使得能夠測定保留在濾器16中的材料的體積，以記錄關于提取或加工操作的書面信息，或執行其它補充功能例如在操作期間將裝置附著在支架或基床上。
組織取出系統10的部件應當由這樣的材料組成，它們不與生物液體或組織反應，并且不與加工生物液體和組織所用的物質反應。此外，制造各部件的材料應當能夠經得起滅菌處理，例如高壓滅菌和放射滅菌，包括但不限于β-或γ-放射。管線和插管柄可由任何合適的材料例如聚乙烯制成。插管可由不銹鋼制成。
根據本發明，組織取出系統10提供了適于取出、加工和施用存在于脂肪組織中的干細胞的封閉系統。可將該系統放置在患者旁邊以取出脂肪組織，并且可加工組織而無需將組織從該系統中取出來。因此，系統可給患者提供富含新鮮干細胞的組合物，并且降低了與培養或保存干細胞有關的危險性。
根據本文的公開內容，從患者中提取組織的方法可包括以下步驟(i)給患者進行常規脂肪抽吸術的準備；(ii)將插管和組織取出系統從包裝中取出來，放在無菌區域；(iii)將脂肪抽吸泵(具有常規捕集器和在線微生物濾器)與從組織收集容器引出的膠管接合器連接；(iv)確保管線螺旋夾子沒有夾住組織收集容器的抽吸口；(v)使用插管作為常用的脂肪抽吸插管以取出不需要的脂肪組織；(vi)在手動操作實施方案中，用組織收集容器收集了所需量的脂肪組織之后，用兩個管線螺旋夾子將組織收集容器密封；和(vii)確保用患者鑒別標簽將組織收集容器適當標記，并根據標準慣例在標簽上記錄其它信息(日期和操作時間等)。
參照附圖所示的組織取出系統10，通過把管線22與具有在線液體捕集器的抽吸源20連接，并且將插管24插到收獲部位，組織被直接收集到加工部件中。然后將脂肪組織抽吸到組織收集容器12內，脂肪組織被保持在組織收集容器12內的濾器16保留。組織收集后，可用洗滌液體例如無菌等滲鹽水將所收集的脂肪組織洗滌，其中洗滌液體包含在洗滌容器38中，并經由洗滌管線39加到組織收集容器12中。在該舉例說明的實施方案中，當組織收集容器12是用剛性材料制成以支持在抽吸下的收集時，在加入鹽水期間從殼體轉移出的氣體可經由空氣入口40排放出去。或者，可將空氣轉移到廢棄物容器36或類似保持位置內。一旦洗滌組織，即可讓廢棄物流到廢棄物容器36內。
在一些實施方案中，在將脂肪組織在收集容器12中解聚之前，可將完整的脂肪組織單位從組織收集容器12中取出來。可讓完整的脂肪組織單位沿著組織挽回管線34流動，這樣這些單位可被遞送到混和容器30內。在這些實施方案中，在施用給患者之前，可將完整的組織與干細胞混和。
收集了組織之后，可將針頭44插到含有膠原酶的酶溶液的無菌瓶中，然后讓酶溶液流到組織收集容器12內，在該容器內其與脂肪組織在37℃或約37℃混和30-60分鐘。可按照需要重復進行洗滌步驟，并且可洗滌解聚的組織，然后洗脫活性細胞群體以獲得最大收率。在組織解聚結束時，將組織收集容器12垂直放置以讓脂肪細胞漂浮。然后讓活性細胞群體流到細胞收集容器26內，在該容器中將細胞與殘余游離脂質分離開。可通過本領域技術人員已知的任何方法將細胞洗滌和/或濃縮，包括但不限于依次離心/再懸浮洗滌或連續流動機械裝置。然后讓濃縮、洗滌的細胞流到混和容器30內，在混和容器30內可將它們與得自組織挽回管線的完整組織和/或任何添加劑混和，然后經由出口32取出以施用給患者。可使用細胞濾器28將包含在細胞收集容器26中的材料過濾，然后洗滌以促進除去不需要的殘余細胞以及在施用時可導致栓塞的組織聚集體。
在加工期間，可按照需要將一種或多種添加劑加到不同容器中以提高結果。添加劑的某些實例包括能優化洗滌和解聚的添加劑，能提高加工期間活性細胞群體存活力的添加劑，抗微生物劑(例如抗生素)，裂解脂肪細胞和/或紅細胞的添加劑，或富集所需細胞群體的添加劑(通過與固相部分的差別粘著或促進細胞群體的顯著減少或富集)。
在上述實施方案中，組織收集容器12是組織取出系統10的內部固有部件。或者，可全部或部分使用單獨的組織收集容器，例如在發明名稱為“得自非造血組織的非胚胎細胞的保存”的于2002年9月12日提交的第10/242,094號專利申請中描述的組織收集容器，該申請共同轉讓的于2001年9月14日提交的第60/322,070號U.S.臨時專利申請的優先權，并且該申請的內容明確引入本文以供參考，之后將解聚的材料轉移到加工部件中，其它可能的組織收集容器公開在U.S.專利6,316,247和5,372,945中。
如上所述，在本發明的一些實施方案中，這些方法可通過提供一個或多個能夠自動進行方法步驟的附加裝置而自動進行。在這樣的實施方案中，加工裝置(例如微處理器或個人電腦)是讓上述步驟部分或完全自動進行的裝置。可施用這種自動化的步驟的實例包括但不限于，通過控制系統或加工裝置的泵和閥門來控制液體和組織沿著特定管線的進入和排出；用壓力傳感器檢測阻塞；混和機械裝置，使用容量機械裝置測定欲沿著特定路徑移動的組織和/或液體的量；使用熱控裝置保持不同組分的溫度；洗滌和濃縮細胞，以及用定時和軟件設備使過程成為整體。在一個實施方案中，軟件可控制加工參數，以產生根據特定操作者規定的的參數制得的細胞群體。因此，自動裝置改善了操作的性能，提供了自動進行的脂肪組織的收獲和加工以施用給患者。
附圖4顯示了一個具體的自動裝置。組織取出容器(未顯示)安放在裝置100內，使用顏色編碼的導向標記112-118來適當地排列和將管線插入到合適的途徑中。裝置100包括多個閥105和110，以及多個泵104和109。將管線放置在一系列閥105、110和泵104、109中，它們是由集成的微處理器系統控制的，以根據使用者規定的程序協調液體和組織流動。程序選擇是經由使用者接觸面板106進行的。將鹽水容器放置在結構101上，并與組織收集容器連接。將膠原酶或其它組織離解介質或混合物的瓶或管(未顯示)在點103插到組織收集容器內。將廢棄物袋(未顯示)插到保持結構111內，將細胞分離室/細胞收集容器放置在保持結構107內，將組織/細胞混和容器放置在保持結構108內。將組織收集容器放置在攪拌/培養室102內。
可在將容器放置在裝置內的同時或者放置在裝置內之前將脂肪組織收集到組織收集容器內。裝置可含有任選透明插入物119或決定包含在組織收集容器內的組織體積的其它裝置。或者，可通過測定包含在攪拌/培養室102(相當于組織收集容器12)中的材料的重量來確定體積。該體積可在使用者接觸面板106上顯示。
然后微處理器打開管線114和115上的閥，并啟動管線114上的泵104以將鹽水輸入到收集室102內，和取出廢棄物115遞送到廢棄物袋111中。在加工期間，通過搖動攪拌收集室，通過溫熱整合到室102內的裝置來保持在程序設定的溫度。在一些實施方案中，組織加工可使用預溫熱的鹽水，在這種情況下，將攪拌/培養室的裝置溫熱的作用是把溫度保持在預先程序設定的點，而不是提高溫度。
一旦將組織洗滌，即可以通過啟動在管線116上的泵109和閥110來將0％-100％的完整洗滌的脂肪組織從培養室102中取出。將在該時間抽出的材料保持在混和室108中。通過打開在管線113上的閥105，關閉其它閥，和啟動在管線113上的泵104來將離解介質103加到保留在室102中的材料內。加入離解介質之后，將室102攪拌并保持在如上所述的溫度。在程序設定的時間結束時，停止攪拌，讓脂肪細胞漂浮。可再加入鹽水以輔助該加工。脂肪細胞漂浮之后，將管線112和115上的閥打開，讓目標細胞群體從室102轉移到細胞洗滌室107內。將洗滌過的細胞經由管線117轉移到混和室108內，將上清液和洗滌溶液經由管線118轉移到廢棄物室111內。讓另外的鹽水經由管線114流到該系統內，以完成洗滌加工。將細胞在室108中與在該加工早期經由管線116取出的任何完整組織混和。混和可通過本領域技術人員已知的任何手段來進行，包括但不限于攪拌搖動/反轉室，壓縮脈沖或移動滾筒。然后經由該一次性設置的混和室中的口取出混和的材料。
該裝置包括用于根據預先程序設定的參數自動進行該加工的微處理器控制的機械裝置106。該系統還應當包括使用用于檢測阻塞的壓力傳感器和類似的安全和質量控制裝置。在優選的實施方案中，該系統的軟件部件應當包括自動收集“運行數據”，包括例如一次性部件的批號、溫度和體積測定值、組織體積和細胞數目參數、施用的酶劑量、培養時間、操作者身份、日期和時間、患者身份等。在該裝置的優選實施方案中，整合入條形碼讀取系統，以讓這些變量(例如一次性設置的批號和有效期限、膠原酶的批號和有效期限、患者/樣本標識等)的數據作為加工文件編制的一部分輸入到裝置控制器內。這將減少數據輸入差錯的機會。使用USB或本領域已知的其它界面接口和系統，可很容易將該裝置引入到控制器系統內。這樣，該裝置將提供對數據輸入和加工文件編制的集中控制。這些參數的打印報告將是裝置程序設定操作的用戶定義參數的一部分。自然這將需要一體化的打印機部件(硬件和驅動器)或在軟件中的打印機驅動器加上在裝置硬件中的用于打印機的界面輸出接口(例如USB接口)。
在另一個實施方案中，引入到控制器內的軟件將在所需步驟期間提示使用者正確地將管線和其它部件插入到裝置內。軟件還將啟動自動檢驗以確保管線被正確插入、沒有堵塞等等。
在該裝置中進行加工的一般方法將使用與在本申請其它部分描述的關于手動細胞加工的參數相同的參數。
用于細胞加工的分階段機械裝置的很多其它配置對于本領域技術人員來說是顯而易見的，本發明的描述僅是作為一個實例包括在內。例如，在洗滌和解聚期間，組織與鹽水的混和可通過如本文實例中描述的攪拌或通過流體循環來進行。細胞洗滌可通過連續流動方法，例如旋轉膜方法、差別粘著、差別離心(包括但不限于差別沉降、速度或梯度分離)或通過組合的方法來進行。類似地，可使用另外的組分以進一步處理細胞，包括加入生長因子或其它生物反應調節劑(Lind，M.，Growth factor stimulation of bone healing.Effects on osteoblasts.osteomies，and implants fixation.Acta Orthop Scand Suppl，1998.283p.2-37；Hanada，K.，J.E.Dennis，和A.I.Caplan，Stimulatory effects ofbasic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein-2 onosteogenic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymalstemcells.J Bone Miner Res，1997.12(10)p.1606-14；Lieberman，J.R.，等人，Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell lineinduces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents.J OrthopRes，1998.16(3)p.330-9)，將細胞與其它結構組分混和(例如骨片(Jean，J.L.，S.J.Wang，和M.K.Au，Treatment of a large segmental bone defectwith allograft and antogenous bone marrow graft.J Formos Med Assoc，1997.96(7)p.553-7)、膠原(Saadeh，P.B.，等人，Repair of a Critical SizeDefect in the Rat Mandible Using Allogenic Type I Collagen.JCraniofac Surg，2001.12(6)p.573-579)和/或用于和細胞一起植入到接收者體內的合成組分(Petite，H.，等人，Tissue-engineered boneregeneration.Nat Biotechnol，2000.18(9)p.959-63.taf/dynapage.taf？file＝/nob/biotech/v18/n9/full/nbt0900_959.htmltaf/dynapage.taf？file＝/ncb/biotech/v18/n9/abs/nbt0900_959.html；Gao，J.，等人，Tissue-Engineered Fabrication of an Osteochondral CompositeGraft Using Rat Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.TissueEng，2001.7(4)p.363-71；Ohgushi，H.和A.I.Caplan，Stem celltechnology and bioceramicsfrom cell to gene engineering.J BiomedMater Res，1999.48(6)p.913-27；Caplan，A.I.和V.M.Goldberg，Principles of tissue engineered regeneration of skeletal tissues.ClinOrthop，1999(367 Suppl)p.S12-6)。加工后處理還可以包括細胞培養(Caplan，A.I.和S.P.Bruder，Mesenchymal stem cellsbuilding blocksfor molecular medicine in the 21st century.Trends Mol Med，2001.7(6)p.259-64；Petite，supra；Zuk，P.A.，等人，Multilineage cells from humanadipose tissueimplications for cellbased therapies.Tissue Eng，2001.7(2)p.211-28)、基因轉移(Luskey，B.D.，等人，Gene transfer into murinehematopoietic stem cells and bone marrow stromal cells.Ann N Y AcadSci，1990.612(398)p.398-406；Grompe，M.，等人，Therapeutic trials inthe murine model of hereditary tyrosinaemia type Ia progress report.JInherit Metab Dis，1998.21(5)p.518-31；Gazit，D.，等人，Engineeredpluripotent mesenchymal cells integrate and differentiate inregenerating bonea novel cell-mediated gene therapy.J Gene Med，1999.1(2)p.121-33；Mosca，J.D.，等人，Mesenchymal stem cells asvehicles for gene delivery.Clin Orthop，2000(379 Suppl)p.S71-90)或進一步細胞純化(Greenberg，A.W.和D.A.Hammer，Cell separationmediated by differential rolling adhesion.Biotechnol Bioeng，2001.73(2)p.111-24；Mainwaring，G.和A.F.Rowley，Separation of leucocytes inthe dogfish(Scyliorhinus canicula)using density gradient centrifugationand differential adhesion to glass coverslips.Cell Tissue Res，1985.241(2)p.283-90；Schweitzer，C.M.，等人，Isolation and culture ofhuman bone marrow endothelial cells.Exp Hematol，1995.23(1)p.41-8)。可將用于實現這些功能的機械裝置集成到附圖4所示裝置內，或者可引入到單獨的裝置內。
在本發明的其它實施方案中，可將收集到常規脂肪組織捕集器中的組織轉移到設計用于加工其它組織的加工裝置內。例如，Baxter Inc.生產和銷售的一系列用于在骨髓移植物收獲設置中使用的塑料袋和濾器(“Bone Marrow Collection Kit with Flexible Pre-Filters and InlineFilters”，Product Code，4R2107，U.S.專利4,346,703和5,724,988)。這種袋裝置含有大的圓錐形袋，該圓錐形袋具有可用于洗滌所收集的脂肪組織的整合的800μm濾器。在該實例中，大于800μm的脂肪組織片段將保留在袋中。然后可通過反復加入鹽水(或其它洗滌溶液)來洗滌這些片段，之后將廢棄物經由濾器下面的口排出。混和可用手進行，或使用臺式搖動裝置進行，溫熱可通過施用加熱墊來進行。解聚可在該袋的腔內進行。解聚后，讓細胞經過整合的800μm濾器(并任選經過與該成套裝置一起提供的一個或多個小篩孔尺寸濾器)和收集到收集袋(也提供的)中。可將該袋放置在可把細胞系列洗滌和濃縮的離心機(例如Sorval RC-3C)內。還可以使用現有的細胞洗滌裝置(大部分是為了洗滌人血液制品而開發的)，例如Baxter Inc(Cytomate或BaxterCS3000)或Cobe Inc.(Cobe Spectra)銷售的那些來洗滌細胞。可使用生產商提供的契合裝置來整合這些一次性部件，或者可使用無菌連接裝置例如由Terumo Inc生產的那些將它們連接。類似地，可將在該一體化程度較低的方法中描述的裝置與中央控制器連接，并作為一體化程度更高的裝置的部件進行裝配。提供使用手動或自動夾子來打開或關閉流動路徑，可使用蠕動泵或泵組來讓液體自動流動。
在優選的本發明實施方案中，組織取出系統和加工裝置可位于接受治療的患者附近，例如在手術室或門診操作室中(有效地在患者床邊)。這使得能迅速、高效率地收獲組織和加工，排除了樣本操作/標記出差錯的機會，由此使得整個加工能在一個手術操作期間進行。
提供下列實施例是為了舉例說明可施用該技術的情形和設置，而不是為了限制本發明的范圍，并且本申請包括權利要求書。
實施例1自體固有脂肪轉移自體固有脂肪轉移是較常見的美容和結構手術，其涉及從一個部位收獲脂肪組織(組織)，并再植入到同一個體的另一個部位內(Coleman，S.R.(1995).“Long-term survival of fattransplantscontrolleddemonstrations.”Aesthetic Plast Surg 19(5)421-5；Coleman，S.R.(2001).“Structural fat graftsthe ideal filler？”Clin Plast Surg 28(1)111-9；Coleman，W.P.，3rd(1991).“Autologous fat transplantation.”PlastReconstr Surg 88(4)736)。然而，如上所述，該手術經常受到不一致植入效果的危害，這樣植入的材料完全或部分被再吸收或者被瘢痕組織替代(Eremia，S.和N.Newman(2000).“Long-term follow-up afterautologous fat graftinganalysis of results from 116 patients followed atleast 12 months after receiving the last of a minimum oftwotreatments.”Dermatol Surg 26(12)1150-8)。至少一部分功能損失是由于植入的脂肪組織在其形成新血管和給植入物提供養分時壞死所致。因此，與植入到血液灌注不佳的組織內細胞，植入到高血管區域例如肌肉床內的組織表現出更好的植入效果(Guerrerosantos，J.，A.Gonzalez-Mendoza，等人，(1996).“Long-term survival of free fat graftsin musclean experimental study in rats.”Aesthetic Plast Surg 20(5)403-8)。
按照本發明所述方法制得的加工的脂肪抽吸物通過給植入物補充另外的內皮前體和干細胞而解決了該問題。按照本發明公開的方法，將從近親交配的Wistar大鼠中提取的脂肪組織片段與加工的脂肪抽吸物混和。然后將該組合物皮下植入到接收大鼠的股腿和頭皮下。作為對照，讓相同數目的大鼠在頭皮下接受單獨的脂肪組織(未加工的脂肪抽吸物)，而在腿內接受植入物的大鼠在對側腿內植入單獨的脂肪組織。植入后一個月收獲移植物。
結果(附圖5)表明，隨著加工的脂肪抽吸物劑量的增加，腿內植入物的移植物重量有增加的趨勢。植入物的組織學檢查表明補充加工的脂肪抽吸物的移植物的血管供應改善了。對頭皮植入物觀察到了類似結果，雖然由于這些大鼠背側頭顱的低血管供應而使得整個保留較低。
在該技術的臨床應用中，制備本發明加工的脂肪抽吸物，并如上所述，與完整的(未解聚的)脂肪組織混和。可將包含脂肪組織與干細胞的混合物的組合物植入到接收者體內，以提供自體軟組織填充物來矯正外形缺陷(皺紋、“草皮”、痘痕和較大缺陷)(Coleman，S.R.(2001).“Structural fat graftsthe ideal filler？”Clin Plast Surg 28(1)111-9)或給損傷的結構例如尿道提供支持(Palma，P.C.，C.L.Riccetto，等人，(1997).“Repeated lipoinjections for stress urinary incontinence.”JEndourol 11(1)67-70；Lee，P.E.，R.C.Kung，等人，(2001).“Periurethralautologous fat injection as treatment for female stress urinaryincontinencea randomized double-blind controlled trial.”J Urol 165(1)153-8)。
實施例2急性肝損傷通過腹膜內注射烯丙醇而引起的肝損傷是常用的門靜脈周急性肝損傷模型(Lee，J.H.，Z.Ilic，等人，(1996).“Cell kinetics of repair afterallyl alcohol-induced liver necrosis in mice.”Int J Exp Pathol 77(2)63-72；Werlich，T.，K.J.Stiller，等人，(1999).“Experimental studies on thestem cell concept of liver regeneration.II.” Exp Toxicol Pathol 51(1)93-8.；Yin，L.，D.Lynch，等人，(1999).“Participation of different celltypes in the restitutive response of the rat liver to periportal inj uryinduced by allyl alcohol.”J Hepatol 31(3)497-507)。該模型已經用于證實對肝再生至關重要的干細胞群體存在(Yavorkovsky，L.，E.Lai，等人，(1995).“Participation of small intraportal stem cells in the restitutiveresponse of the liver to periportal necrosis induced by allyl alcohol.”Hepatology 21(6)1702-12；Werlich，T.，K.J.Stiller，等人，(1999).“Experimental studies on the stem cell concept of liver regeneration.II.”Exp Toxicol Pathol 51(1)93-8)。我們在Swiss Webster小鼠中修飾了該模型，其中在該小鼠中產生醇引起的損傷，然后注射加工的脂肪抽吸物。一周后將動物處死，取出肝臟，稱重，并準備組織學檢查。結果(附圖6和7)表明，在接受加工的脂肪抽吸物的動物中，肝臟重量得到了顯著提高。組織學分析表明在治療的動物中有正常組織學，沒有白細胞滲入或可能異常提高肝臟重量的任何其它機制的任何證據。
在臨床設置中，肝損傷患者將接受根據本發明方法提取和加工的脂肪組織。然后可將加工的脂肪抽吸物靜脈內注射，以經由肝臟循環系統全身或靶向遞送到肝臟中。
實施例3急性心臟損傷急性心肌梗塞(心臟病發作)導致心肌的缺血性損傷。組織損傷可通過再灌注損傷組織和心肌組織再生來減輕(Murry，C.E.，R.W.Wiseman，等人，(1996).“Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardialnecrosis.”J Clin Invest 98(11)2512-23；Orlic，D.，J.Kajstura，等人，(2001).“Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium.”Nature410(6829)701-5；Rajnoch，C.，J.C.Chachques，等人，(2001).“Cellulartherapy reverses myocardial dysfunction.”J Thorac Cardiovasc Surg121(5)871-8；Strauer，B.E.，M.Brehm，等人，(2002).“″Repair ofinfarcted myocardium by autologous intracoronary mononuclear bonemarrow cell transplantation in humans.”Circulation 106(15)1913-8)。在本申請中描述的臨床方法將提供可能優良的再生細胞源，因為可以以更大的數量和純度提供細胞，同時沒有與骨髓收獲有關的發病。
實施例4用于遺傳性疾病的同種異體應用Horwitz等人已經證實了得自骨髓的干細胞可給患有非造血性病癥，具體來說是成骨不全的患者提供臨床益處(Horwitz，E.M.，D.J.Prockop，等人，(1999).“Transplantability and therapeutic effects of bonemarrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesisimperfecta.”Nat Med 5(3)309-13；Horwitz，E.M.，D.J.Prockop，等人，(2001).“Clinical responses to bone marrow transplantation in childrenwith severe osteogenesis imperfecta.”Blood 97(5)1227-31)。在這些研究中，作者嘗試通過讓細胞在培養物中生長以擴展和純化MSC組分來補償骨髓中非造血干細胞的低數目和頻數。然而，如上所述，在培養物中生長細胞會帶來大量技術和臨床上的問題，而依據本發明加工的脂肪組織可提供高數目干細胞來源，而無需細胞培養，這代表著患者養護的顯著改善。在該模型中，未患有遺傳疾病(正常基因型或無癥狀的攜帶者)的適當匹配的供體，優選同胞或其他最直系親戚可以是供體細胞來源，盡管使用無親緣關系的供體也在本發明范圍內。可從脂肪組織中提取出細胞，以輸入到患有導致組織功能或再生受到損害的遺傳性疾病的患者中。實例包括但不限于成骨不全、Duschenes肌肉營養障礙(和其它肌肉營養障礙)、遺傳性視網膜變性疾病、遺傳性酪氨酸血癥和多種其它遺傳性疾病。
結論是，應用其中通過把基因插到干細胞隔室內來調節自體(自身)加工的脂肪抽吸物的基因治療方法將省去對同種異體(非自身)供體的需要。這樣的方法還可用于治療感染性疾病，其中是將新的基因插到干細胞內。例如，可使用反義或核酶構建物來產生能提供抗-HIV作用的細胞。該方法還可用于產生能夠起藥物遞送載體作用的干細胞。
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本文描述的任何特征或特征組合都包括在本發明范圍內，只要在任何這樣的組合中包括的特征不互相矛盾即可，這在上下文、本說明書和本領域技術人員的知識中是顯而易見的。為了總結本發明，在本文中已經描述了本發明的一些方面、優點和新特征。當然，應當理解，不需要將所有這樣的方面、優點或特征都在本發明的任何特定實施方案中體現。本發明的其它優點和方面將從詳細描述和權利要求書中顯而易見地看出。
提供上述實施方案只是為了舉例說明，本發明不限于這些實施例。對于本領域技術人員，通過考慮上面的描述，可在不互相排他的程度上做很多改變和改進。此外，對于本領域技術人員，通過閱讀本文的公開內容，其它組合、省略、替代和改變將是顯而易見的。因此，本發明不受所公開的實施方案的限制，而由權利要求書限定。
上文中已經引用了很多出版物和專利。每一所引用的出版物和專利都全文引入本文以供參考。
權利要求
1.治療患者的方法，其中包括(a)提供組織取出系統；(b)使用組織取出系統將脂肪組織從患者體內取出，所述脂肪組織具有一定濃度的干細胞；(c)加工至少一部分脂肪組織以獲得濃度與加工前脂肪組織的干細胞濃度不同的干細胞；和(d)將干細胞施用給患者，其中在施用給患者之前不將干細胞從組織取出系統中取出。
2.權利要求1的方法，其中在(b)中，將脂肪組織從患者中取出直接置于組織取出系統；在(c)中，在組織取出系統內加工脂肪組織；在(d)中，將干細胞從組織取出系統施用給患者。
3.權利要求1的方法，其中(b)包括將插管插入到患者體內鄰近欲取出的脂肪組織處并從患者中抽吸出脂肪組織的至少之一。
4.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)將從患者中取出的脂肪組織過濾以把脂肪組織與非脂肪組織分離開。
5.權利要求4的方法，其中(e)包括將取出的脂肪組織遞送到具有多個孔的容器中，所述孔的孔徑使得能保留脂肪組織和讓非脂肪組織通過。
6.權利要求1的方法，其中(c)包括將從患者中取出的脂肪組織降解，同時基本上不破壞包含在組織中的細胞。
7.權利要求6的方法，其中(c)包括將脂肪組織與至少一種能破壞細胞間接觸的酶混和。
8.權利要求7的方法，其中將脂肪組織與選自膠原酶、分散酶、脂肪酶、釋放酶H1和胰蛋白酶的酶混和。
9.權利要求6的方法，其中在酶把脂肪組織完全解聚的時間之前，將酶從脂肪組織中取出。
10.權利要求1的方法，其中(c)包括將干細胞從取出的脂肪組織中分離出來，以使干細胞基本上不含成熟的脂肪細胞和結締組織。
11.權利要求10的方法，其中(c)包括離心。
12.權利要求11的方法，其中(c)包括使用旋轉膜濾器。
13.權利要求11的方法，其中所述方法還包括(e)在離心之后將干細胞重懸。
14.權利要求1的方法，其中(c)包括加工脂肪組織以獲得更高濃度的干細胞。
15.權利要求1的方法，其中(c)包括降解至少一部分脂肪組織以產生一定濃度的干細胞，和其中(d)包括將該濃度的干細胞與另一部分脂肪組織合并，并將該合并物施用給患者。
16.權利要求15的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別25％以上。
17.權利要求15的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別100％以上。
18.權利要求15的方法，其中所述降解是用一種或多種酶進行的，并且在酶把脂肪組織完全解聚的時間之前，將酶從至少一部分脂肪組織中取出。
19.權利要求1的方法，其中在(c)之后將得自至少一部分脂肪組織的一定濃度的干細胞與另一部分脂肪組織混和，和其中(d)包括將該混合物施用給患者。
20.權利要求19的方法，其中所述降解是用一種或多種酶進行的，并且在酶把脂肪組織完全解聚的時間之前，將酶從至少一部分脂肪組織中取出。
21.權利要求19的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別50％以上。
22.權利要求19的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別150％以上。
23.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)施用能抑制患者對干細胞排斥反應的免疫抑制劑。
24.權利要求23的方法，其中(e)包括施用選自下列的免疫抑制劑環孢菌素、myophenylate mofetil、雷帕霉素、抗胸腺細胞球蛋白和能降低患者的T-細胞與B-細胞共同刺激作用的活性劑。
25.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)給患者施用細胞分化因子，其中當施用給患者時，所述分化因子能特異性地分化干細胞。
26.權利要求1的方法，其中(c)包括只將至少一部分脂肪組織部分解聚。
27.權利要求1的方法，其中(c)包括將脂肪組織加工成多部分脂肪組織。
28.權利要求27的方法，其中(c)包括只將多部分脂肪組織當中的至少一部分進行部分解聚。
29.權利要求27的方法，其中所述方法包括將至少兩部分脂肪組織混和在一起。
30.權利要求27的方法，其中已經將至少一部分脂肪組織加工以形成含有干細胞的團狀物。
31.權利要求1的方法，其中(d)包括給從中取出脂肪組織的患者施用干細胞。
32.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)將從脂肪組織獲得的干細胞冷卻。
33.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)將一部分得自脂肪組織的干細胞從組織取出系統中取出來；和(f)將從組織取出系統中取出來的這部分干細胞保存。
34.權利要求33的方法，其中(f)包括將從組織取出系統中取出來的這部分干細胞冷凍保存。
35.權利要求1的方法，其中將干細胞施用給患者以治療疾病。
36.權利要求1的方法，其中將干細胞施用給患者以處理患者的美容特征。
37.權利要求1的方法，其中將干細胞施用給患者以治療骨相關病癥、疾病或損傷，與脂肪有關的病癥或疾病；肝臟相關疾病、病癥或損傷，心肌梗塞，腎疾病或腎損傷；視網膜疾病或損傷或壞死；傷口愈合；骨骼肌病癥；軟骨和關節修復；肺損傷；糖尿病；腸病癥；和神經系統病癥、疾病或損傷。
38.權利要求1的方法，其中(b)和(c)是自動進行的。
39.權利要求1的方法，其中所述方法還包括(e)在已經將干細胞施用給患者之后，將組織取出系統的已經接觸體液的部分進行處理。
40.用于治療患者的組織取出系統，所述系統包括(a)組織收集容器，其包括(i)用以接收從患者中取出的脂肪組織的組織收集入口；和(ii)安置在容器內，并且用以保持從患者中取出的脂肪組織和讓從患者中取出的非脂肪組織通過的濾器；(b)與組織收集容器連接的混和容器，該混和容器用以接收從脂肪組織獲得的干細胞，而不將干細胞從組織取出系統中取出，并包括用于施用至少一種添加劑以與包含在其中的干細胞混和的添加口；和(c)用以讓混和容器中的干細胞離開組織收集系統以施用給患者的出口。
41.權利要求40的系統，其中所述組織收集入口與插入到患者體內以將脂肪組織從患者中取出的插管連接。
42.權利要求40的系統，其中所述組織收集容器包括在結構上與抽吸裝置連接的抽吸口。
43.權利要求40的系統，其中所述系統還包括位于組織收集容器與混和容器之間的細胞收集容器，這樣在到達混和容器之前，干細胞從組織收集容器流到細胞收集容器中。
44.權利要求43的系統，其中所述細胞收集容器包括有助于將懸浮液中的干細胞從懸浮液的液體中分離出來的細胞濃縮器。
45.權利要求43的系統，其中所述細胞收集容器包括旋轉膜濾器。
46.權利要求43的系統，其中所述細胞收集容器包括柔性袋。
47.權利要求43的系統，其中所述系統還包括另一個濾器，所述濾器的結構使得干細胞能從細胞收集容器流到混和容器中，并且防止至少比包含在其中的干細胞大的材料通過。
48.權利要求47的系統，其中所述另一個濾器包括直徑小于約200μm的多個孔。
49.權利要求47的系統，其中所述另一個濾器包括直徑為約20μm-200μm的多個孔。
50.權利要求47的系統，其中所述另一個濾器與細胞收集容器分隔開。
51.權利要求47的系統，其中所述另一個濾器是細胞收集容器的部件。
52.權利要求40的系統，其中所述系統還包括組織挽回管線，所述組織挽回管線提供了從組織收集容器到混和容器的導管，以讓保留在組織收集容器中的組織流到混和容器中。
53.權利要求40的系統，其中所述系統還包括在結構上能自動取出和加工系統內的脂肪組織的加工裝置。
54.權利要求40的系統，其中所述組織收集容器包括當通過抽吸裝置給容器施加抽吸時能保持其形式的殼體。
55.權利要求54的系統，其中所述組織收集容器包括剛性殼體。
56.權利要求54的系統，其中所述組織收集容器包括柔性袋。
57.權利要求40的系統，其中所述第一個濾器包括孔徑為約20μm-5mm的多個孔。
58.權利要求40的系統，其中所述系統還包括調節包含在組織收集容器中的材料的溫度的溫控裝置。
59.權利要求58的系統，其中所述溫控裝置是加熱器。
60.權利要求58的系統，其中所述溫控裝置的位置是調節正在遞送到組織收集容器中的液體的溫度。
61.權利要求40的系統，其中所述出口是混和容器的部件。
62.權利要求40的系統，其中所述出口與混和容器分隔開。
63.權利要求40的系統，其中所述出口包括可被液體滲透的膜。
64.權利要求40的系統，其中組織收集容器、混和容器和出口限定了不對外部環境開放的封閉系統。
65.權利要求40的系統，其中所述系統還包括與出口連接以將包含在混和容器中的干細胞施用給患者的組織施用裝置。
66.權利要求40的系統，其中將組織取出系統的已接觸體液的部分在一次性使用之后進行構造而被處理。
67.用于施用給患者的組合物，所述組合物包含a)具有一定濃度干細胞的第一部分脂肪組織；b)具有大于第一部分脂肪組織的干細胞濃度的第二部分脂肪組織。
68.權利要求67的組合物，其中所述第一部分和第二部分是混和在一起的。
69.權利要求68的組合物，其中所述第二部分脂肪組織包含基本上不含成熟脂肪細胞和結締組織的干細胞。
70.權利要求69的組合物，其中所述第二部分中的干細胞的量占第二部分中存在的細胞總量的約0.1％以上。
71.權利要求70的組合物，其中所述第二部分中的干細胞的量占第二部分中細胞總量的約0.1％-約100％。
72.權利要求70的組合物，其中所述第二部分中的干細胞的量占第二部分中細胞總量的約20％以上。
73.權利要求69的組合物，其中所述混和部分的干細胞濃度比第一部分的干細胞濃度大至少50％。
74.權利要求69的組合物，其中所述混和部分的干細胞濃度比第一部分的干細胞濃度大至少2倍。
75.權利要求69的組合物，其中所述混和部分的干細胞濃度比第一部分的干細胞濃度大至少3倍。
76.權利要求67的組合物，其中所述組合物還包含細胞分化因子，并且細胞分化因子的量能控制干細胞的分化。
77.權利要求67的組合物，其中所述第二部分包括至少部分離解的脂肪組織。
78.權利要求67的組合物，其中所述第二部分脂肪組織包括至少兩個單獨脂肪組織部分的組合。
79.權利要求67的組合物，其中所述第二部分脂肪組織已經通過除培養或冷凍保存之外的方式加工過。
80.治療患者的方法，包括a)提供組織取出系統；b)使用脂肪組織取出系統將脂肪組織從患者體內取出，所述脂肪組織具有一定濃度的干細胞；和c)加工脂肪組織以提高脂肪組織中的干細胞濃度；d)將具有該濃縮的干細胞的脂肪組織與另一部分脂肪組織混和；和e)將具有提高的干細胞濃度的該脂肪組織施用給患者。
81.權利要求80的方法，其中(b)包括至少一個以下操作從患者中抽吸出脂肪組織和從患者中切下脂肪組織。
82.權利要求81的方法，其中(c)還包括將過濾的脂肪組織解聚，然后使用旋轉膜濾器。
83.權利要求80的方法，其中(c)包括將脂肪組織分成幾部分，并提高至少一部分脂肪組織中的干細胞濃度。
84.權利要求83的方法，其中所述方法還包括僅將至少一部分脂肪組織部分解聚。
85.權利要求83的方法，其中(c)還包括將至少一部分具有提高濃度干細胞的脂肪組織與不具有提高濃度干細胞的脂肪組織混和。
86.權利要求85的方法，其中所述至少一部分具有提高濃度干細胞的脂肪組織得自冷凍保存的組織。
87.權利要求80的方法，其中所述組織取出系統是封閉系統，并且(c)全部是在封閉系統中進行的。
88.權利要求80的方法，其中(b)和(c)是自動進行的。
89.權利要求88的方法，其中(b)、(c)和(d)是自動進行的。
90.權利要求80的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別25％以上。
91.權利要求80的方法，其中所述至少一部分脂肪組織的體積與另一部分脂肪組織的體積差別100％以上。
92.權利要求80的方法，其中所述方法還包括(f)在已經將干細胞施用給患者之后，將組織取出系統的已經接觸體液的部分處理。
全文摘要
使用存在于加工的脂肪抽吸組織中的細胞來治療患者。治療患者的方法包括加工脂肪組織，以將得自脂肪組織的濃縮量的干細胞遞送給患者。該方法可在封閉的系統中實施，這樣在施用給患者之前，干細胞不暴露于外部環境。施用給患者的組合物包括脂肪組織與干細胞的混合物，這樣組合物的干細胞濃度就高于從患者中取出的脂肪組織。
文檔編號A61K45/00GK1630526SQ02827968
公開日2005年6月22日 申請日期2002年12月9日 優先權日2001年12月7日
發明者J·弗拉塞爾, M·H·亨德里克 申請人:馬克羅珀爾生物外科公司