專利名稱：應用與乙酰水楊酸聯合的可可矢車菊苷配質作為抗血小板療法的制作方法
背景技術：
本申請涉及聯合使用可可矢車菊苷配質和阿司匹林作為抗血小板療法。
由一個含有至少一個羥基的芳環組成的化合物被稱為單酚。因此，多酚由一個以上的芳環組成，每個環含有至少一個羥基。黃酮類化合物是具有二苯基丙烷(C6-C3-C6)骨架結構的多酚，它們在植物界中廣泛存在。被稱為原花色素的一類黃酮類化合物是黃烷-3-醇單體單位、最常見的以4→6或4→8連接的寡聚體。一類最常見的原花色素是矢車菊苷配質，它們是兒茶素和表兒茶素及其沒食子酸酯的寡聚體。
已知經常食用食用多酚(通常存在于各種水果和蔬菜中)會使以下疾病的死亡率降低心血管疾病(CVD)，包括中風、心臟病和血管血栓形成。紅酒、綠茶和可可都被鑒定為富含多酚，并且紅酒和綠茶均顯示與工業化國家的心臟病死亡呈負相關。
除降低動脈粥樣化形成的危險外，食用多酚還顯示具有各種各樣的其它潛在有益的生物活性。例如，已經顯示它們抑制病毒反轉錄酶、抑制HIVI體外復制、抑制潰瘍形成，并且是抗突變劑、神經保護劑、消炎藥、抗菌劑、降壓藥以及各種癌細胞類型的細胞毒性劑。
所述食用多酚發揮其生物功能的機制尚未完全了解，但是已經知道它們具有強有力的抗氧化特性并且對血小板活性有抑制效應。
阿司匹林(乙酰水楊酸)是原型非甾體消炎藥。多年來，阿司匹林一直作為抗血小板治療藥物使用，以降低復發性一過性缺血發作或腦血管意外的危險。阿司匹林的作用機制已完全確立(Vane，J.，Nature，1971)。簡而言之，它通過引起血小板前列腺素G/H合酶1的改變、引起其環加氧酶活性的不可逆喪失，從而抑制花生四烯酸途徑。這導致花生四烯酸轉變為前列腺素減少，而前列腺素是各種生理過程的極其有效的介質。它使這些前列腺素、尤其是血栓烷A2和前列腺素E2的形成減少，這解釋了阿司匹林的構成其治療用途基礎的各種藥理學作用。遺撼的是，相同的因素也引起大量記載的阿司匹林的毒性。
血小板缺乏合成新蛋白質的裝置，這意味著由阿司匹林引起的損害在血小板的生命期間不可被修復。這意味著阿司匹林的重復日劑量的抑制效應是累積性的，最終在7-10天后導致幾乎完全抑制血小板血栓烷的生物合成。生物化學、藥理學和臨床數據支持這樣的理論正是由于血栓烷的抑制，導致防止依賴血栓烷的血小板活化，這解釋了阿司匹林的抗血栓形成作用。
然而，通過花生四烯酸途徑產生的各種其它前列腺素負責若干重要的穩態機制，例如胃酸分泌、原始體內穩態、血壓的控制和腎功能。因此，長期阿司匹林治療導致有害的作用。這些包括嚴重的胃腸道并發癥(包括出血和穿孔)、出血并發癥(例如引起出血事件)以及慢性腎病危險性增加。
在數年內，對長期阿司匹林治療的正面和負面了解增加導致不大建議使用日劑量，有時與低強度口服抗凝藥聯合使用(在高危病人中)。
顯然，不引起阿司匹林的危險副作用、并且可能在長期預防/治療方案中用以代替阿司匹林，或可能與非常低劑量的阿司匹林聯用的抗血小板藥的發現，將使由于血小板功能障礙引起的任何疾病或障礙的治療和預防向前邁出一大步。這一發現受到醫生和有患這類疾病危險或希望預防發生這種疾病可能性的大眾的普遍歡迎。
發明概述已經表明可可中存在的矢車菊苷配質在體外和體內都具有抗血小板效應。也說明所述抗血小板作用機制不是通過抑制所述花生四烯酸途徑。另外，似乎與可可矢車菊苷配質聯合的低劑量阿司匹林治療導致抗血小板效應增強、超過兩種單一療法的抗血小板效應。因此，本發明提供一種可供選擇的長期抗血小板治療，而沒有與阿司匹林相關的使人不愉快和危險的副作用。
附圖描述

圖1A-B代表在4種治療中以兩種時間間隔記錄的比較的血栓烷和LT/PGI2比率水平阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林與(+)-可可聯合，阿司匹林與(-)-可可聯合。
圖2A-D代表在4種治療中以兩種時間間隔記錄的比較的未經刺激的血小板IIb/IIIa受體表達阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林與(+)-可可聯合，阿司匹林與(-)-可可聯合。
圖3A-D代表在4種治療中以兩種時間間隔記錄的比較的ADP刺激的血小板IIb/IIIa受體表達阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林與(+)-可可聯合，阿司匹林與(-)-可可聯合。
圖4A-D代表在4種治療中以兩種時間間隔記錄的比較的腎上腺素刺激的血小板IIb/IIIa受體表達阿司匹林，(+)-可可，阿司匹林與(+)-可可聯合，阿司匹林與(-)-可可聯合。
詳細描述本發明涉及可可矢車菊苷配質與阿司匹林聯合應用作為抗血小板治療藥物以及包含可可矢車菊苷配質和阿司匹林(乙酰水楊酸)的組合物。
本文所用的“可可矢車菊苷配質”是表兒茶素和兒茶素的單體和/或寡聚體。術語“矢車菊苷配質”在本領域使用時具有更加有限的含義，即是指表兒茶素和兒茶素的寡聚體(而不是單體)。然而，為了簡便起見，本文所用的所述術語包括單體以及寡聚體。
本發明涉及包含阿司匹林和可可矢車菊苷配質的組合物。所述組合物可以通過任何合適形式給予，但通常配制為藥用組合物、食品、食物增補劑或食品添加劑。
在一個實施方案中，本發明提供適合于攝入的包含在生理可接受的載體中的阿司匹林和可可矢車菊苷配質的組合物。所述組合物可以通過任何合適形式給予，但通常配制為藥用組合物、食品、食物增補劑或食品添加劑。
本發明也提供-應用阿司匹林和可可矢車菊苷配質生產用于治療或預防由血小板功能障礙引起的疾病或障礙(例如與正常血小板活化相反的、導致凝血塊形成的血小板病理性活化以及預防出血)的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑；-應用阿司匹林生產與可可矢車菊苷配質一起使用以預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑；和-應用可可矢車菊苷配質生產與阿司匹林一起使用以預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑。
可可多酚包括可可矢車菊苷配質，它們是表兒茶素和兒茶素的單體和/或寡聚體。
矢車菊苷配質單體具有以下結構
矢車菊苷配質包括在得自以下植物的可可豆中發現的矢車菊苷配質可可(Theobroma cacao)和各種相關可可物種，以及Herrania屬及其屬間雜種和屬內雜種。
矢車菊苷配質單體包括(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素及其相應的差向異構體(例如(-)-兒茶素和(+)-表兒茶素)。
以具有以下結構的合成直鏈和/或支鏈寡聚體為例說明所述可可矢車菊苷配質。
直鏈寡聚體，其中n為0-16的整數
支鏈寡聚體，其中A和B獨立地為寡聚體1-15，(在最終寡聚體中它們總共為寡聚體3-18)。 在所述寡聚體中，n為2-18的整數、優選3-12的整數、更優選5-12的整數、最優選為5。所述寡聚體具有(4→6)和/或(4→8)的黃烷間(interflavan)鍵合。所述寡聚體可以由上述結構表示。對于直鏈寡聚體，當x為0時，所述寡聚體稱為“二聚體”；當x為1時，所述寡聚體稱為“三聚體”；當x為2時，所述寡聚體稱為“四聚體”；當x為3時，所述寡聚體稱為“五聚體”；對于具有x至多18并且包括18和更高的寡聚體，可以采用同樣的敘述進行命名，這樣，當x為18時，所述寡聚體稱為“十八聚體”。對于所述支鏈寡聚體，當A或B為1時，所述寡聚體稱為“三聚體”；采用同樣的敘述例如有關所述直鏈寡聚體的描述以此類推。
所述可可矢車菊苷配質可以由可可成分、尤其是具有可可矢車菊苷配質含量增加的可可成分提供，或者可以采用合成法制備所述可可矢車菊苷配質。可可成分是可得自含有可可矢車菊苷配質的可可豆的任何物質，并且包括例如巧克力漿、可可脂、部分脫脂可可固體(cocoasolid)和/或全脫脂可可固體。所述可可矢車菊苷配質可以以可可成分的形式使用，或者它們可以從可可豆、可可碎仁或可可成分中提取，例如從上述成分中提取。
測定可可多酚含量的方法描述于美國專利第5,554,645號(1996年9月10日授予專利權)，該專利通過引用結合到本文中。剝開收獲的可可豆莢，取出帶有果肉的豆進行冷凍干燥。從冷凍干燥塊中人工去除果肉，將所述豆進行以下操作。所述冷凍干燥可可豆首先人工去除果肉，用TEKMAR Mill將其磨碎成精細粉末塊。然后將所得的粉末塊使用重蒸餾的己烷作為溶劑通過Soxhlet提取法脫脂過夜。在環境溫度下，通過真空從所述脫脂塊中除去殘留的溶劑。
可可多酚(包括可可矢車菊苷配質單體和/或寡聚體)也可以從含有高水平的可可多酚的新鮮可可豆、可可碎仁或可可碎仁部分中提取，最好是從未經發酵、發酵不足的可可豆中提取。它們也可以從最好具有高可可多酚含量的巧克力漿、部分脫脂可可固體和/或全脫脂可可固體中提取。使用溶解所述可可多酚(包括所述矢車菊苷配質)的溶劑。
因此，在本發明的一個方面，所述可可矢車菊苷配質是寡聚體、單體或它們的混合物，所述寡聚體、單體或混合物可通過以下方法獲得(a)脫脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力漿、部分脫脂可可固體或全脫脂可可固體用可可矢車菊苷配質可溶于其中的溶劑一溶劑抽提；且(b)從所得的可可提取物中分離包含所述的或每種矢車菊苷配質單體、寡聚體或混合物的部分。
合適的溶劑包括水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯或它們的混合物。優選的溶劑是水和甲醇或丙酮的混合物。一種優選的提取方法是先用丙酮/水/乙酸(70％∶29.5％∶0.5％)提取兩次，然后用甲醇∶水∶乙酸(70％∶29.5％∶0.5％)進行第三次提取。所述溶劑最好略呈酸性。在某些情況下，所述提取物例如通過除去咖啡因和/或可可堿而純化，然后通過凝膠滲透層析和/或高壓液相層析進一步純化。在高壓液相層析中，可以將所述提取物分級分離成含有至少50％(重量)單體或特定寡聚體的單體部分和寡聚體部分。當所述部分含有所述單體和低級寡聚體(至多并且包括四聚體)時，所述部分含有約90-95％(重量)的特定寡聚體部分。
在另一個實施方案中，可可多酚、通常是可可矢車菊苷配質單體和/或寡聚體存在于可可多酚水平增加或保持的可可成分中(例如如上所述)。增加水平的可可多酚可以通過將可可多酚、例如可可矢車菊苷配質單體、寡聚體和/或其混合物加入到所述可可成分中來實現。如下所述，由于當從發酵不足的可可豆或或其混合物中制備時，焙炒的(roasted)可可碎仁、巧克力漿和部分脫脂或無脂肪的可可固體的可可多酚含量、包括所述可可矢車菊苷配質含量較高，所以水平保持的可可多酚可以通過控制可可豆的發酵程度來實現。
水平保持的的可可多酚也可以在通過控制所述可可豆加工的條件來實現。因此，從可可豆生產具有水平保持的的可可多酚的可可脂和/或可可固體的方法采用不需要單獨的可可豆焙炒或液體磨碎設備的獨特的加工步驟的組合，使得可以任選加工可可豆，而無需將其暴露于嚴峻的熱處理達延長的時間和/或應用的溶劑提取脂肪。與傳統的可可加工法不同，該方法的好處在于增加多酚的保留，使得在未經加工的可可豆中存在的多酚的原始量與加工后可獲得的多酚含量的比率小于或等于2。
可可多酚含量高的部分脫脂可可固體(包括高可可矢車菊苷配質含量)可以通過將可可豆直接加工成可可固體來獲得，而無需可可豆或碎仁的焙炒步驟。該方法保留了可可多酚，因為它省去了傳統的焙炒步驟。該方法基本上由以下步驟構成(a)將可可豆加熱至恰好足以減少含水量至約3％(重量)、使可可殼裂開的可可豆內部溫度；(b)從可可殼中風選可可碎仁；(c)螺桿壓榨可可碎仁；和(d)回收含有可可多酚(包括可可矢車菊苷配質)的可可脂和部分脫脂可可固體。任選的是，在加熱步驟之前，清潔可可豆，例如在空氣流化床密度分離器中進行。所述風選也可以在空氣流化床密度分離器中進行。優選將可可豆加熱至約100℃至約110℃，更優選低于約105℃的內部溫度，通常采用紅外加熱裝置將其加熱3-4分鐘。如果需要，可以將所述可可固體堿化和/或磨成可可粉。
通過將可可豆(大約80-100粒可可豆)裝入絕熱容器例如保溫瓶中，可測量可可豆內部溫度(IBT)。然后將所述絕熱容器適當密封，以保持其中所述樣品的溫度。將一支溫度計插入到裝入可可豆的絕熱容器中，使所述溫度計的溫度與保溫瓶中的可可豆的溫度平衡。該溫度讀數就是可可豆的IBT溫度。IBT也可以認為是可可豆的平衡質量溫度。
可可豆可以依照其顏色分成4類主要為褐色(完全發酵的)、紫色/褐色、紫色和淡黑色(未發酵的)。如上所述，所述可可固體最好從發酵不足的可可豆來制備，它比已發酵的可可豆的可可多酚含量高。發酵不足的可可豆包括淡黑色可可豆、紫色可可豆、淡黑色可可豆和紫色可可豆的混合物、紫色可可豆和褐色可可豆的混合物或者淡黑色可可豆、紫色可可豆和褐色可可豆的混合物。更優選所述可可豆是淡黑色可可豆和/或紫色可可豆。發酵不足的可可豆通常的發酵系數為275或更低。
所述“發酵系數”采用表征可可豆發酵的梯度系統來測定。淡黑色定為1，紫色為2，紫色/褐色為3，褐色為4。屬于每種類別的可可豆的百分率乘以加權數值。因而，100％褐色可可豆樣品的“發酵系數(fermentation factor)”是100×4或400，而100％紫色可可豆樣品的“發酵系數”是100×2或200，。50％淡黑色可可豆樣品和50％紫色可可豆樣品的發酵系數為150，即(50×1)+(50×2)。
在一個實施方案中，可可矢車菊苷配質的衍生物，例如沒食子酸化和甲基化矢車菊苷配質，可以與阿司匹林聯合使用。本文關于可可矢車菊苷配質及其用途的任何引述也適用于矢車菊苷配質衍生物。沒食子酸化矢車菊苷配質可以依照國際專利申請第PCT/US98/21392號(公布號為WO99/19319)中所述來制備。甲基化矢車菊苷配質可以依照例如實施例6中所述來制備。
在本發明的一個方面，所述甲基化矢車菊苷配質單體或寡聚體是式(A)n，其中n為1-18，A是下式的單體單位 其中R1至R5以及R8至R10中的每個相同或不同，各自為H或CH3；R6和R7相同或不同，它們為H、CH3或與相鄰單體單位的鍵合；條件是在至少一個單體單位中基團R1至R10中至少一個為CH3。所述單體可以例如通過環上4位、6位和8位中的任一個或兩個通過上述黃烷間鍵合連接。
在本發明的另一方面，所述甲基化矢車菊苷配質單體或寡聚體具有式(A’)n結構，其中n為1-18，A’為下式的單體單位 其中R1至R5中的每個相同或不同，各自為H或CH3，條件是在至少一個單體單位中基團R1至R5中至少一個為CH3。所述單體可以例如通過環上4位、6位和8位中的任一個或兩個通過上述黃烷間鍵合連接。例如，所述寡聚體可以是以下結構的直鏈寡聚體，其中n為1-16 其中R1至R5如上定義。
或者，或此外，所述寡聚體可以是以下結構的支鏈寡聚體，其中A和B獨立地為寡聚體1-15，在最終寡聚體中它們總共為寡聚體3-18 其中R1至R5如上定義。
在另一個實施方案中，本發明提供矢車菊苷配質寡聚體或多種寡聚體的混合物，其中所述寡聚體或每種所述寡聚體是甲基化四聚體。
例如，所述甲基化四聚體是式(A)4化合物，其中A為下式的單體單位 其中R1至R5以及R8至R10中的每個相同或不同，各自為H或CH3；R6和R7相同或不同，它們為H、CH3或與與相鄰單體單位的鍵合；條件是在至少一個單體單位中基團R1至R10中至少一個為CH3。所述單體可以例如通過環上4位、6位和8位中的任一個或兩個通過上述黃烷間鍵合連接。
或者，所述甲基化四聚體可以是式(A’)4化合物，其中A為下式的單體單位 其中R1至R5中的每個相同或不同，各自為H或CH3，條件是在至少一個單體單位中基團R1至R5中至少一個為CH3。所述單體可以例如通過環上4位、6位和8位中的任一個或兩個通過上述黃烷間鍵合連接。
本發明的甲基化可可矢車菊苷配質四聚體或四聚體的混合物可通過使含有矢車菊苷配質四聚體的可可提取物的分離部分或通過合成法制備的四聚體甲基化來獲得。例如，所述四聚體可以為如上所述的式(A)4的四聚體。
在一個實施方案中，甲基化可可矢車菊苷配質四聚體或四聚體的混合物，其中所述四聚體或其混合物可通過以下方法獲得(a)脫脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力漿、部分脫脂可可固體或全脫脂可可固體用可可矢車菊苷配質可溶于其中的溶劑萃取；(b)從所得的可可提取物中分離含有矢車菊苷配質四聚體的部分；和(c)將所述分離部分甲基化。
所述甲基化可可矢車菊苷配質寡聚體或寡聚體的混合物，其中所述寡聚體或其混合物也可通過以下方法獲得(a)脫脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力漿、部分脫脂可可固體或全脫脂可可固體用可可矢車菊苷配質可溶于其中的溶劑萃取；(b)從所得的可可提取物中分離含有矢車菊苷配質寡聚體的部分；和(c)將所述分離部分甲基化。
本發明的組合物為適合于口服給藥的形式，例如片劑、膠囊劑、丸劑、濃縮劑、粉劑、液體、溶液劑或混懸劑。最好配制為藥用組合物、食品、食物增補劑或食品添加劑。也可以采用寵物食品成分的形式。所述組合物可以以單位劑型提供。
所述活性化合物可以配制用以速釋或緩釋。片劑可以包含有效量的可可多酚、可可矢車菊苷配質單體和/或寡聚體或含有可可多酚或可可矢車菊苷配質的組合物和有效量的阿司匹林以及任選的載體或釋放系統。合成聚合物在配制具有控制釋放的組合物中尤其有用。所述膠囊劑可以包含含有預定劑量的含有所述可可多酚和阿司匹林的組合物的明膠膠囊。口服給藥制品也可以包含食用增補劑營養素，例如磷酸二鈣、硬脂酸鎂、硝酸鈣、維生素和礦物質。所述可可矢車菊苷配質/阿司匹林組合的制劑和含有它們的組合物可以用制藥領域、食品科學領域、醫藥領域和獸醫學領域的技術人員眾所周知的標準技術來制備。
配制所述組合物以傳遞聯合有效劑量的所述可可矢車菊苷配質和阿司匹林。可以以單劑量，或者一日二次至三次給予有效量的所述可可矢車菊苷配質。人用的日有效量為至少50mg、優選100mg、更優選150mg的所述可可矢車菊苷配質。劑量上限沒有限制。例如可以在約50至約1000mg、約100至約800mg、約300至約600mg的范圍內，或使用這些劑量的下限而不采用劑量上限，例如至少50mg/ml、100mg/ml或300mg/ml，給予矢車菊苷配質。當用于獸醫學的動物例如貓、馬或狗時，本領域技術人員可以考慮例如動物體重根據上述劑量來確定有效量。矢車菊苷配質用量可以通過Adamson等所述方法(“用于對可可和巧克力樣品中矢車菊苷配質定量的HPLC方法及與總抗氧化能力的關系(HPLC Method for the Quantification of Procyanidinsin Cocoa and Chocolate Samples and Correlation to Total AntioxidantCapacity)”J.Ag.Food Chem.，第710卷，4184-4188)來確定，該文獻的有關部分通過引用結合到本文中。由于當與可可矢車菊苷配質聯合給予時獲得增強效應，所以阿司匹林可以以比當在抗血小板療法時單獨使用阿司匹林以達到心血管保護效應所需要的劑量(對于人而言，該劑量例如為80mg/天)低的劑量給予阿司匹林。因而，在本發明的方法和/或組合物中，阿司匹林可以以低于約80mg/天、例如約10mg/天至約80mg/天、最好是約20mg/天至約80mg/天的量使用。在另一個實施方案中，阿司匹林可以以約40mg/天至約80mg/天給予，或者當給予時以低于約70mg/天、約20mg/天至約70mg/天、或者約30mg/天至約70mg/天給予。
除了在一種可口服給藥的組合物中聯合外，所述可可矢車菊苷配質和阿司匹林可以配制成分開給藥。因此，本發明還提供包含阿司匹林和可可矢車菊苷配質、用以分開、同時或順序應用以治療由血小板功能障礙引起的疾病和障礙的制品。當分開給予時，所述可可矢車菊苷配質和阿司匹林必須在確保它們以具有聯合效應的足夠濃度同時存在于所述哺乳動物體內的時間內給予。本領域技術人員可以根據可可矢車菊苷配質和阿司匹林的生物有效度的知識來確定該時間周期。例如可可矢車菊苷配質和阿司匹林應該相互在8小時內、優選相互在6小時內、更優選相互在2小時內給予所述哺乳動物。
所述可可多酚通常存在于例如如上所述獲得的可可多酚水平增加或保持的可可成分中。因此，一方面，所述可可成分包括可通過以下方法獲得的可可固體(a)將可可豆加熱至恰好足以使含水量降低至3％(重量)和使可可殼裂開的可可豆內部溫度；(b)從可可殼風選可可碎仁；(c)螺桿壓榨所述可可碎仁；和(d)回收含有可可多酚的可可脂和部分脫脂可可固體。
在一個優選的實施方案中，可可多酚水平增加或保持的可可成分包含在飲料混合物中，以將其制成與有效量的阿司匹林共同給予的飲料。一種優選的飲料或飲料混合物包含高可可多酚固體和/或可可提取物；和任選的天然或人工甜味劑、天然或合成矯味劑和乳制品。所述飲料也可以是碳酸飲料。所述甜味劑可以是糖漿、固體或糖代用品。術語“糖代用品”包括填充劑、糖醇(即多元醇例如甘油)、高效甜味劑或其組合。甜度強度的程度不同的營養性糖類甜味劑可以是本領域通常使用的任何甜味劑，包括但不限于蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖漿干粉、玉米糖漿干粉、轉化糖、水解乳糖、蜂蜜、槭糖、紅糖、糖蜜等。糖代用品可以部分或全部代替營養性糖類甜味劑。高效糖代用品包括天冬甜素、環己基氨基磺酸鹽、糖精、丁磺氨鉀、新橙皮苷、二氫查耳酮、三氯半乳蔗糖、天門冬酰丙氨酸酯、甜菊甜味劑、甘草甜素、沙馬汀等以及它們的混合物。示例性的糖醇包括本領域通常使用的那些糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、異麥芽、乳糖醇等。示例性的乳品成分是無脂肪乳固體、乳脂、甜性稀奶油、脫奶油乳和脫脂乳。
對于本申請的目的而言，下述定義使得能夠更加清楚地了解公開和要求保護的內容本文所用的“食品”是基本上由蛋白質、碳水化合物和/或脂肪組成、用于生物體持續生長、修復和生命過程以及提供能量的物質。食品也可以含有補充的物質，例如礦物質、維生素和調味品。參見Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary，第10版，1993。
本文所用的“藥物(pharmaceutical)”或“藥物(medicament)”是醫學上的藥物。參見Merriam-Webster’s Collegiate Dictionary，第10版，1993。
本文所用的“食品增補劑(food supplement)”或“食物增補劑(dietarysupplement)”是用于補充帶有或含有一種或多種以下食物成分的膳食的制品(煙草除外)維生素、礦物質、草本植物或其它植物、氫基酸、人類通過增加全天攝食量用以來補充所述膳食的食用物質或濃縮物、代謝物、組分、提取物或這些成分的組合。參見Merriam-Webster’sCollegiate Dictionary，第10版，1993。
在食品標志上所用的“增補劑”通常是指以高于U.S.RDA 50％以上的用量添加的營養素(“Understanding Normal and Clinical Nutirition，第三版”，Whitney編著，Cataldoand Rolfes，第525頁)。
為了治療或預防由血小板功能障礙引起的任何障礙或疾病，可以根據本發明的公開內容和本領域已知的方法，由主治醫師根據需要，單獨或與其它治療藥物聯合給予(人類或獸類動物例如寵物動物)可可矢車菊苷配質或可可矢車菊苷配質單體和/或寡聚體的混合物或包含可可矢車菊苷配質或可可矢車菊苷配質單體和/或寡聚體的組合物加上有效量的阿司匹林。例如，由主治醫生根據需要，無需任何過多實驗，可以在血小板功能障礙的體征或癥狀開始出現時或出現后立即給予包括共同給予阿司匹林和可可矢車菊苷配質的治療。因此，本發明的組合物和治療可以用于例如患有心血管疾病或有患心血管疾病危險的受治療者，所述心血管疾病包括心臟病發作、中風和周圍血管疾病、周圍動脈疾病、冠狀動脈疾病、頸動脈疾病、動脈粥樣硬化、再狹窄。
不需要過多實驗，必要時，主治醫師可以采用例如每月、每二個月、每二年、每年的方案或者采用某些其它方案，連續單獨地或者與其它治療藥物一起共同給予可可矢車菊苷配質和阿司匹林或它們的組合物。
此外，在本發明的范圍內，有包含食品、食物增補劑或藥物和指示含量增加的可可多酚(包括可可矢車菊苷配質)與阿司匹林聯合或者指出這些化合物有益特性的標簽以及任選的使用說明的包裝。本文所用的所述有益特性包括例如在心血管疾病和由于炎癥引起的疾病和障礙的預防和治療中抑制血小板功能障礙。
在以下非限制性的實施例中進一步描述了本發明。
實施例1可可矢車菊苷配質的定量分析方法根據聚合程度，使用下述分析方法對可可(Theobroma cacao)種子和巧克力的矢車菊苷配質組合物進行分離和定量。下述分析方法基于在以下文獻中報道的工作Hammerston，J.F.，Lazarus，S.A.，Mitchell，A.E.，Rucker R.，Schmitz，H.H.，采用高效液相色譜/質譜鑒定可可(Theobroma cacao)和巧克力中的矢車菊苷配質(Identification ofProcyanidins in Cocoa(Theobroma cacao)and Chocolate Using High-Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry)，J.Ag.FoodChem.；1999；47(10)490-496。下述分析方法適用于定量研究據報道含有各種類型的原花色素的多種食品和飲料樣品，如在以下文獻中報道的工作Lazarus，S.A.，Adamson，G.E.，Hammerstone，J.F.，Schmitz，H.H.，食品和飲料中原花色素的高效液相色譜/質譜分析(High-performanceLiquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis of Proanthocyanidinsin Foods and Beverages)，J.Ag.Food Chem.；1999；47(9)3693-3701。因為熒光檢測的高選擇性和靈敏度，所以在Lazarus等(1999)中的分析報道采用熒光檢測進行分析。
采用下述分析方法，如在以下文獻中報道的分析方法Adamson，G.E.，Lazarus，S.A.，Mitchell，A.E.，Prior，R.L.，Cao，G.，Jacobs，P.H.，Kremers，B.G.，Hammerston，J.F.，Rucker，R.，Ritter，K.A.，Schmitz，H.H.，用于可可和巧克力和矢車菊苷配質定量的HPLC方法及與總抗氧化能力的關系(HPLC Method for the Quantification of Procyanidins in Cocoaand Chocolate Samples and Correlation to Total Antioxidant Capacity)，J.Ag.Food Chem.；1999；47(10)4184-4188然后將樣品與復合標準品進行比較，以準確確定矢車菊苷配質的水平。
提取將新鮮種子(來自巴西可可豆)在高速實驗室研磨機中用液氮磨碎，直到顆粒大小減至約90微米為止。通過用1000毫升(ml)己烷提取三次，從220克(g)的磨碎種子中除去脂質。將不含脂質的固體風干，得到約100g無脂肪的物質。通過用1000ml 70％(體積)丙酮水溶液提取，獲得含有矢車菊苷配質的部分。將懸浮液以1500g離心10分鐘。通過帶有玻璃棉的漏斗傾析丙酮層。然后用己烷(約75ml)再提取丙酮水溶液，以除去剩余脂質。棄去己烷層，丙酮水溶液在部分真空下于40℃旋轉蒸發至終體積為200ml。將水性提取物冷凍干燥，得到約19g經丙酮提取的物質。
凝膠層析將約2g丙酮提取物(以上獲得的)懸浮于10ml 70％甲醇水溶液中，然后以1500g離心。上清液在先前以流速3.5ml/min用甲醇平衡的Sephadex LH-20柱(70×3厘米)上半純化。進樣后2.5小時，每20分鐘收集流分，通過HPLC分析流分中的可可堿和咖啡因。參見Clapperton，J.，Hammerstone，J.F.，Romanczyk，L.J.，Yow，S.，Lim，D.，Lockwood，R.，多酚和可可香料(Polyphenols and Cocoa Flavour)，Proceedings，16thInternational Conference of Groupe Ployphenols，Lisbon，Portugal，Groupe PolyphenolsNorbonne，France，1992；Tome II，第112-115頁。一旦從所述柱子洗脫出可可堿和咖啡因(約3.5小時)，則收集其余的洗出物達另外的4.5小時，在部分真空下于40℃旋轉蒸發，以除去有機溶劑。然后將該提取物懸浮于水中，并冷凍干燥。
通過制備型正相HPLC純化矢車菊苷配質寡聚體將上述可可提取物(0.7g)溶于比率分別為70∶29.5∶0.5(體積)丙酮/水/乙酸的混合物(7ml)中。采用5μm Supelcosil LC柱(二氧化硅，100埃()；50×2cm)(Supelco，Inc.，Bellefonte，Pennsylvania)，于波長280納米(nm)通過UV進行監測，使用線性梯度(下表中所示的)分離矢車菊苷配質流分。
在對應于寡聚體的峰之間的谷底收集流分。合并具有相同保留時間來自若干個制備分離的流分，在部分真空下旋轉蒸發，然后冷凍干燥。
通過HPLC/MS分析純化的流分為了測定各個寡聚體流分的純度，如Lazarus等(1999)所述(參見上文)，采用結合在線質譜(MS)分析的正相高效層析(HPLC)方法，采用大氣壓電離電離噴霧(API-ES)室，進行分析。在配備一個自動注射器、四級HPLC泵、柱加熱器、光電二極管陣列檢測器和用于數據收集和處理的HP ChemStation的HP l000系列(Hewlett-Packard，Palo Alto，Califormia)上進行色譜分析。在Phenomenex(Torrance，California)Luna二氧化硅柱(25×4.6mm)上于37℃對所述矢車菊苷配質寡聚體進行正相分離。于波長280nm記錄UV檢測。所述三級流動相由(A)二氯甲烷、(B)甲醇和(C)乙酸和水(1∶1 v/v)組成。分離受以下因素影響(A)中B的一系列線性梯度，(C)恒定為4％，流速1ml/min，所述線性梯度如下從(A)中14％(B)開始洗脫；(A)中14-28.4％(B)，0-30min；(A)中28.4-50％(B)，30-60min；(A)中50-86％(B)，60-65min；65-70min等度洗脫。
采用如上所述的配備API-ES電離室并且與HP系列1100質譜選擇性檢測器(G1946A型)連接的HP 1100系列HPLC，對純化流分進行HPLC/MS分析。緩沖試劑通過一個三通加入到臨進入質譜儀的HPLC的洗出液流中，緩沖試劑用HP 1100系列HPLC泵傳遞，繞過脫氣裝置。以負離子模式分析的條件包括0.75M氫氧化銨作為緩沖劑，流速0.04ml/min，毛細管電壓3kV，裂分電壓75V，霧化壓力25psig，于溫度350℃干燥氣體。采用掃描模式和選定離子監測(SIM)，在HPChemStation上收集數據。在質量范圍m/z 100-3000內，以每周期1.96秒，對光譜掃描。在臨進入MS之前，通過一個額外輔助泵，用氫氧化銨調節洗出物的pH至接近中性。該處理對抗由于在流動相中酸濃度升高所致的(-)-表兒茶素標準品負離子化的抑制。采用于波長280nm的UV檢測，結合比較每類寡聚體的離子豐度比，通過峰面積測定每個流分的純度。
可可和巧克力中矢車菊苷配質的定量使用市售(-)-表兒茶素，制備單體的復合標準品。通過上述方法，獲得純化狀態的二聚體至十聚體。采用帶有熒光檢測的上述正相HPLC方法，激發波長和發射波長分別為276nm和316nm，分析使用這些化合物的標準品儲備液。將峰分組，其面積相加，以包括來自任一類寡聚體的所有異構體，采用二次擬合(quadratic fit)，產生校準曲線。單體和小寡聚體的曲線幾乎為線性，與前面應用線性回歸產生基于單體和基于二聚體的校準曲線的應用相符。
然后用這些校準曲線計算如下制備的樣品中的矢車菊苷配質濃度首先，采用三次己烷提取(各45ml)，將可可樣品或巧克力樣品(約8克)脫脂。接下來，用5ml丙酮/水/乙酸混合物(70∶29.5∶0.5v/v)，提取1克脫脂材料。然后通過將樣品的HPLC數據與如上所述獲得的校準曲線(使用純化寡聚體)進行比較，確定脫脂材料中的矢車菊苷配質的量。根據the Association of Official Analytical Chemists(AOAC OfficialMethod 920.177)，采用標準化方法，測定樣品的脂肪百分率(對于巧克力，使用1克樣品規格；或者對于漿液，使用0.5克樣品規格)。然后計算原始樣品(含有脂肪)中總矢車菊苷配質水平的量。在每個樣品色譜分離之前進行校準，以防止柱之間的變異。
實施例2臨床研究募集16位受治療者參加隨機化臨床試驗，臨床試驗包括服用阿司匹林、高矢車菊苷配質飲料或者兩者的組合。已知受治療者無病、不吸煙，年齡在20-55歲之間。所述個體為隨機化單位。
參加者被告知在所述試驗前戒除非甾體消炎藥至少4天、戒除酒精飲料至少2天、戒除含有咖啡因或可可堿的食物至少24小時，以及在試驗當天戒除非甾體消炎藥、酒精飲料和含有咖啡因或可可堿的食物。在所述研究的前一晚并且至空腹到第二天的10p.m.，指導所述受治療者保持低植物化學品攝入。[植物化學品是植物的組成成分。具有高植物化學品含量的食品和飲料的實例包多種水果、咖啡、某些茶葉、青椒、大蒜、洋蔥、酸乳酪、麥麩和十字花科蔬菜例如嫩莖花椰菜、卷心菜和花椰菜]。
在食用任何食物之前，抽取所述受治療者的血液。在抽取原始血液之后，將所述受治療者分成四組。第一組消耗81mg阿司匹林(乙酰水楊酸)(Bayer兒科阿司匹林)。第二組消耗高可可多酚飲料，該飲料由18.75g富含矢車菊苷配質的可可粉(來源于Sulawesi豆(含有51.1mg/g總矢車菊苷配質、11.2％脂肪、0.092％咖啡因、1.618％可可堿))和12.5g用300ml蒸餾水混合的蔗糖組成。第三組消耗高可可矢車菊苷配質飲料和81mg嬰兒阿司匹林。最后一組消耗81mg嬰兒阿司匹林和不含矢車菊苷配質的可可飲料，該可可飲料由18.75g可可粉(含有0.45mg/g總矢車菊苷配質、9.87％脂肪、2.063％可可堿、0.234％咖啡因)和12.5g用300ml蒸餾水混合的蔗糖組成。在試驗期間，允許所述受治療者喝水、無咖啡因汽水(diet soda)、過水面包圈(bagels)、低脂肪奶油干酪和香蕉。在消耗所述治療藥物后2小時和6小時，從每位受治療者抽取血液。將靜脈血抽取后置于裝有0.5ml 3.2％緩沖檸檬酸鈉溶液的抽空試管中。
采用血小板功能分析儀(PFA-100TM，Dade Behring International，Miami，Fla.)，按照生產商的說明，測量血小板聚集的抑制。該系統包括微處理機控制的儀器和裝有生物活性膜的一次性試驗藥筒。該儀器在恒定真空下從樣品貯庫中通過毛細管和所述膜中刻出的顯微孔抽吸血樣。所述膜用膠原蛋白和腎上腺素包被。這些生物化學刺激物的存在、在標準化流動條件下產生的高剪切速度導致血小板附著、活化和聚集，在所述孔上慢慢地形成穩定的血小板栓。達到所述孔完全阻塞所需的以秒計的時間報告為“閉合時間(closure time)”(Kundu等，“介紹一種體外血小板功能分析儀一PFA-100(Description of an in vitroplatelet function analyzer-PFA-100)”Semin Thromb Hemost 21增刊2106-12，1995)。眾所周知，阿司匹林治療導致血小板聚集減少，進而引起根據PFA-100測量的閉合時間增加(Marshall等，“在健康自愿者中，比較阿司匹林對采用Simplate方法測量的出血時間和采用PFA-100測量的閉合時間的影響(A comparison of the effects ofaspirin on bleedingtime measured using the Simplate method and closure time measured usingthe PFA-100，in healthy volunteers)”，Br J Clin Pharmacol 44151-155，1997)。
結果表明，在2小時時間點，所有4種治療均導致與基線水平相比的閉合時間增加(p＜0.05)。此外，阿司匹林治療和可可加上阿司匹林治療之間的比較表明，這兩種治療的閉合時間之間有差異(p＜0.08)。這證明阿司匹林與可可矢車菊苷配質寡聚體聯合，增強阿司匹林抑制血小板活化的能力。單獨用阿司匹林治療以及用阿司匹林加上不含CP的可可治療后的閉合時間之間沒有差異，表明所述增強的效應依賴于可可中的矢車菊苷配質的存在。所述結果也證明，阿司匹林加上可可治療以及阿司匹林加上不含CP的可可治療在其閉合時間方面有顯著性差異(p＜0.06)，證實所述可可/阿司匹林組合的增強效應依賴于所述矢車菊苷配質的存在。
也對所述血樣中由于所述四種治療方案引起的白三烯、前列環素和血栓烷水平的變化進行了分析。免疫測定法依照以下文獻所述進行Westcott等，“大鼠肺中6-酮基PGF1α、5-HETE和LTC4的分析GM/MS，RIA和EIA的比較(Analysis Of 6-Keto PGF1 Alpha，5-HETE，And LTC4 In Rat LungComparison Of GM/MS，RIA and EIA)”，Prostaglandins32857-873，1986；Yakota等，“血液和尿液中的前列腺素類激素的酶免疫測定(Enzyme Immunoassay Of Prostanoids In Blood AndUrine)”，Adv.Prostgl.Thrombox.Leukot.Res.1533-34，1985；和Schramm等，“小分子量和大分子量植物化學品對內皮細胞類花生酸分泌的差別效應(D)ifferential Effects of Small and Large Molecular WeightPhytochemicals on Endothelial Cell Eicosanoid Secretion)”J Agric FoodChem 461900-1905，1998。前列環素(PGI2)代謝物6-酮基前列腺素F1-α用Cayman酶免疫測定#515211來測定，血栓烷(TXA2)代謝物TXB2用Cayman酶免疫測定519031來測定，而白三烯C4、D4和E4使用得自Oxford Biomedical Research的免疫測定EA-39來定量。運用成對樣品T-檢驗計算P值。p＜0.05的數值被認為具有統計學顯著性。類花生酸研究數據示于表1和圖1中。無阿司匹林加上不含矢車菊苷配質的可可的所有治療都導致致動脈粥樣化性(atherogenic)與動脈粥樣化抑制性(atherostatic)類花生酸的比率下降，表明所有治療對于血管健康和預防缺血發作都是有益的，所述治療得到的閉合時間的增加至少部分是由于所述類花生酸的調節所致。結果表明，富含CP的可可加上阿司匹林引起致動脈粥樣化白三烯水平的降低，而引起動脈粥樣化抑制性前列環素水平增加。相比之下，不含CP的可可加上阿司匹林治療導致前列環素水平降低以及白三烯水平增加。這些結果表明，可可的動脈粥樣化抑制效應依賴于所述矢車菊苷配質的存在。
有趣的是，這些結果表明，對于阿司匹林治療和高可可矢車菊苷配質可可治療，它們導致抗血小板活性的機制不同。阿司匹林的作用機制是通過抑制花生四烯酸途徑(通過抑制前列腺素的產生)，進而導致血栓烷水平下降，從而預防依賴血栓烷的血小板活化。這解釋了阿司匹林的抗血栓形成效應。正如表1中所觀察到的，涉及阿司匹林的所有三種治療都導致在消耗所述治療藥物后2小時和6小時時的血漿血栓烷水平顯著降低，而高可可矢車菊苷配質可可治療不改變血漿血栓烷水平。這被顯示出高可可矢車菊苷配質和阿司匹林聯合的治療并不導致血栓烷水平降低單獨的阿司匹林治療達到的血漿血栓烷水平以下的結果所證實。與這些結果相反，PFA-100數據揭示，高可可矢車菊苷配質和阿司匹林的聯合治療導致比每種單一療法的閉合時間增加，即增強所述治療效應。
因此，看來可可矢車菊苷配質的抗血小板活性不依賴于花生四烯酸途徑的抑制。這一事實有兩種明顯的暗示。首先，已記載的阿司匹林副作用，即由于抑制花生四烯酸途徑引起的副作用，將不會由于用所述可可矢車菊苷配質治療而引起。其次，用所述聯合治療可能導致協同的抗血小板作用，每種組分(阿司匹林和富含可可矢車菊苷配質的可可)通過不同的機制影響抗血小板活性。
總之，用阿司匹林和富含可可矢車菊苷配質的可可組合的療法導致血小板活性降低，該作用是相加的且可能是協同的。也有證據說明，共同給予可可和阿司匹林增強阿司匹林的活性，使得可以應用低得多的劑量來達到類似的藥效，而使阿司匹林的有害副作用減至最小。
實施例3消耗富含矢車菊苷配質的飲料并聯合阿司匹林對血小板活性的影響研究了消耗有效量的可可飲料并聯合阿司匹林對血小板活化的影響。
也讓前項研究中所用的受治療者參加表面蛋白表達研究。有關治療方案和收集血液的方法與前述實施例中概述的方法相同。
在抽血后10分鐘內，將全血在聚苯乙烯試管中在存在或不存在肽Arg-Gly-Ser(Sigma，St.Louis，MO)的情況下與10μM HEPES緩沖液(pH7.4，未經刺激的對照)、20或100μM ADP或20μM腎上腺素(BioData，Horsham，PA))在室溫下孵育5分鐘。5分鐘后，將樣品懸浮于1ml HEPES緩沖液中，然后將100μM樣品轉移到裝有飽和濃度(20μM)的每種以下熒光標記的單克隆抗體的試管中PAC1-異硫氰酸熒光素(FITC)、抗CD62P-藻紅蛋白(PE)和抗CD42a-PerCP。PAC1識別纖維蛋白原結合受體GPIIb-IIIa的活化構象，而抗CD62P識別存在于活化血小板表面的P-選擇蛋白。抗CD42a識別存在于活化血小板和靜息血小板兩者表面的GP1b-1X。小鼠IgG、FITC和小鼠IgG、PE用作同種型對照。使用Arg-Gly-Asp-Ser-肽阻斷所述PAC1抗體與血小板的結合，從而在流式細胞儀上設置陰性對照標記。抗體和同種型對照購自Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Inc.，San Jose，CA。
在存在和不存在激動劑ADP和腎上腺素的情況下，將全血樣品與單克隆抗體或同種型對照在室溫下避光孵育20分鐘。然后將樣品在經過濾的1％低聚甲醛(pH7.2)中固定，于2-8℃避光保存。所有樣品都在48小時內在FACScan流式細胞儀上運用LYSYS II軟件進行分析。該流式細胞儀的性能使用1μm、2μm和10μm校準微珠(Becton DickinsonImmunocytometry Systems，Inc.，San Jose，CA和Flow Cytometry Systems，Research Triangle Park，NC)加以證實。以列表方式收集2萬個事件的對數代碼(in logarithmic code)的全光散射和熒光參數。基于光散射和CD42a表達門控血小板。活化血小板定義為共表達GPIIb-IIIa或P-選擇蛋白活化構象的CD42a陽性事件百分率。血小板微粒定義為大小小于2μm的CD42a陽性事件百分率。
為了對結果進行統計學分析，運用秩的Friedman氏重復測量ANOVA(秩的RM ANOVA(RM ANOVA on rank))比較每個治療組中的基線、2小時和6小時結果。對于post hoc多重比較運用Tukey氏所有成對比較。P值小于0.05被認為有顯著性。也對治療組中每個時間點即基線、2小時和6小時，分析血小板依賴性穩態數據的統計學差異。結果在有和無弱激動劑ADP和腎上腺素的刺激下，消耗可可和阿司匹林對離體表達GPIIb/IIIa血小板受體活化構象的影響示于圖2、圖3和圖4。
在血小板活化后，GPIIb/IIIa受體經歷了構象變化，使其能夠結合纖維蛋白原和von Willebrand因子。通過配體與活化GPIIb/IIIa受體結合形成血小板間的橋對于血小板聚集和血栓形成是必需的。
參考圖2B，與基線相比，(+)-可可消耗后6小時增加未經刺激的GPIIb/IIIa表達(P＜0.001)。其它治療不明顯影響未經刺激的GPIIb/IIIa表達。
參考圖3C，與基線相比，ADP誘導的GPIIb/IIIa表達在消耗ASA+(+)-可可后6小時被抑制(P＝0.004)。相反，如圖3D所示，與基線或2小時相比，消耗ASA+(-)-可可后6小時增加ADP誘導的GPIIb/IIIa表達(P＝0.005)。
如圖4A所示，與基線相比，ASA消耗后6小時抑制腎上腺素誘導的GPIIb/IIIa表達(P＝0.003)。與基線相比，消耗(+)-可可后2小時抑制腎上腺素誘導的GPIIb/IIIa表達(P＝0.005；圖4B)。與基線相比，聯合消耗ASA+(+)-可可后2小時和6小時抑制腎上腺素誘導的GPIIb/IIIa表達(P＝0.006；圖4C)。相反，在消耗ASA+(-)-可可后，腎上腺素誘導的GPIIb/IIIa表達沒有顯著變化(圖4D)。
在有或無弱激動劑ADP和腎上腺素的刺激下，可可和阿司匹林消耗對P-選擇蛋白的離體血小板表面表達(CD62)的影響示于表2。P-選擇蛋白在活化血小板表面表達。所述治療不顯著影響未經刺激的P-選擇蛋白表達。消耗ASA+(-)-可可是2小時時抑制ADP誘導的P-選擇蛋白表達的唯一治療(P＝0.001)。
與基線相比，消耗ASA后6小時抑制腎上腺素誘導的P-選擇蛋白表達(P＝0.028)，而(+)-可可沒有作用。與基線相比，聯合消耗ASA+(+)-可可后2小時和6小時抑制腎上腺素誘導的P-選擇蛋白表達(P＝0.014)。相反，聯合消耗ASA+(-)-可可對腎上腺素誘導的P-選擇蛋白表達不引起顯著變化。
實施例4片劑制劑使用依照美國專利第6,015,913號中所述方法獲得的高可可矢車菊苷配質可可固體制備片劑制劑，該專利通過引用結合到本文中。簡而言之，該食用物質通過與其傳統方法處理的可可中存在的水平相比增強天然存在的可可矢車菊苷配質的方法來制備，使得在未經加工的可可豆的可可矢車菊苷配質的原始含量與在加工后獲得的含量的比率小于或等于2。為簡便起見，本文將該可可固體材料稱為CP-可可固體。
片劑組方劑(formula)包含以下組分(百分率以重量百分率表示)CP-可可固體 24.0％4-倍天然香草提取物(Bush Boake Allen) 1.5％硬脂酸鎂(干燥潤滑劑)(AerChem，Inc.) 0.5％Dipac制片用糖(Amstar Sugar Corp.)37.0％木糖醇(American Xyrofin，Inc.) 37.0％阿司匹林 50mg將CP-可可固體和香草提取物一起在食品加工機器中混合2分鐘。將阿司匹林、糖和硬脂酸鎂溫和地混合在一起，然后在CP-可可固體/香草混合物中混合。使該材料在最大壓力下通過Manesty壓片機(B3B)，將其壓縮以生產圓形片劑(15mm×5mm)，重1.5-1.8克。
或者，CP以含有總共約600mg的矢車菊苷配質單體和寡聚體的提取物形式使用。
本領域技術人員可以容易地制備如下的其它片劑組方劑包括各種食用香料、著色劑、賦形劑、維生素、礦物質、OTC藥物、糖填充劑、UV防護劑(例如二氧化鈦、著色劑等)、粘合劑、水凝膠等，但不包括聚乙烯吡咯烷酮，因為它會不可逆地結合所述可可矢車菊苷配質或組合的多種化合物。可以調整糖填充劑的用量以調控可可矢車菊苷配質或組合的多種化合物的劑量。
實施例5膠囊制劑實施例4中公開的片劑的一種變化，即包含與阿司匹林聯合的可可矢車菊苷配質的口服劑型用由明膠制成的推入配合型(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑(例如甘油)制成的密封軟膠囊制備。所述推入配合膠囊含有粉末形式的本發明化合物或多種化合物的組合或如實施例4中所述的CP-可可固體，該粉末形式可以任選地與諸如乳糖或蔗糖的填充劑混合，以控制所述可可矢車菊苷配質的劑量。在軟膠囊中，將所述經分離的可可矢車菊苷配質或CP-可可固體懸浮于合適液體例如脂肪油或可可脂或其中的組合中。所述膠囊劑可以含有UV防護劑例如二氧化鈦或合適的著色劑，以防止UV損害。所述膠囊劑也可以含有諸如實施例4中列舉的那些填充劑。
實施例6甲基化矢車菊苷配質甲基化可可矢車菊苷配質對血管平滑肌的影響示于本實施例中。使用測量兔主動脈環中內皮依賴性松弛(EDR)的體外方法。可可多酚和矢車菊苷配質代謝物的制備通過將純化可可矢車菊苷配質四聚體流分(依照Romanczyk等的美國專利第5,554,645號中所述分離的)與重氮甲烷試劑反應，制備甲基化四聚體。
為了制備所述重氮甲烷試劑，使用Diazald試劑盒重氮甲烷發生器(Diazald Kit Diazomethane Generator)(Aldrich Chemicals)。所述反應物由兩種試劑組成。對于第一種試劑，將5g KOH溶于8ml水中，然后加入10ml MeOH。將所述試劑置于用作反應容器的圓底燒瓶中。將該反應容器與冷凝器和在冰浴中冷卻的收集瓶連接。乙醚收集器位于側臂。通過將5g Diazald溶于45ml重蒸餾的乙醚中制備第二種試劑。將該試劑置于所述反應容器上的分液漏斗中。使用水浴讓反應容器溫至65℃。以與蒸餾速率相等的速率將Diazald溶液滴加到所述KOH溶液中。當Diazald用完時，用10ml乙醚沖洗分液漏斗。
將100mg四聚體懸浮于3ml甲醇中。加入12ml重氮甲烷試劑。讓混合物在室溫下反應20分鐘，然后讓其在冷藏箱(-7℃)中反應過夜。通過加入2.5ml 10％乙酸的甲醇溶液終止反應。在氮氣流下除去溶劑，固體真空干燥。
使用API-ES質譜以負離子模式監測所述反應。采用流速1ml/min注射10μl由8％ 10mM乙酸銨的甲醇和92％甲醇組成的溶液。使用3500V的毛細管電壓以及100V的裂分電壓實現電離。在質量范圍為m/z 500-1000內對波譜掃描。質譜數據顯示，在反應結束時，不存在未甲基化四聚體。大多數反應產物在14-18位的羥基被甲基化。某些四聚體在所有20個位置全部甲基化。內皮依賴性松弛雄性新西蘭白兔(重2.5-3kg)用戊巴比妥(50mg/kg)外周麻醉(terminally ansesthetized)。切下胸主動脈，小心地清除粘連脂肪和結締組織。然后將主動脈切成多個環(長3-4mm)，在常規20ml裝有Krebs碳酸氫鹽緩沖液的器官浴中固定，所述緩沖液的組成(m Mol/l)為NaCl116.0、KCl 5.4、CaCl21.2、NaHCO322.0、NaH2PO41.2、MgCl21.2和葡萄糖10.1，于37℃、pH7.4保持，然后連續通入95％O2--5％CO2混合物。將組織與力置換傳感器(force displacement transducer)(GrassInstrument Co.，Quincy MA Model FT03C)連接，拉至基礎張力為8g。
將所述環在器官浴中平衡90分鐘，此后將它們用去甲腎上腺素(10-5M)預收縮。通過乙酰膽堿(10-5M)誘導40％或更高預收縮環的松弛能力，評價所有制備物中功能性內皮的存在。這些方法的細節先前已發表(Kappagoda，Cardiovascular Res.25270-82，1991)。具有功能性內皮的主動脈環用去甲腎上腺素(10-5M)預收縮。當收縮達到穩定狀態時，以濃度10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和2.5×10-4，加入甲基化四聚體。結果示于表3中。4個獨立主動脈環的結果表明，所述甲基化四聚體具有松弛效應。因此，這些衍生物在其保持血管健康和治療血管疾病的能力方面與母體化合物一樣有效的。表3.甲基化四聚體對4個獨立兔主動脈環的劑量反應松弛
表12小時 阿司匹林可可可可+阿司匹林(-)-可可+阿司匹林前列環素 103 107104 95血栓烷 9199 9289白三烯 101 10097105LT/PG12比率 9993 94112TXB2/PG12比率8989 88956小時 阿司匹林可可可可+阿司匹林(-)-可可+阿司匹林前列環素 104 107 102 77血栓烷 89 99 9179白三烯 100 99 9994LT/PG12比率 100 93 96120TXB2/PG12比率86 89 8894
表權利要求
1.一種適合于攝入的組合物，所述組合物包含在生理可接受的載體中的阿司匹林和可可矢車菊苷配質。
2.一種權利要求1的組合物，所述組合物是一種藥用組合物、食品、食物增補劑或食品添加劑。
3.一種權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述可可矢車菊苷配質是單體。
4.一種權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述可可矢車菊苷配質是二聚體。
5.一種權利要求1或權利要求2的組合物，其中所述可可矢車菊苷配質是寡聚體。
6.一種權利要求5的組合物，其中所述寡聚體是可可矢車菊苷配質寡聚體2-18或它們的混合物。
7.一種前述權利要求中任一項的組合物，其中所述可可矢車菊苷配質是單體、寡聚體或它們的混合物，所述單體、寡聚體或混合物可通過以下方法獲得(a)脫脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力漿、部分脫脂可可固體或全脫脂可可固體用可可矢車菊苷配質可溶于其中的溶劑萃取；且(b)從所得的可可提取物中分離包含所需矢車菊苷配質單體、寡聚體或混合物的部分。
8.阿司匹林和可可矢車菊苷配質在生產用來治療或預防由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑方面的應用。
9.阿司匹林在生產與可可矢車菊苷配質一起使用以預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑方面的應用。
10.可可矢車菊苷配質在生產與阿司匹林一起使用以預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑方面的應用。
11.權利要求8-10中任一項的應用，其中所述可可矢車菊苷配質是單體。
12.權利要求8-10的應用，其中所述可可矢車菊苷配質是二聚體。
13.權利要求8-10的應用，其中所述可可矢車菊苷配質是寡聚體。
14.權利要求13的應用，其中所述寡聚體是可可矢車菊苷配質寡聚體2-18或它們的混合物。
15.權利要求8-14中任一項的應用，其中所述可可多酚是可可矢車菊苷配質寡聚體、單體或它們的混合物，所述單體、寡聚體或混合物可通過以下方法獲得(a)脫脂磨碎的可可碎仁、可可碎仁部分、巧克力漿、部分脫脂可可固體或全脫脂可可固體用可可矢車菊苷配質可溶于其中的溶劑萃取；且(b)從所得的可可提取物中分離包含所述矢車菊苷配質寡聚體或每種矢車菊苷配質寡聚體的部分。
16.權利要求8-14中任一項的應用，其中所述藥物、食品、食物增補劑或食品添加劑用來預防或治療心血管疾病或炎性疾病或障礙。
17.一種包含可供分開、同時或順序使用以治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的阿司匹林和可可矢車菊苷配質的制品。
18.一種權利要求17的制品，其中所述可可矢車菊苷配質存在于可可矢車菊苷配質水平增加或保持的可可成分中。
19.一種權利要求17或權利要求18的制品，其中所述可可成分得自發酵系數為275或275以下的可可豆。
20.一種權利要求18或權利要求19的制品，其中所述可可成分包含可通過以下方法獲得的可可固體(a)將可可豆加熱至恰好足以使含水量降低至約3％重量并使可可殼裂開的可可豆內部溫度；(b)從可可殼風選可可碎仁；(c)螺桿壓榨所述可可碎仁；和(d)回收含有可可矢車菊苷配質的可可脂和部分脫脂可可固體。
21.權利要求17-20中任一項的制品，其中所述可可成分是一種飲料混合劑。
22.聯合應用以預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的阿司匹林和可可矢車菊苷配質。
23.一種用來預防或治療由血小板功能障礙引起的疾病或障礙的藥物，所述藥物包含阿司匹林和可可矢車菊苷配質。
24.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含阿司匹林和可可矢車菊苷配質。
25.一種治療或預防與血小板功能障礙相關的病癥的方法，所述方法包括給予受治療者治療或預防所述血小板功能障礙聯合有效量的可可矢車菊苷配質和阿司匹林。
26.權利要求25的方法，其中所述可可矢車菊苷配質是單體。
27.權利要求25的方法，其中所述可可矢車菊苷配質是二聚體。
28.權利要求25的方法，其中所述可可矢車菊苷配質是寡聚體。
29.權利要求25的方法，其中所述可可矢車菊苷配質和所述阿司匹林在同一組合物中給予。
30.權利要求25的方法，其中所述可可矢車菊苷配質和所述阿司匹林分開給予。
31.一種治療或預防與血小板功能障礙相關的病癥的方法，所述方法包括給予受治療者治療或預防所述血小板功能障礙聯合有效量的可可矢車菊苷配質衍生物和阿司匹林。
32.權利要求31的方法，其中所述可可矢車菊苷配質衍生物是甲基化可可矢車菊苷配質。
33.權利要求31的方法，其中所述可可矢車菊苷配質衍生物是沒食子酸化可可矢車菊苷配質。
全文摘要
本發明涉及應用與阿司匹林聯合的可可矢車菊苷配質作為抗血小板治療和包含可可矢車菊苷配質和阿司匹林(乙酰水楊酸)的組合物。
文檔編號A61K31/353GK1450901SQ01809739
公開日2003年10月22日 申請日期2001年3月22日 優先權日2000年3月22日
發明者H·H·施密茨, L·J·小羅曼茨克 申請人:馬爾斯公司