專利名稱：含有誘導產生il－6的物質的減肥組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有減肥活性物質的化妝組合物。
在化妝組合物中的這些活性物質選自下面稱之NPY的Y神經肽受體的拮抗劑，α2受體的拮抗劑和產生下面稱之IL-6的白細胞間素-6的誘導劑。
NPY拮抗劑、α2拮抗劑或產生IL-6的誘導劑可以是一種非肽化合物、肽、動物或植物源細胞或組織的提取物或采用如細菌或食用傘菌微生物發酵所得到的產物。
這種減肥組合物Am1在皮下脂肪組織中起作用，并且控制釋放脂肪細胞中儲存的脂肪。
在阻斷α2和NPY受體時，組合物Am1能夠疏通過度生長的脂肪細胞，還能夠避免任何新的過度儲存脂肪細胞，同時能夠表達β受體，該受體的前解脂活性可被皮下脂肪組織中嚴重過剩的α2和NPY抗解脂受體正常掩蔽。組合物Am1因此能夠有效地對脂肪細胞中儲存的脂肪酸消散起作用。
本發明的這些組合物保持了這種活性，但它們通過下述兩種作用完成其發明的一種作用延緩脂肪酸進入，這種作用是在產生LPL，負責脂肪酸進入細胞的酶時通過還原作用所施加的，另一種作用延緩脂肪細胞過度增生。使用能誘導脂肪細胞產生IL-6的物質可以達到這種完全意料之外的作用。這種物質是用在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登記號為I 1844的微生物產生的。這種活性物質在下面稱之物質C。
長久以來由于只是考慮它們的能量儲備作用，所以近些年來才證明脂肪細胞的內分泌和分泌細胞作用(Ailhaud G等人，《藥物/科學》(Médecine/Science)1998，14，858-864)。萊普亭(leptine)完全說明了脂肪細胞的這種新分泌作用。這種蛋白質是由成熟脂肪細胞以特定方式產生的。控制食飽感時涉及這種蛋白質，在調節脂肪沉積時也涉及這種蛋白質。脂肪細胞因此保證產生能調節脂肪組織生理學的內分泌和副分泌活性因子。特別地，最近已證明兩種特定的介質運用了脂肪細胞的內分泌作用-溶血磷脂酸(LPA)，一種類脂因子，活化α2受體可緩和產生這種因子，該因子的作用在于補充新的脂肪細胞(Valet P.等人《J.Clin.Invest.》1998，10(7)，1431-1438)。
-IL-6，它是多功能的細胞活素。
物質C作為用角質化細胞產生IL-6的誘導劑是已知的。在國際專利申請WO 99/40896中描述過它的制備方法。它對皮膚老化起作用。但有關(微生物I 1844產生的)這種物質對脂肪細胞的雙重作用什么都沒有提及過。
近來研究表明，脂肪細胞能夠產生IL-6，它在脂肪細胞中的作用是抑制LPL，即負責脂肪酸進入脂肪細胞的酶的合成(Greenberg A.S.等人，《癌研究》(Cancer Research)，1992，52，4113-4116)。
皮下脂肪組織細胞產生IL-6與肥胖指數增加為正相關(MohamedAli V.等人，《J.Clin.Endocrinol.Metab.》1997，82，4196-4200)，但隨脂肪組織來源不同也有不同。
因此，在肥胖的研究對象中，從網膜部位取出的深層脂肪細胞釋放IL-6比皮下脂肪細胞高2-3倍(Fried S.K.等人，《J.Clin.Endocrinol.Metab.》1998，83，847-860)。
最后，除了IL-6降低由脂肪細胞產生LPL的能力外，IL-6還能夠通過抑制作用對脂肪細胞的前體細胞的分化起作用(Hauner H.等人，《第8屆國際肥胖會議》(8thInternational Congress onObesity)，1999，47-53)。
IL-6因此作為一種細胞活素出現，該細胞活素以自分泌(對LPL)和副分泌(對前脂肪細胞)方式起作用，減緩皮下脂肪組織的發育。
但是，作為任何的細胞活素，IL-6是一種多效性的糖蛋白，即該糖蛋白隨產生它的細胞不同而具有不同的作用。因此，在脂肪細胞內，IL-6應具有已經知道角化細胞所具有的所有其他性質的作用。
特別地，在脂肪細胞中，由該細胞合成的IL-6使其含量降低，因此也調節了保證脂肪進入的酶活性。
因此，本發明的組合物能夠控制脂肪細胞沉積和肥大的脂肪酸進入和出去的現象。它還能對脂肪細胞增生起作用。
人們知道，在整個人的生命中，人體中都在生成新的脂肪細胞。因此，從老年人身體上都可分離出“睡眠的”脂肪細胞，無論它們的性別如何(Alihaud G.等人，《J.Obes.Relat.Metab.Disord.》，1992，16(2)，517-521；Spiegelman B.等人，《細胞》(Cell)，1996，87，377-389；Hauner等人，《J.Clin.Invest.》，1989，84，1663-1670)。
脂肪組織的發育導致脂肪酸過量積累續發的脂肪細胞尺寸增加，同時還導致募集新脂肪細胞，而這些新脂肪細胞來源于脂肪細胞的前體細胞，前-脂肪細胞的擴增和分化(ValetP.等人，《J.Clin.Invest.》，101(7)，1431-1438)。
這種募集新的脂肪細胞會受到肥大脂肪細胞產生的溶解因子的破壞；特別地，通過α2受體的刺激作用受到LPA破壞，以及通過IL-6對前-脂肪細胞分化的控制能力受到IL-6破壞。
阻斷α2受體因此在本質上能獲得脂解方面的好處，同時還能抑制LPA釋放，其有利之處是抑制募集新的脂肪細胞。
IL-6限制前-脂肪細胞突變成分化的脂肪細胞。用IL-6誘導體的脂肪細胞刺激產生這種細胞活素增強了這種性質。
曾進行許多研究，證明用微生物I 1844得到的活性物質，即物質C對成熟脂肪細胞和對脂肪細胞的分化都具有活性。
根據本發明，現在制備一種減肥化妝組合物，它們含有物質A、B和C，在下面它們稱之Am2。
Am2的減肥作用構成臨床研究的課題。
用3T3-L1鼠的細胞系研究了物質C的活體外生物學作用。這種前-脂肪細胞的細胞系在含有10％牛胎血清的DMEM培養基(Dubelco′s最少基本培養基)中進行常規培養后，在如胰島素和消炎痛之類的誘導劑存在下，具有分化成成熟脂肪細胞的性質(Slieker L.《J.Bi ochem.Biophys.Res.Com.》，1998，251，225-229)。在誘導分化后八至十天，3T3-L1細胞具有成熟脂肪細胞的特性。采用形態學方法，在顯微鏡下出現可見的胞質內類脂沉積泡，或采用生化檢測法，測量產生的萊普亭，成熟脂肪細胞獨特產生的(食)飽滿感激素，可以評價從未成熟細胞階段到功能脂肪細胞階段這個過程。
在兩個水平上研究了物質C對脂肪細胞活性的影響。一方面測量這種調制產生脂肪細胞IL-6的活性的能力，另一方面評價它對分化成成熟脂肪細胞的影響。
1-物質C對3T3-L1成熟脂肪細胞產生的IL-6的影響用以體積/體積計1％物質C刺激3T3-L1成熟脂肪細胞(用胰島素(5微克/毫升)和消炎痛(125微摩爾)配合誘導分化10天后得到的)24小時。然后抽取培養上清液，再根據供應商的規定(R & D系統，Abingdon，英國)，采用ELISA(酶連接的ummunosorbent Assay)測量其IL-6的含量。其分泌的IL-6量，與只是用物質C的溶劑(乙醇/水(50/50)混合物，在培養基中稀釋到1/100)處理的對照培養物和用50納克/毫升(ng/ml)參比的IL-6誘導劑，α-TNF刺激的培養物分泌的IL-6量進行比較(Fried S.K.《J.Clin.Endocrinol.Metab.》，1998，83，847-860)。

圖1表明，與用溶劑對照培養物比較，物質C刺激3T3-L1脂肪細胞產生IL-6的因子為約5(分別為9皮克/毫升(pg/ml)對43皮克/毫升)，即參比誘導劑所達到效果的83％(52皮克/毫升)。
得到的結果表明，一方面物質C可識別脂肪細胞作為誘導靶，另一方面在物質C的作用下，脂肪細胞產生的IL-6堿增加因子為5，即使用正對照所達到的最大效果的83％。
考慮到IL-6的已知性質，這樣一種增加首先能夠希望降低負責脂肪酸進入酶，LPL，的合成，然后后續降低脂肪酸的進入。
2-物質C對脂肪細胞分化的影響這第二項研究的目的是研究物質C對生成新脂肪細胞的影響。
一方面通過評價萊普亭激素的合成，該激素是脂肪細胞分化的標記物，另一方面用顯微鏡觀察除功能轉化為成熟脂肪細胞的對照物外的胞質內類脂泡的生成，可以研究物質C對3T3-L1前-脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的影響。在所有情況下，在分化過程開始(如前面一樣誘導)，加入培養物中的物質C為以體積/體積計1％，并且保持直到結束。整兩天都通過ELISA測量(R & D系統，Abingdon，英國)評價萊普亭的合成。
圖2表明在物質C存在下，在10天實驗時間內，產生的萊普亭都停留在極低的水平，大大低于(≤200皮克/毫升)在對照培養物中所觀察的結果，如所預料的，可看到根據分化的誘導作用，從第2天開始對照培養物的萊普亭含量增加，并且增加直到從第6天開始達到最大平臺1200-1400皮克/毫升。物質C抑制合成萊普亭構成阻斷脂肪細胞分化過程的第一個論據。
圖3所顯示的實驗提供了第二個論據，該圖顯示在分化10天后，對照細胞發育成一種成熟脂肪細胞的形態，其中含有很大的類脂泡，它們占據了幾乎全部的(細)胞質空間(A)，而用物質C處理的同樣細胞仍處于非常不成熟的階段，尺寸小得多的泡有稀疏幾個(B)。
使用在文獻中為利用脂肪細胞功能而通常采用的3T3-L1模式時，曾證明物質C具有雙重性質，一種性質是在成熟脂肪細胞中刺激產生IL-6，一種性質是在前體細胞中抑制轉化為成熟脂肪細胞。物質C因此在上游在脂肪細胞成熟之前起作用，在下游在成熟脂肪細胞中刺激產生細胞活素起作用，而細胞活素在限制儲存脂肪酸中起作用。
這些結果證明了用脂肪細胞誘導產生IL-6的這種物質的獨特性質，所述脂肪細胞的自分泌(對產生的細胞)和副分泌(對在產生細胞相鄰的細胞)功能，通過停止前-脂肪細胞(pré-adipocyte)分化同時施加到脂肪酸進入成熟脂肪細胞和募集新脂肪細胞上。
曾使用本發明的減肥組合物進行了初步臨床研究，該組合物含有3種活性物質(下面稱之組合物Am2)。
使用組合物Am2進行了兩項臨床研究。
第一項研究涉及測量皮下脂肪組織的厚度，而第二項研究運用了厘米測量。
1)測量皮下脂肪組織的厚度這項研究的目的是評價含有3種活性物質的新組合物Am2的臨床效率。
使用的方案如下。
研究對象數61位健康女性自愿者，分成兩組(31位使用含有3種活性物質的減肥組合物Am2，30位使用減肥組合物Am1)。
在整個大腿上用環形按摩每天涂敷這些產品兩次，待產品完全滲透后就停止環形按摩。
在兩個月的時間內于T0、T28天、T56天測量皮下脂肪組織的厚度，可以確定評價效率。使用的方法是超聲回波掃描法。
采用皮膚標記和采用探針定位在一定高度上以確定測量部位。
為了便于垂直定位，為了避免測量時組織的任何移動或壓縮，超聲回波掃描探測器放置在穩定的，高度可調節的，與實驗員不相干的設備上。
在標記處相繼地拍攝三次圖像。每個底片進行3次厚度測量。于是總共得到6次測量結果能夠達到±1毫米的精度。
這些測量還配備檢測試驗者的體重，其中包括在試驗中的體重，以及自動-評價分析。
采用Student檢驗t評價這些成對組結果的意義。該t檢驗應用于原值以及應用于這些參數隨試驗時間的變化(與T0相比的值)。
無論該研究組如何，平均重量在整個試驗期間都是穩定不變的，因此不可能是大腿皮下脂肪組織厚度測量變化的根源。
預定的研究條件不能證實組合物Am1很好的減肥效果在涂敷1個月后，觀察到皮下脂肪組織減少0.8％，在2個月觀察減少2.6％。
組合物Am2從涂敷第28天起就能夠達到非常好的減肥效果(p＜10-5)用組合物Am2觀察到的皮下組織降低在1個月為-2.2％，在涂敷2個月為-4.3％。
2)厘米測量(Mesure centimétrique)使用的方案如下。
研究對象數39位女性自愿者，分成兩組，20位使用組合物Am1，19位使用組合物Am2。
在2個月內每天涂敷這些產品兩次。
在左側和右側大腿(在臀彎下面3厘米處)于T0、T28天、T56天采用厘米法評價減肥的效率。
無論該研究組如何，在整個研究期間平均重量基本是恒重的，因此不可能是不同的研究部位皮下脂肪組織厚度測量變化的根源。
表1列出采用厘米法得到的有意義的結果。
表1采用厘米法得到的結果

組合物Am2在T0的減肥活性優于組合物Am1，從涂敷一個月起也是如此。
這兩項研究后得到的結果進行比較能夠得出組合物Am2明顯優于其安慰劑，也說明了與組合物Am1相比，組合物Am2性能更好。
因此，盡管通過物質A+B分攤了一部分作用方式及其脂解效率，但借助物質C對脂肪酸進入脂肪細胞的作用，增強了使用新配方Am2所獲得的利益強度。
由募集的新脂肪細胞活性所支持的這些作用之組合能夠減少大量存在的脂肪組織，并防止其發展。
在制備本發明組合物時，如此構成的提取物與含水溶劑或非水溶劑和通常的稀釋劑混合，而這些稀釋劑與局部應用以及與組合物本身的活性組分是相容的。合適的溶劑和/或稀釋劑應根據運送本發明提取活性組分到皮下脂肪層中的能力進行選擇。
這些組合物一般含有賦形劑或添加劑，根據設計的特定配方需要，它們選自在用于局部涂敷的組合物中通常使用的組分。
例如，它們可以含有增稠劑、軟化劑、潤膚劑、穩定劑、防腐劑、消泡劑、表面活性劑、抗氧化劑、染色劑和/或顏料、香料。
它們還可以含有其他活性組分，這些組分或者具有同類的作用，例如用于調節脂解/脂肪生成的產品，或這類局部組合物中的有效產品，例如膠原質合成的刺激劑，膠原酶或彈性蛋白酶的抑制劑，血管保護劑。
本發明的化妝組合物含有以該組合物總重量計0.00001％-5％物質A、B或C，它們與在制備涂敷在皮膚上的化妝配方時通常使用的賦形劑混合在一起。
所述的百分數可以隨該組合物中包括的組分固有活性不同而在前面指出的范圍內改變。優選地，組分A、B或C是0.0001％-2％。
本發明組合物有利的形式是借助粘合劑載體局部涂敷的流體，后面稱之“藥膏”，這種藥膏能控制活性組分擴散。
本發明的組合物具有良好的穩定性，并且在溫度0-60℃下可以保持使用所必需的時間，而不會出現組分沉積或相分離，也不會降低活性，使其使用受到影響。
這些組合物的耐受性非常好，它們沒有任何的光毒性，在皮膚上長期使用它們沒有任何的副作用。
從開始涂敷起，皮膚表面光滑，皮膚變得更加健康堅實。在涂敷一個月后，皮膚有減肥效果，目視觀察《橘黃色皮膚》外觀改善，形態苗條。
具體實施方案實施例1呈噴灑藥膏形式的減肥組合物

實施例2呈噴灑藥膏形式的減肥組合物

實施例3呈凝膠形式的減肥組合物

實施例4呈乳狀液形式的減肥組合物

實施例5呈凝膠乳狀液形式的減肥組合物

權利要求
1.減肥化妝組合物，該組合物含有至少一種由誘導脂肪細胞產生IL-6的組分，該組分與用于化妝制劑的賦形劑混合。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于由誘導脂肪細胞產生IL-6的組分選自非肽合成化合物、肽、動物或植物源細胞或組織的提取物和來自微生物發酵的產物。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于由誘導脂肪細胞產生IL-6的組分是由選自細菌或食用傘菌的微生物發酵所得到的產物。
4.根據權利要求3所述的組合物，其特征在于由誘導脂肪細胞產生IL-6的組分是能通過Rhodotorula sp菌株發酵得到的組分。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于由誘導脂肪細胞產生IL-6的組分是能通過Rhodotorula sp菌株或其產生的突變體發酵得到的組分，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登記號為I1844。
6.根據權利要求1-5中任一權利要求所述的組合物，其特征在于它還含有α2-拮抗劑和NPY拮抗劑組分。
7.根據權利要求6所述的組合物，其特征在于所述的α2-拮抗劑或NPY拮抗劑組分選自非肽合成產物、動物或植物源組織細胞的提取物和來自微生物發酵的產物。
8.根據權利要求7所述的組合物，其特征在于α2-拮抗劑或NPY拮抗劑組分是能通過選自細菌或食用傘菌的微生物發酵得到的。
9.根據權利要求8所述的組合物，其特征在于α2-拮抗劑組分是能通過Bacillus licheniformis菌株或其產生的其中一種突變體發酵得到的，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登記號為I1778。
10.根據權利要求8所述的組合物，其特征在于NPY拮抗劑組分是能通過Streptomyces sp菌株或其產生的其中一種突變體發酵得到的，所述菌株在巴斯德研究所的C.N.C.M.保藏，登記號為I1132。
11.局部涂敷用的減肥化妝組合物，該組合物含有NPY-拮抗劑、α2-拮抗劑和由脂肪細胞產生IL-6的誘導劑，與化妝上可接受的賦形劑相結合。
12.根據權利要求11所述的組合物，其特征在于NPY-拮抗劑、α2-拮抗劑和產生IL-6的誘導劑是分別使用在巴斯德研究所的C.N.C.M.分別保藏的I 1132、I 1778和I 1844菌株發酵得到的。
13.根據權利要求12所述的減肥組合物在調節皮膚脂解/脂肪生成中的應用。
全文摘要
本發明涉及減肥化妝組合物，該組合物含有至少一種誘導脂肪細胞產生IL－6的化合物，該化合物與NPY－拮抗劑和/或α
文檔編號A61K8/98GK1420759SQ0081818
公開日2003年5月28日 申請日期2000年11月2日 優先權日1999年11月5日
發明者P·卡塞爾拉斯, J·M·德羅克, J·格斯尼特 申請人:圣諾菲-合成實驗室公司