專利名稱：：基于來源于人及動物病原體基因組構建體的dna疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明主要涉及疫苗組合物及其使用方法。更特別地，本發明涉及通過施用一個或多個大的基因組DNA片段，在受試者體內引發免疫應答。
背景技術：
：誘發細胞介導的免疫應答的疫苗正在作為與寄生蟲、自身免疫失調、過敏性疾病和癌癥斗爭的重要策略出現。傳統的接種疫苗策略通常包括施用“活的”或“死的”疫苗。Ertl等(1996)J.Immunol.1563579-3582.所謂的活疫苗包括減毒微生物和基于活載體的重組分子。死的疫苗包括那些基于不再有傳染力(killed)的完整的病原體，和亞單位疫苗，如可溶的病原體亞單位或蛋白質亞單位。活疫苗通常成功地在已免疫的受試者體內提供一個有效的免疫應答；然而，這樣的疫苗在免疫損害的(immunocompromised)或懷孕的受試者中可能是危險的，可能恢復為致病的生物體，或可能被其它的病原體污染。Hassett等(1996)TrendsinMicrobiol.8:307-312。死的疫苗避免了與活疫苗關聯的安全問題；然而這樣的疫苗經常未能在被免疫的受試者中提供一個適當的和/或有效的免疫應答。更最近，使用針和注射器，肌肉內注射(Wolff等(1990)Science24714651468)或真皮內注射(Raz等(1994)PNASUSA919519-9523)直接質粒DNA已經被描述。另外一個被稱為發射(ballistic)的或顆粒介導的DNA遞送的方法使用一個不需要顆粒的遞送設備直接將DNA包被的精微金珠施用于表皮層的細胞之內(楊等(1990)PNASUSA879568-9572)。因此，許多的遞送技術能用來遞送免疫用的核酸，包括顆粒介導的技術，其遞送核酸包被的微顆粒進入目的組織之內。(參見，例如，1999年2月2日發布的共同擁有的美國專利5,865,796號)已經表明，在表皮內遞送了納克量的DNA之后，顆粒介導的核酸免疫技術能引發體液和殺傷性T淋巴細胞免疫應答。Pertmer等(1995)Vaccine131427-1430。這些顆粒介導的遞送技術已同其它類型核酸接種比較，并且發現是明顯的優越者。Fynan等(1995)Int.J.Immunopharmacology1779-83，Fynan等(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA9011478-11482，和Raz等(1994)Proc.Natl.AcadSci.USA919519-9523。已經描述了一種新的穿越皮膚的(transdermal)藥物遞送系統，該系統需要使用無針的注射器來遞送包含受控制劑量的固體藥物的顆粒進入并且通過完整的皮膚。特別地，Bellhouse等人的美國專利號為5,630,796的普遍擁有的專利描述一個顆粒遞送設備(例如，一個無針頭的注射器)，該設備能遞送在超聲波的氣流中產生的藥物顆粒。顆粒遞送設備是用于穿越皮膚的遞送粉狀藥物化合物和組合物的，是用來遞送遺傳物質進入活的細胞(例如，基因療法)之內和遞送生物藥物至皮膚、肌肉、血液或淋巴的。這種設備也能連同外科手術一起使用，用來遞送藥物和生物制劑至器官表面，實體腫瘤和/或外科手術的腔洞(例如，在腫瘤切除術之后的腫瘤床或腔洞)。那些以一種相當結實的微粒子形式合適地制備來的藥物制劑，可被安全地而且容易地使用這樣的設備遞送。一個特別的顆粒遞送設備通常包含一伸長管狀的噴嘴，其上有一個可破裂的隔膜最初封閉經過噴嘴的通路而且堅固地放置在緊鄰噴嘴的上游末端。被遞送的治療用制劑顆粒緊鄰可破裂的隔膜放置而且使用一種供給能量的方式被遞送，這種方式在隔膜的上游一邊施加了一個足夠強的氣壓，從而使隔膜爆裂而產生超聲波氣體流(包含治療用制劑顆粒)通過噴嘴并從其下游末端遞送。顆粒就能如此以1馬赫至8馬赫之間的遞送速度從無針頭的注射器被遞送，而這樣的速率在可破裂的隔膜爆裂之時是很容易獲得的。另外的一個顆粒遞送設備配置通常包括上面所描述的相同元素，只是除了沒有產生在超聲波氣流中的藥物顆粒，而是在噴嘴的下游末端提供有一個雙穩態橫膈膜，它能在靜態的“倒轉(inverted)”位置(這一狀態下，橫膈膜下游的表面呈現一個中央凹陷處，其中包含有藥物顆粒)和活躍的“翻轉(everted)”位置(這一狀態下，橫膈膜下游的表面由于施加在橫膈膜上游表面的超聲沖擊波，而變得外表面是凸起的)。以這種方式，包含在橫膈膜中央凹陷里的藥物顆粒以一個高的初始速度從該設備逐出，以將其穿越皮膚的(transdermal)遞送到目標皮膚或粘膜的表面。使用上述設備配置的穿越皮膚的(transdermal)遞送通常用近似大小范圍常在0.1和250μm之間的顆粒進行。大于約250μm的顆粒也能從這樣的設備遞送，只是具有上限，在這一點顆粒的大小會造成對皮膚細胞的不幸傷害。被遞送的顆粒將會穿透的實際距離依賴于顆粒的大小(例如，假定一粗略球形的顆粒形狀的標稱顆粒直徑)，顆粒的密度，顆粒沖擊皮膚表面的初始速度以及皮膚的密度和動粘度。用于無針頭顆粒注射的靶顆粒密度通常在約0.1和25g/cm3之間，而注射速度通常在約150和3,000米/秒之間。DNA疫苗所能達到的有效保護水平與傳統的蛋白質亞單位疫苗和不再有傳染力的或減毒的病毒疫苗所引發的相似；但是傳統上弱于在從自然感染恢復的康復期動物中所觀察到的水平。Manickan等(1997)CriticalReviewImmunol.17139-154。皰疹感染是極其普遍的并且是由兩種病毒引發的，即單純皰疹病毒類型1(HSV-1)和單純皰疹病毒類型2(HSV-2)。HSV-1通常在孩童時期獲得并且是口部感染的占優勢的原因。HSV-2感染通常與性傳播的生殖感染關聯。然而，多達25％的生殖皰疹是由HSV-1引起的。自然感染似乎在兩種HSV株系之間給予交叉保護，即，感染一個株系的個體(如HSV-1)即使暴露在另一株系(也就是，HSV-2)，也只有低的感染率。Mertz等(1992)An.Intern.Med.116197-202。解釋這些觀察情況的理由還沒有完全被闡明。雖然通過用不再有傳染力的或改良的病毒接種，在小鼠和/或豚鼠體內能達到對單純皰疹病毒(HSV)感染接近完全的保護作用，在康復期動物體內的保護程度成了改進疫苗性能的目標。HSV是一種具有一個約150-160kbp基因組的雙鏈DNA病毒。HSV-1和HSV-2的基因組是共線性的并且在整個基因組上具有大于50％的同源性。對于某些基因，它們的氨基酸一致性在這兩種病毒類型之間達到80到90％。由于這一相似性結果，許多HSV特異的抗體對這兩種病毒類型是交叉反應的。病毒基因組包裹在一個具有膜的二十面體核殼體中。膜(或包膜)包括至少10種病毒編碼的糖蛋白，最豐富的是gB，gC，gD和gE。病毒糖蛋白參與病毒附著在細胞受體及病毒和宿主細胞膜之間的融合這樣的過程，其允許病毒進入細胞之內。糖蛋白位于病毒粒子的表面。結果，它們成了中和抗體和抗體依賴的細胞毒性作用(ADCC)的目標。在一個病毒類型內部，糖蛋白基因的株系-株系的序列可變性是有限的(1到2％)。病毒的基因組也編碼超過70種其它的蛋白質，包括病毒粒子蛋白質，例如VP16和VP22，它們與病毒粒子被膜相關聯，位于衣殼和胞膜之間。此外，一群大約五個ICPs也由病毒編碼。(參見，例如，WO/9516779關于包含ICP4的疫苗)。這些早期蛋白在病毒復制周期的早期合成，與僅在病毒生命周期的晚期合成的胞膜糖蛋白相反。為綜觀HSV的分子結構和構造，可參見，如Roizman和Sears(1996)“Herpessimplexvirusesandtheirreplication”inFieldsVirology，3rded.，Fieldsetal.eds.，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia，PA。一個發展HSV疫苗的方法就是使用被證明具有保護作用和治療作用的分離糖蛋白。參見，如，Burke等，病毒學(virology)(1991)181793-797；Burke等，Rev.Infect.Dis.(1991)13(Suppl11)S906-S911；Straus等，Lancet(1994)3431460-1463；Ho等，J.Virol.(1989)632951-2958；Stanberry等，J.Infect.Dis.(1988)157156-163；和Stanberry等，(1987)J.Infect.Dis.155914-920；Stanberry，L.R.“SubunitViralVaccinesprophylacticandtherapeuticuse.”InAurelianL(ed.)Herpesviruses，theImmuneSystemsandAids.Kluwer，Boston，pp.309-341。然而，臨床實驗未能證明由gB和gD糖蛋白所組成的亞單位疫苗接種人體能產生重要的保護性免疫力。確定編碼免疫原性抗原表位的序列的一個方法包括表達文庫的使用，即已知的表達文庫免疫作用(ELI)。國際公布WO96/31613報告了引入來自cDNA或片段化基因組DNA的克隆表達文庫到受試者體內誘發一個能被定量的免疫應答以便選擇包含有免疫原性抗原表位序列的文庫。選擇池然后被確定并且進行進一步的定性。使用的基因組片段相對小，長度約在10和100堿基對之間。而且，在ELI方法中，基因組片段被拼接到含有一個外源(例如，異源的)啟動子載體上。ELI的基因組克隆的序列仍未經確認，因此，在發展一個特異的疫苗之前，必須廣泛純化和定性任何抗原性的序列。盡管這些報道，仍需要那些引發免疫應答的方法，這些免疫應答更近地模擬動物對抗原的自然反應。本發明提供了對這一問題和其它問題的解決辦法。發明概述本發明提供在受試者體內引發免疫應答的方法和組合物。一方面，本發明提供引起脊椎動物受試者免疫應答的方法，包含有施用攜帶有從一個或多個病原體獲得或來源的基因組DNA片段的構建體。一旦基因組DNA片段施用給受試者，存在于基因組DNA片段的編碼抗原的編碼序列就會表達，其表達量足以引發免疫應答。基因組片段在大小方面優選比5千堿基(kb)大的片段。在某些方法中，構建體是攜帶有大小大約在5kb和25kb之間的基因組DNA片段的一個質粒。在其它的方法中，構建體是攜帶有大小大約在25kb和大約在50kb之間的基因組DNA片段的一個粘粒。在某些方法中，包含在基因組DNA片段的編碼序列(如，抗原編碼序列)的表達不是被異源的啟動子驅動的。病原體可以是，如一種或多種類型的細菌或一種或多種類型的病毒(如，單純皰疹病毒或“HSV”)。構建體(如質粒或粘粒)可以，如通過穿越皮膚的(transdermal)用藥的方式來施用。因此，本發明也提供遺傳構建體在藥物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有來源于病原體的至少5kb大小的基因組DNA片段，該藥物通過施用所述構建體給脊椎動物受試者，引發免疫應答，藉此包含在所述基因組DNA片段中的序列編碼的抗原得以表達，其表達量足以引發免疫應答。另一方面，本發明提供一個在脊椎動物受試者中引發免疫應答的方法。該方法包括這些步驟(a)提供一個與攜帶來源于一個或多個病原體的基因組DNA片段的構建體包被在一起的核心載體，其中基因組DNA片段包含有一個抗原編碼序列；和(b)使用顆粒介導的穿越皮膚的遞送技術，將包被的核心載體施用給受試者，藉此存在于基因組DNA片段的一個編碼序列編碼的抗原在受試者中得以表達，其表達量足以引發免疫應答。基因組DNA片段在大小方面大約大于5千堿基對。在某些方法中，構建體是一個質粒并且攜帶大小從約5到約25千堿基對的基因組DNA片段。在其它的方法中，構建體是一個粘粒并且攜帶大小從約25到大約50千堿基對的基因組DNA片段。在某些方法中，包含在構建體(例如，質粒或粘粒)的基因組DNA片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。對于本文描述的任何質粒或粘粒構建體，核心載體，典型地，有約0.5至大約5μm的平均直徑和足以準許穿越皮膚的遞送進入受試者之內的密度。核心載體可能由金屬，如金，組成。病原體可能是，例如，一種或多種類型的細菌，一種或多種類型的病毒，或可能來自兩種或多種不同的病原體。還有進一步的方法包括重復步驟(b)以提供最佳的和增強的施用措施。因此，本發明也提供遺傳構建體在藥物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有編碼來源于一個或多個病原體的抗原的大小至少5kb的基因組DNA片段，該藥物用于在脊椎動物受試者中引發免疫應答，其中該遺傳構建體包被在核心載體上，經由穿越皮膚的顆粒介導的遞送技術施用給受試者，并且，進一步，其中由存在于基因組片段的一個編碼序列編碼的抗原得以在受試者中表達，其表達量足以引發免疫應答。在本發明的另外一個方面，提供一個確定編碼抗原性多肽序列的方法。該方法需要有這些步驟(a)施用攜帶有從一個或多個病原體的基因組DNA片段獲得或來源的構建體，其中基因組DNA片段包含有或猜想有一個編碼抗原性多肽的序列并且，當被遞送至受試者后，抗原性多肽能以足以引發免疫應答的表達量從編碼序列表達；和(b)確定構建體上的編碼抗原性多肽的序列。在一個方法中，步驟(b)包含施用一個或多個步驟(a)中的構建體的片段和確定哪個片段編碼抗原性多肽。在另外的一個方法中，步驟(b)包含對構建體進行測序。本發明進一步提供遺傳構建體在組合物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有來源于一個或多個病原體的大小至少5kb的基因組DNA片段，通過給受試者施用所述構建體以確定編碼抗原性多肽的序列，其中基因組DNA片段包含一個所述抗原性多肽的編碼序列并且，在遞送之后，抗原性多肽能以足以引發免疫應答的表達量得以表達；并且確定構建體上編碼抗原性多肽的序列。在相關方面，本發明提供包含有攜帶獲得或來源于一個或多個病原體的基因組DNA片段的一個或多個構建體的疫苗組合物，如包含有一個或多個攜帶來自單純皰疹病毒2(HSV-2)的基因組DNA片段的構建體(如克隆#68)的疫苗組合物。在某些實施方案中，構建體是一個攜帶有大小范圍從大約5kb到25kb之間的基因組DNA片段的質粒。在其它的實施方案中，構建體是一個攜帶有大小范圍從大約25kb到大約50kb之間的基因組DNA片段的粘粒。在本文所描述的任何方法或組合物中，基因組片段能夠包含有病毒，如HSV-2病毒的立即早期區域(immediateearlyregions)(例如，ICP27，ICP0，ICP4，ICP22等)。例如，范圍大約從HSV-2基因組核苷酸114589位到134980位區域，或HSV-2基因組的核苷酸范圍從110931位到139697位的一個EcoRI酶切片段。HSV-2基因組的序列可以從發表的來源得到，如以登記號NC_001798存儲在GenBank的序列。在某些實施方案中，包含在構建體(例如，質粒或粘粒)的基因組DNA片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。疫苗組合物也可以包含有一種或多種佐劑。看了本公開后，本發明的這些和其它的實施方案將會很容易地被本領域普通技能人員想起。圖2描述在用HSV-2粘粒免疫的小鼠中血清抗體水平。圖3描述用HSV-2gD質粒或HSV-2粘粒免疫的動物體中抗原特異性的脾細胞增殖。實施本發明的方式在詳細地描述本發明之前，應當了解本發明并不限于特定的抗原或抗原編碼核苷酸序列。也應當了解本公開的方法的不同應用可以因本領域特殊的需要而修改。也應當了解本文用的術語僅僅是為了描述本發明的特定實施方案，而不是有意限制。本文引用的所有的出版物，專利和專利申請，無論上文或下文，特此全部引用作為參考。必須注意到，正如本說明書和附加的權利要求所用的，單數形式的“a”，“an”和“the”包括復數的對象，除非其內容在其它方面清楚地明示。因此，如，涉及“一個抗原”包括兩個或多個這樣的物質的混合物，涉及”一個顆粒”包括涉及兩個或多個這樣的顆粒混合物，涉及”一個受體細胞”包括兩個或多個這樣的細胞，及類似的情況。定義除非另有定義，本文使用的所有的技術和科學術語與本發明所涉及領域的普通人員普遍理解的意思相同。下列各項術語已有如下所指明的定義。術語“疫苗組合物”意指包含有抗原(例如，編碼抗原的多聚核苷酸)的任何藥物組合物，組合物能用來在一個受試者中預防或治療疾病或身體不適。因此，該術語既包含亞單位疫苗，也就是說，疫苗組合物含有從完整的生物體分離并且離散的(discrete)抗原，這種抗原自然狀態下是與該生物體相關聯的，也有含有完整的不再有傳染力的或減毒的或失活的細菌，病毒，寄生蟲或其它微生物的組合物。術語“穿越皮膚的(transdermal)”遞送意指進入皮膚內的(例如，進入真皮或表皮層之內)，穿越皮膚的(例如，”經由皮膚的”)和穿越粘膜的(transmucosal)施用，也就是，藉由藥劑進入或通過皮膚或粘膜組織之內遞送。參見，例如，TransdermalDrugDeliveryDevelopmentalIssuesandResearchInitiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，MarcelDekker，Inc.，(1989)；ControlledDrugDelivery.FundamentalsandApplications，RobinsonandLee(eds.)，MarcelDekkerInc.，(1987)；andTransdermalDeliveryofDrugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRCPress，(1987)。因此，該術語包含如美國專利號5,630,796所描述的從一個顆粒遞送設備(例如，無針頭的注射器)遞送和如美國專利號5,865,796所描述的顆粒介導的遞送。至于“核心載體”意謂一個載體顆粒，其上包被有核酸(例如，DNA)以便給與一個規定的顆粒大小和足夠高的密度以獲得進入細胞膜必需的動力，這樣，DNA就能通過使用顆粒介導的遞送技術被遞送，正如美國專利5,100,792所描述的那些。核心載體典型地包括這些材料如鎢、金、鉑、亞鐵鹽、聚苯乙烯和橡膠。參見，例如，ParticleBombardmentTechnologyforGeneTransfer.(1994)Yang，N.ed.，OxfordUniversityPress，NewYork，NY10-11頁。至于“顆粒遞送設備”或“無針頭的注射器”，意指一個穿越皮膚遞送微粒子組合物的器械，它沒有用于刺穿皮膚的傳統針頭。本發明使用的顆粒遞送設備在本文件從頭到尾都被討論。至于“抗原”意指一個包含一個或多個抗原表位的分子，所述抗原表位將會刺激宿主的免疫系統產生細胞抗原特異的免疫應答，或體液抗體應答。因此，抗原包括蛋白質、多肽、抗原性的蛋白質片段、寡糖、多糖等等。此外，抗原可能來自任何已知病毒、細菌、寄生蟲、植物、原生動物或真菌類，而且可能是完整的生物體。該術語也包括腫瘤抗原。同樣地，表達抗原的寡核苷酸或多聚核苷酸，例如DNA免疫應用中，也被包含在抗原的定義中。合成抗原也被包括在內，如多聚抗原表位、側翼抗原表位和其它的重組或合成來源的抗原(Bergmann等(1993)歐洲免疫學雜志(Eur.J.Immunol)232777-2781；Bergmann等(1996)免疫學雜志(J.Immunol)1573242-3249；Suhrbier，A.(1997)免疫學和細胞生物學(Immunol.andCellBiol)75402-408；Gardner等(1998)第12屆世界AIDS研討會(12thWorldAIDSConference)，日內瓦，瑞士，6月28日-7月3日，1998)。“合適的免疫應答”意指本發明的方法能在一個被免疫的受試者中引起針對單一抗原或抗原的以B和/或T淋巴細胞的產生為特征的免疫應答。術語“肽”被用在它最寬泛的意義上是指兩個或多個亞單位氨基酸、氨基酸類似物或其它的肽模擬物的化合物。亞單位可以由肽鍵或其它的鍵如酯、醚鍵等連接起來。本文使用的術語“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和L或D型兩種光學異構體和氨基酸類似物及肽模擬物。如果該肽鏈很短，三個或更多個氨基酸肽一般被稱為寡聚肽。如果肽鏈長，肽就被典型地稱為多肽或蛋白質。術語“病原體”被用在一個廣泛的意義上，是指引發免疫應答的任何分子的來源。因此，病原體包括，但不限于，毒性的或減毒的病毒、細菌、真菌、原生動物類、寄生蟲、癌細胞等等。典型地，免疫應答是由這些病原體產生的一個或多個肽引起的。如同下面所詳細描述的，來自這些和其它的病原體的編碼抗原性肽的基因組DNA被用來產生對自然感染反應模擬的免疫應答。考慮到本文的教導，包括使用得自超過一個病原體的基因組DNA的方法也將會是明顯的。術語“核酸分子”和“多聚核苷酸”可互換使用，是指任何長度核苷酸的多聚體形式，核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它們的類似物。多聚核苷酸可以有任何一種的三維的結構，并且可以執行任何的已知或未知的功能。多聚核苷酸的非限制的例子包括基因，基因片段，外顯子，內含子，信使RNA(mRNA)，轉運RNA，核糖體RNA，核酶，cDNA，重組多聚核苷酸，分枝的多聚核苷酸，質粒，載體，任何序列的分離DNA，任何序列的分離RNA，核酸探針和引物。多聚核苷酸典型地是由四個核苷酸堿基組成的一個特異的序列腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；和胸腺嘧啶(T)(當多聚核苷酸是RNA的時候，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶(T))。因此，術語多聚核苷酸序列是多聚核苷酸分子的線性表現形式。這一線性表現形式可以被輸入到具有中央處理器單元的計算機中的數據庫中并且用作諸如功能基因組學和同源檢索的生物信息學應用。“載體”或“構建體(construct)”是能夠轉移基因序列到靶細胞的元件(例如，病毒載體，非病毒載體，微粒子載體和脂質體)。“質粒”載體是一個能在宿主細胞中自我復制的染色體外的遺傳元件。“粘粒”載體是一個使用λ噬菌體cos序列的特殊類型的質體載體。術語“cos末端”“cos位點”是指λDNA的單鏈12個堿基的互補延伸。粘粒能攜帶大的插入物，如大小可達50kb左右，而典型的質粒攜帶大小大約在10kb之下的片段。由于它們的攜帶大片段的能力，粘粒用于基因組文庫的構建。典型地，“載體，”“構建體，”“表達載體”和“基因轉移載體，”意指能夠指導所關心的基因表達和能轉移基因序列到靶細胞的任何核酸構建體。因此，該術語包括克隆和表達載體，還有病毒載體。“基因組文庫”是共同代表一個生物體的完整基因組的重組核酸分子的集合。“編碼序列”或“編碼”所選多肽的序列是一個核酸分子，當其放置在適當的調控序列(或“控制元件”)控制下的時候，在體內被轉錄(在DNA的情況下)并且翻譯(在RNA的情況下)成多肽。編碼序列的界線是由5′(氨基)末端的一個起始密碼子和3′(羧基)末端的一個翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括，但不限于，來自病毒的cDNA，原核生物或真核生物的mRNA，來自病毒的基因組DNA序列或原核生物的DNA，甚至合成的DNA序列。轉錄終止序列可以位于編碼序列的3′一端。編碼序列的轉錄和翻譯通常被“控制元件”調控，包括，但不限于，轉錄啟動子，轉錄增強子元件，Shine-Delagarno序列(S-D序列)，轉錄終止信號，多聚腺苷酸序列(位于翻譯終止密碼子的3′一端)，優化翻譯起始的序列(位于編碼序列的5′一端)，和翻譯終止序列。“啟動子”是一段指導編碼多肽的多聚核苷酸轉錄的核苷酸序列。啟動子能包括可誘導的啟動子(可操作地連接到啟動子的多聚核苷酸序列的表達由分析物、輔助因子、調節蛋白等誘導)，可抑制的啟動子(可操作地連接到啟動子的多聚核苷酸序列的表達由分析物、輔助因子、調節蛋白等抑制)，和組成型的啟動子。術語“啟動子”或“控制元件”意指包括全長的啟動子區域和這些區域的功能(例如，控制轉錄或翻譯)節段。“分離的多聚核苷酸”分子是從自然界發現該分子的完整的生物體分離和離散的核酸分子；或一個核酸分子，全部或部分地缺乏天然狀態下與之正常關聯的序列；或一個序列，如同它在自然界存在一樣，但具有隨其關聯的異源序列(在下文定義)。一個序列如果它與來源分子、它的cDNA及其互補物的一個區域有相同或相當程度相同的堿基對序列，或表現出如下文所述的序列一致性，就是“來源于或獲得自”一個分子。“可操作地連接”是指元件的排列，其中所述的元件被裝配以便行使其通常的功能。因此，一個給定的可操作地連接到一個編碼序列(例如，編碼所關心的抗原)的啟動子，當存在適合的酶的時候，是能夠影響編碼序列的表達的。啟動子或其它的控制元件不需要鄰近編碼序列，只要它們發揮指導其表達的功能。如，插入性非翻譯但仍然轉錄的序列可以存在于啟動子序列和編碼序列之間并且啟動子序列仍能被認為是“可操作地連接”到編碼序列的。本文使用的描述一個核酸分子的“重組的”意指一個基因組的、cDNA的、半合成的或合成來源的多聚核苷酸，合成來源是根據其來源或操作而言的(1)不與同它在自然狀態下一起關聯的全部或部分多聚核苷酸關聯；和/或(2)連接到不同于它在自然狀態下連接的多聚核苷酸。術語“重組的”涉及蛋白質或多聚核苷酸時意指通過重組多聚核苷酸的表達而產生的多肽。確定核酸和氨基酸的“序列一致性”的技術也是本領域公知的。典型地，這樣的技術包括確定基因的mRNA的核苷酸序列和/或確定由此編碼的氨基酸序列，以及將這些序列和另一核苷酸或氨基酸序列進行比較。通常，“一致性(identity)”是指兩個多聚核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸的各自的對應。兩個或多個序列(多聚核苷酸或氨基酸)能夠藉由確定它們的“百分比一致性”來比較。兩個序列的百分比一致性，無論核酸或氨基酸序列，是一個由兩個比對(aligned)的序列之間的精確匹配個數除以較短序列的長度，再乘以100后得來的數字。核酸序列的近似比對是由Smith和Waterman的局部同源算法(localhomologyalgorithm)提供的，AdvancesinAppliedMathematics2482-489(1981)。此算法通過使用由Davhoff開發的劃線矩陣，AtlasofProteinSequencesandStructureM.O.Dayhoffed.，5suppl.3353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation，華盛頓，D.C.，USA，且被Gribskov標準化(1986)Nucl.AcidsRes.14(6)6745-6763，可被應用于氨基酸序列。這一算法的一個示范性的運行是確定由GeneticsComputerGroup(Madison，WI)在“BestFit”這一應用軟件中提供的序列百分比一致性的確定。這個方法的默認參數在威斯康辛序列分析軟件包(WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual)的程序手冊第8版(1995)(可以從GeneticsComputerGroup，Madison，WI得到)中有描述。本發明上下文中確定百分比一致性的方法優選使用愛丁堡大學的MPSRCH軟件包，由JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開發，并由IntelliGenetics，Inc.(MountainView，CA)分發。從這一軟件包套件，可以進行Smith-Waterman算法，使用默認參數用于得分表(scoringtable)(如，gapopenpenaltyof12，gapextensionpenaltyofone，andagapofsix)。從這一數據產生的“匹配”值反映“序列一致性”。用于計算序列之間的百分比一致性或類似性的其它合適的程序通常是本領域熟知的，如另外的一個比對程序是BLAST，按默認的參數使用。如，BLASTN和BLASTP可使用如下的默認參數geneticcode＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sortby＝HIGHSCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDStranslations+Swissprotein+Spupdate+PIR。這些程序的細節能在下列各項英特網地址找到http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。可選擇的，同源性可以由多聚核苷酸雜交來確定，雜交的條件是在同源區域之間形成穩定的雙鏈體形式，隨后用單鏈特異的核酸酶消化并進行被消化片段的大小確定。如同使用上面的方法確定的那樣，兩個DNA或兩個多肽序列，當它們的序列在一個分子整個的定義長度下，呈現至少約80％-85％，優選至少約90％，和最優選至少約95％-98％序列一致性的時候，就說它們是彼此“大體上同源”。如本文使用的，大體上同源也是指序列與指定的DNA或多肽序列表現完全的一致性。大體上同源的DNA序列能由在如特定的系統所定義的嚴格條件下進行的Southern雜交實驗來確定。例如，嚴格的雜交條件可以包括50％甲酰胺、5×Denhardt氏溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml變性的鮭精DNA，而且洗滌條件可以包括37℃，2×SSC，0.1％SDS，隨后68℃1×SSC，0.1％SDS。定義適當的雜交條件在本領域的技能之內。參見，例如，Sambrook等，supra；DNACloning，supra；NucleicAcidHybridization，supra。本文使用的術語“佐劑”是指任何增強藥物，抗原，多聚核苷酸，載體等物質的作用的材料。想要指出的是，雖然沒有總是明確地陳述，同野生型或純化的肽佐劑(例如，重組產生的或其突變蛋白質)有相似生物學活性的分子和編碼這些分子的核酸有意地被使用在本發明的精神和范圍之內。如本文所使用的，術語“治療”包括下述任何之一感染或再感染的預防；癥狀的減輕或消除；以及病原體的減少或完成消除。治療可以預防性地(在感染之前)或治療性地(在感染之后)起作用。至于“脊椎動物受試者”意指脊索動物亞門，特別是哺乳動物，包括，而不限制于，人和其它的靈長類的任何成員。該術語不指明一個特別的年齡。因此，成年的和新生的個體都被有意包含在內。發明概觀在詳細地描述本發明之前，應當理解本發明并不限于特定的公式化表述或方法參數，因為這些當然可以變化。也應當理解本文所用的術語僅是為了描述本發明的特定實施方案，而不是有意限制。本發明提供在受試者中引發免疫應答的新方法。簡要地，產生攜帶有代表一個或多個病原體(例如，細胞，組織，病毒等)的基因組的大的多聚核苷酸(例如，DNA)片段的載體文庫。這些載體，依賴于基因組片段的大小，典型地是質粒或粘粒的形式。文庫可以包含重疊或非重疊的插入物。一個或多個所選擇的基因組文庫的克隆以一個有效引發免疫應答的量施用到受試者體內。這樣，很多的抗原(和它們的相應抗原表位)能在一個單一免疫步驟中被施用到受試者中。此外，因為構建體攜帶的大的基因組片段(例如，粘粒或質粒)包含有它們的內源性的表達控制元件，進一步的分子操作(舉例來說，異源啟動子序列的插入以驅動來自存在于基因組片段的編碼序列的表達)就不需要了。然而，異源控制可以存在于構建體，舉例來說，當基因組序列來自原核生物例如細菌時。進一步地，因為內源性的控制元件(例如，順式和/或反式作用調節元件)在宿主個體內驅動抗原的表達和因此，免疫原性基因的產物就能以類似天然感染產生的水平得以產生，由構建體引發的總免疫應答更接近地模擬因天然感染產生的反應。相反，在前述表達文庫免疫中異源啟動子的使用會導致病原體基因的非選擇性表達。本發明也包括用來確定編碼抗原性片段序列的一個有效的方法。特別地，具有一個已知遺傳成分的構建體的用途，其允許確定編碼抗原性多肽序列的方法。舉例來說，在一個受試者中誘發免疫應答的一個粘粒或質粒克隆被鑒定出來。然后參與免疫應答中的精確序列就能用本領域公知的方法，例如，克隆的測序，或藉由粘粒或質粒插入物進一步地片段化并測試這些較小片段的免疫原性來確定。本發明的多聚核苷酸可以在體外或體內引入細胞之內，例如，通過傳統的轉染技術或藉由將多聚核苷酸包被在顆粒之上，然后使用顆粒介導的轉染將包被的顆粒施用于細胞。可選擇的，多聚核苷酸可以以一個微粒(例如，粉末)的形式提供，在國際公布號WO98/10750中會有更充分的討論，引入本文作為參考。本發明的優點包括，但不限于，(i)擴展用于引發免疫應答的抗原的數字(number)；(ii)提供一個更接近地模擬天然感染的抗原(例如，抗原表位)的陣列(array)；(iii)達到抗原和它們的關聯的野生型的調節元件共同遞送到相同的細胞之內，以便達成多個抗原的協調表達；(iv)引發類似于天然感染所引發的免疫應答；(v)引發比天然感染的反應具有更好保護作用的免疫應答，例如，免除優勢抗原的去除或抑制免疫應答的基因的去除；(vi)為后來的用在引發免疫應答質粒產物確定最有效的抗原組合；以及(vii)觸發通常參與清除細胞內感染的抗原加工和呈遞途徑。抗原本文描述的方法在引發針對廣泛多樣的細胞、組織和人類或動物病原體的免疫應答中是有用的。這些病原體包含一種或多種抗原。粘粒或質粒文庫基因組DNA的來源的非限制的例子包括病毒，細菌細胞，真菌細胞和其它的病原性生物體。合適的病毒抗原包括，但不限于，那些獲得或來自病毒肝炎家族，包括甲型肝炎病毒(HAV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，δ肝炎病毒(HDV)，戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)。參見，例如，國際公布號WO89/04669；WO90/11089；和WO90/14436。HCV基因組編碼數個病毒蛋白質，包括E1和E2。參見，例如，Houghton等。(1991)Hepatology14381-388。包含編碼這些蛋白質序列的基因組片段及其抗原性片段將會用于本方法中。同樣地，來自HDV的δ-抗原的編碼序列是已知的(參見，例如，美國專利第5,378,814號)。以相似的方式，來自皰疹病毒族的廣泛多樣的蛋白質能作為抗原在本發明中使用，包括來自單純皰疹病毒(HSV)類型1和2的蛋白質，例如HSV-1和HSV-2的糖蛋白gB，gD和gH；來自痘皰疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)和包括CMVgB和gH的巨細胞病毒(CMV)的抗原；和來自其它的人皰疹病毒如HHV6和HHV7的抗原。(參見，例如Chee等(1990)Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，ed.，Springer-Verlag，pp.125-169；McGeoch等。(1988)J.Gen.Virol.691531-1574；美國專利第5,171,568號；Baer等(1984)Nature310207-211；和Davison等(1986)J.Gen.Virol.671759-1816)。人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原，例如多數愛滋病毒-1和愛滋病毒-2分離株的gp120分子，包括愛滋病毒的各種不同遺傳的亞型成員，是已知而且報導過的(參見，例如，Myers等，LosAlamosDatabase，LosAlamosNationalLaboratory，LosAlamos，NewMexico(1992)；和Modrow等(1987)J.Virol.61570-578)61570-578)而且從這些分離株中的任何一個來源或獲得的包含抗原的基因組片段將會用于本發明。此外，其它從多種不同的愛滋病毒分離株中任何一個來源或獲得的免疫原性蛋白質將會用于本文，包括含有一個或多個不同包膜蛋白質如gp160和gp41，gag抗原如p24gag和p55gag的片段以及來自愛滋病毒pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR區域的蛋白質。從其它病毒來源或獲得的抗原也將會用于本文，例如沒有限制地，來自小RNA病毒家族成員(例如脊髓灰質炎病毒，鼻病毒等)；杯狀病毒；披膜病毒(例如，風疹病毒，登革熱病毒等)；黃病毒；冠狀病毒；呼腸孤病毒(例如，輪狀病毒等)；Birnaviridae病毒；彈狀病毒(例如，狂犬病病毒等)；正粘病毒(例如，流行性感冒病毒A、B和C型等)；線狀病毒；副粘病毒(例如，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒等)；布尼亞病毒；沙粒病毒；逆轉錄病毒(例如，HTLV-I；HTLV-II；愛滋病毒-1(也以HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等聞名))包括但不限于來自分離株HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN的抗原)；愛滋病毒-1CM235，愛滋病毒-1US4；愛滋病毒-2，在其它的之中；猴免疫缺陷病毒(SIV)；人乳頭瘤病毒，蜱傳腦炎病毒等的抗原。參見，如病毒學，第三版(W.K.Jokliked.1988)；FundamentalVirology，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)，得到這些和其它病毒的描述。在某些情況下，可以優選的是選擇的病毒抗原獲得或來源于這樣一個病毒病原體，它典型地經由粘膜表面進入身體而且已知是造成或與人疾病相關聯的，例如，但不限于，愛滋病毒(愛滋病)，流行性感冒病毒(Flu)，單純皰疹病毒(生殖器感染，感冒瘡，STDs)，輪狀病毒(腹瀉)，副流感病毒(呼吸道感染)，脊髓灰質炎病毒(脊髓灰質炎)，呼吸道合胞體病毒(呼吸感染)，麻疹和流行性腮腺炎病毒(麻疹，流行性腮腺炎)，風疹病毒(風疹)和鼻病毒(感冒)。包含細菌和寄生蟲抗原的基因組片段能從已知的成為疾病病因的病原體獲得或來源，這樣的疾病包括，但不限于，白喉，百日咳，破傷風，結核，細菌性或真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍亂，傷寒，腦膜炎，單核細胞增多癥，鼠疫，志賀氏菌病或沙門菌病，軍團菌疾病，萊姆病，麻瘋病，瘧疾，鉤蟲病，盤尾絲蟲病，血吸蟲病，錐蟲病(Trypamasomialsis)，Lesmaniasis，賈第蟲病(Giardia)，阿米巴病，絲蟲病，Borelia和旋毛蟲病。進一步，抗原可能從非常規的病毒獲得或者來源，如庫魯病，克羅伊茨費爾特-雅各布綜合癥(Creutzfeldt-Jakob病，CJD)，瘙癢病，可傳染的水貂腦病和慢性消耗性疾病的病原體因子，或者從蛋白質感染顆粒如同瘋牛病相關聯的朊病毒獲得或者來源。特異的病原體可以包括結核分枝桿菌，衣原體，奈瑟氏淋球菌，志賀氏菌，沙門氏菌，霍亂弧菌，Treponemapallidua，假單胞菌，百日咳博德特氏菌，布魯氏菌，Franciscellatulorensis，幽門纏繞桿菌，Leptospriainterrogaus，嗜肺軍團菌，鼠疫耶爾森氏菌，鏈球菌(類型A和B)，肺炎球菌，腦膜炎球菌，流感嗜血桿菌(類型b)，Toxoplasmagondic，Complylobacteriosis，粘膜炎莫拉氏菌，腹股溝肉芽腫，和放線菌病；真菌病原體包括念珠菌病和曲霉病；寄生蟲病原體包括絳蟲，吸蟲，蛔蟲，阿米巴病，梨形鞭毛蟲病，隱孢子蟲，血吸蟲，卡氏肺孢子蟲，毛滴蟲病和旋毛蟲病。因此，本發明也被用來提供對很多的獸醫疾病，如口蹄疫，冠狀病毒，多殺巴斯德菌，纏繞桿菌，尋常圓線蟲，胸膜肺炎放線桿菌，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，肺炎桿菌，大腸桿菌，百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和brochiseptica的合適的免疫應答。佐劑在一些實施方案中，本發明可以有效地與任何合適的佐劑或佐劑的組合一起使用。舉例來說，合適的佐劑包括，但沒有限制，從鋁鹽(明礬)形成的佐劑，如氫氧化鋁，磷酸鋁，硫酸鋁等；水包油和油包水乳劑形式的，如完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)；從細菌細胞壁成分形成的佐劑，如包括脂多糖的佐劑(例如，脂質A或單磷脂酰脂質A(MPL)，Imoto等，(1985)Tet.Lett.261545-1548)，trehalosedimycolate(TDM)，和細胞壁骨架(CWS)；熱休克蛋白質或其衍生物；來自腺苷酸二磷酸-核糖基化細菌毒素的佐劑，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍亂毒素(CT)，大腸桿菌熱不穩定的毒素(LT1和LT2)，假單胞菌內毒素A，假單胞菌外毒素S，仙人掌芽孢桿菌(B.cereus)胞外酶，sphaericus芽孢桿菌毒素，肉毒梭菌C2和C3毒素，limosum梭菌胞外酶，和來自產氣莢膜梭菌、spiriforma梭菌、差異(difficile)梭菌金黃色葡萄球菌EDIN的毒素和腺苷酸二磷酸-核糖基化細菌毒素的突變體如CRM197，一個非毒性的白喉毒素突變體(參見，如Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251175；和Constantino等(1992)Vaccine)；肥皂素佐劑如QuilA(U.S.Pat.No.5,057,540)，或從肥皂素產生的顆粒例如ISCOMs(免疫刺激復合物)；趨化因子和細胞因子如白介素(如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12等)，干擾素(例如，γ干擾素)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)，防御素1或2，RANTES，巨噬細胞炎癥蛋白-α和巨噬細胞炎癥蛋白-2等；胞壁酰肽如N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕櫚酸甘油酰-sn-glycero-3-huydroxyphosphoryloxy)-乙胺(MTP-PE)等；來自CpG分子家族，CpG二核苷酸和包含CpG基本單元的合成寡核苷酸的佐劑(參見如Krieg等Nature(1995)374546，Medzhitov等(1997)Curr.Opin.Immunol.94-9，和Davis等J.Immunol.(1998)160870-876)，例如TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQIDNO1)和ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQIDNO2)和合成佐劑例如PCPP聚-二(苯氧基羧酸酯)膦腈(Poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](Payne等Vaccines(1998)1692-98)。這樣的佐劑通過商業途徑從銷售商處得到，這些銷售商如AccurateChemicals；RibiImmunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis，MO。佐劑可以單獨遞送或兩個或多個佐劑聯合遞送。關于這一點，聯合的佐劑在促進免疫應答方面可以有疊加的或協同的效應。協同效應是指聯合的兩個或多個佐劑取得的結果比人們預想的比僅僅將每一個佐劑單獨施用時取得的效果加起來大。基因組文庫的制備基因組文庫可以藉由本領域公知的任何方法產生。多種來源能用于基因組DNA。基因組DNA可以從商業途徑得到，例如，從諸如AdvancedBiotechnologiesInc(ABI)和Clonetech，Inc.來源。另外的標準的來源當然是從生物體(例如，病毒，細菌，寄生蟲，或其它的病原體)，細胞(例如，癌細胞)，或選擇的組織分離的基因組DNA。可選擇的，DNA可以用本領域已有的技術從RNA(例如，RNA病毒)制備。來自被選擇的來源基因組DNA能用標準的步驟分離，典型地包括連續的酚和酚/氯仿抽提，然后用乙醇沉淀。在沉淀反應之后，來自一個所關心的生物體、細胞或組織的DNA，可以用限制性核酸內切酶處理，完全或部分地消化DNA以產生合適的片段。被選擇的大小的DNA片段能被許多技術分離開來，包括瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或脈沖場凝膠電泳(Carle等，(1984)Nuc.AcidRes.125647-5664；Chu等，(1986)Science2341582；Smith等，(1987)MethodsinEnzymology151461)，以提供一個合適大小的起始材料用于克隆。本文使用的另外一個獲得核酸序列的方法為通過重組的方式。因此，一個所需要的核苷酸序列能用標準的分子生物學程序從攜帶有相同的載體上切下來。位點特異的DNA切割能用合適的限制性酶(或酶)在本領域通常被了解和商業途徑得到的限制性酶的制造者所敘述的詳細說明的條件之下進行。如果需要，切割片段的大小分離可以使用標準的技術用聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳進行。如果需要，使用標準的技術，在存在四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)的情況下，用大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)處理，限制切割片段可以是平末端的。Klenow片段補平5’單鏈突出，但是即使在存在四種dNTPs的情況下，也消化突出的3′單鏈。如果需要，選擇性的修復能藉由只供應一種或幾種選擇的dNTPs在突出部分性質要求的限制之內進行。在Klenow處理之后，混合物能用如酚/氯仿抽提出來并用乙醇沉淀。在適當的條件下用核酸酶S1或BAL-31處理就導致任何單鏈部分的水解。一旦基因組片段已制備或分離，這樣的序列能被克隆進任何合適的載體構建體或復制子。很多克隆載體是那些本領域技術人員所知的，并且合適的克隆載體的選擇是選擇的一件要事。在一個優選的實施方案中，基因組片段被克隆進入粘粒產生粘粒文庫。當使用粘粒克隆載體的時候，片段是大的，優選大小在大約20,000bp(20kb)和50,000個堿基對(50kb)之間(或在其間的任何整數)，優選在大約25kb和50kb之間，更優選在約30-35kb和50kb之間，和甚至更優選在大約35kb和大約50kb之間。合適的粘粒載體商業途徑可得到，例如SuperCos1粘粒載體試劑盒(Stratagene，LaJollaCalifornia)。DNA的連接進粘粒是按制造商指示的進行的或者鑒于本說明書教導，可以使用本領域公知的方法以經驗為主來確定。在另外的一個優選的實施方案中，基因組片段被克隆進入質粒產生質粒文庫。當使用質粒克隆載體的時候，片段典型地是大小大約在5,000bp(5kb)和25,000個堿基對(25kb)之間(或在其間的任何整數)之間，優選在大約10kb和25kb之間，更優選在約10-15kb和25kb之間，和甚至更優選在大約15kb和20kb之間。合適的質粒載體商業途徑可以得到。鑒于本說明書的教導，DNA連接進入質粒使用本領域熟知的方法進行。如同上文所描述的，本發明的一個優點是大的基因組片段包括內源性的轉錄和翻譯調控元件。這些調節控制序列包括例如啟動子(起始轉錄相關聯的一個序列)，增強子(增強轉錄的順式-作用序列)和其它的元件包括那些引起編碼序列的表達被打開或關閉的元件，因響應化學的或物理的刺激，包括調控化合物的存在。因此，在一個優選的實施方案中，針對載體和/或插入的多聚核苷酸的分子變更(modification)的數目是最小的。也有可能的是，在載體構建體上選擇的核苷酸序列可能置于異源的調控序列控制之下，如異源的啟動子，舉例來說，當基因組片段來自細菌或其它的原核生物細胞，而且需要在真核生物受試者表達時。編碼所關心的特定蛋白質的序列變更可以令人所想的達到這一目的。例如，在某些情況下，變更序列以便它以合適的方向附加到控制序列是必需的，也即維持閱讀框架。控制序列和其它的調控序列在插入載體之前可以連入編碼序列。此外，編碼序列能直接克隆進入一個已經包含控制序列和一個合適的限制酶位點的表達載體之內。多聚核苷酸的施用本文描述的基因組片段和輔助的物質可以被任何的合適方法施用。如下文描述，在一個優選的實施方案中，多聚核苷酸片段通過包被包含有該片段的合適構建體到核心載體顆粒之上的(例如，粘粒或質粒)，然后將包被的顆粒施用于受試者或細胞，而被施用。然而，基因組片段也可以使用病毒載體或使用非病毒系統被遞送，例如裸露的核酸遞送。病毒載體許多基于病毒的系統已用作基因遞送。例如，逆轉錄病毒系統是已知的而且通常使用具有一個成為整體(integrated)的缺陷原病毒(“輔助者(helper)”)包裝線，該缺陷原病毒表達病毒的所有基因，但是由于包裝信號，即psi序列的缺失不能夠包裝自己的基因組。因此，細胞系產生空的病毒外殼。生產線可能來自包裝線，除了輔助者之外，這些包裝線包含一個含有以順式方式存在，并為病毒的復制和包裝所必需的序列的病毒載體，即被稱為長末端重復(LTRs)的序列。所關心的基因組片段可以被插入載體之內并且被包裝在由逆轉錄病毒的輔助者合成的病毒外殼中。然后重組的病毒可以被分離而且遞送到一個受試者。(參見，例如，美國專利第5,219,740號)。代表性的逆轉錄病毒載體包括但不限于這樣的載體，例如，美國專利第5,219,740號描述的LHL，N2，LNSAL，LSHL和LHL2載體，這些載體已全部引入本文作為參考，還有這些載體的衍生物，例如本文描述的變更后的N2載體。逆轉錄病毒載體可以使用本領域熟知的技術構建。參見，例如，美國專利第5,219,740號；Mann等，(1983)Cell33153-159。以腺病毒為基礎的系統已被發展起來用作基因的遞送并且適合遞送本文描述的基因組片段。人的腺病毒是雙鏈的DNA病毒，通過受體介導的內吞作用進入細胞。因為他們容易生長和操作，并且在體內和體外表現出寬闊的宿主范圍，所以這些病毒特別適合遺傳的傳遞。例如，腺病毒可以感染人的造血，淋巴和骨髓起源的細胞。此外，腺病毒感染靜態和復制的靶細胞。不像逆轉錄病毒整合進入宿主基因組之內，腺病毒在染色體外存留，因此將和插入突變關聯的危險減到最小。病毒容易以高的滴度產生并且是穩定的，以至于它可以被純化和儲存。甚至在有能力復制的形式，腺病毒僅僅引起低水平的發病率并且不與人的腫瘤相關聯。因此，腺病毒載體利用這些優點被發展起來。對于腺病毒載體的描述和它們的用途，參見，例如，Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57267-274；Bett等，(1993)J.Virol.675911-5921；Mittereder等，(1994)HumanGeneTherapy5717-729；Seth等，(1994)J.Virol.68933-940；Barr等，(1994)GeneTherapy151-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6616-629；Rich等，(1993)HumanGeneTherapy4461-476。腺相關病毒載體(AAV)也可以用來施用本文描述的某些比較小的基因組片段(例如，5kb)。AAV載體可以來自任何AAV血清類型，包括但沒有限制，AAV-1，AAV-2，AAV-3，AAV-4，AAV-5，AAVX7等。AAV載體可以有一個或多個全部或部分刪除的AAV野生型基因，優選rep和/或cap基因，但是仍保留一個或多個功能性的側翼的反向末端重復(ITR)序列。一個功能性的ITR序列通常認為是AAV病毒粒子的拯救，復制和包裝所必需的。因此，一個AAV載體至少包括那些以順式方式存在為病毒的復制和包裝所必需的序列(例如，功能性的ITR)。ITR不需要是野生型的核苷酸序列，而是可以通過例如插入，缺失或核苷酸的替代而改變的，只要序列提供功能性的拯救，復制和包裝。AAV表達載體是使用公知的技術被構建的，以至少提供如在轉錄的方向上操縱性連接的成分，包括轉錄起始區域的控制元件，所關心的DNA和一個轉錄終止區域。控制元件被選擇以使之在哺乳動物細胞中是有功能的。作為結果的構建體包含操縱性連接的成分，以功能性的AAVITR序列為界限(5′和3′)。合適的AAV構建體可以使用本領域熟知的技術制成。參見，例如，美國專利第5,173,414號和5,139,941號；國際公布號WO92/01070(1992年1月23日公開)和WO93/03769(1993年3月4日公開)；Lebkowski等，(1988)Molec.Gell.Biol.83988-3996；Vincent等，(1990)Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress)；Carter，B.J.(1992)CurrentOpinioninBiotechnology3533-539；Muzyczka，N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol.andImmunol.15897-129；Kotin，R.M.(1994)HumanGeneTherapy5793-801；ShellingandSmith(1994)GeneTherapy1165-169；以及Zhou等(1994)J.Exp.Med.1791867-1875.傳統藥物的制備物(preparation)包含本發明基因組DNA片段的制備物的制劑(formulation)，有或沒有佐劑組合物的添加，可以通過使用普通技能的技工已具有的標準的藥物制劑化學和方法來實現。例如，包含一個或多個基因組片段(例如，存在于一個質粒或粘粒上)的組合物可以同一個或多個藥學上可接受的賦形劑或載體組合以提供一個液態的制備物。輔助的物質，例如加濕或乳化劑，pH值緩沖液物質等等，可以存在于賦形劑或載體中。這些賦形劑，載體和輔助的物質通常是藥學上的試劑，它們在接受該組合物的個體中不誘發免疫應答并且可以施用而沒有不適當的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括，但不限于，液體例如水，鹽水，聚乙二醇，透明質酸，甘油和乙醇。藥學上可接受的鹽也可以包括在其中，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽，氫溴化物，磷酸鹽，硫酸鹽等；以及有機酸鹽如醋酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽和類似的鹽。盡管不是必需的，有一點也是優選的，即制備物包含藥學上可接受的賦形劑用作穩定劑，特別是用于肽、蛋白或其它相似的分子，如果它們將被包含在疫苗組合物中。也充當肽的穩定劑的合適攜帶者的例子包括但沒有限制，藥學級的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇，肌醇，葡聚糖等等。其它的合適攜帶者包括也沒有限制，淀粉，纖維素，磷酸鈉或磷酸鈣，檸檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量的聚乙二醇(PEGs)及其組合。透徹討論藥學上可接受的賦形劑，載體和輔助的物質的資料見于REMINGTON′SPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.，N.J.1991)，已引入本文作為參考。某些核酸吸收和/或表達促進物(“轉染促進試劑”)也可以被包含在組合物中，例如那些如布比卡因，心臟毒素和蔗糖之類的促進劑和轉染促進載體如那些通常用來遞送核酸分子的脂質體或脂類的制備物。廣泛使用陰離子和中性脂質體并且用于遞送核酸分子是熟知的(參見，例如LiposomesAPracticalApproach，(1990)RPCNewEd.，IRLPress)。陽離子脂類制備物用作核酸分子的遞送也是熟知的載體。合適的脂類制備物包括DOTMA(N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammoniumchloride)，可從商標名lipofectinTM得到，以及DOTAP(1，2-bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propane)，參見，例如，Felgner等，(1987)Proc.Natl.AcadSci.USA847413-7416；Malone等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA866077-6081；美國專利號5,283,185和5,527,928，和國際公布號WO90/11092，WO91/15501和WO95/26356。這些陽離子的脂類可以優選地同中性的脂類例如DOPE(dioleylphosphatidylethanolamine)聯合使用，進一步，可以加入上述的脂類或脂質體制備物的轉染促進組合物包括精胺衍生物(參見，例如，國際公布號WO93/18759)和膜滲透化合物如GALA，短桿菌肽S6和陽離子膽鹽.(參見，例如，國際公布號WO93/19768)。此外，本發明的核酸分子可以裝入膠囊，吸附到，或關聯到，微粒子攜帶者。合適的微粒子攜帶者包括那些來自聚甲基甲基丙烯酸酯聚合物，和來自多聚(交酯類)和多聚(丙交酯-共乙交酯)的PLG微粒。參見，例如，Jeffery等，(1993)Pharm.Res.10362-368。也可以使用其它的微粒系統和聚合物，例如聚合物如聚賴氨酸，聚精氨酸，聚鳥苷酸，精胺，亞精胺以及這些分子的結合物。因此，制成的疫苗組合物將會典型地包括多聚核苷酸(例如，質粒或粘粒)，該多聚核苷酸包含至少一個來自被選擇的病原體的基因組片段，其數量足以發起一次免疫應答。合適有效的數量可以很容易地由本領域技術人員確定。這些數量將會落入一個經過常規試驗就可以確定的相對寬的范圍內。例如，當使用少至1μgDNA時，就能獲得免疫應答，而在其它的施用中，卻用了可達2mg的DNA。通常預期的是包含基因組片段的多聚核苷酸的有效劑量將會落在大約10μg到1000μg的范圍之內，然而在這一范圍之上和這一范圍之下的劑量也可以被發現是有效的。組合物因此可以包含從約0.1％到約99.9％的多聚核苷酸分子。傳統藥物制備物的施用上述藥物制劑的施用可以在整個治療過程中的一次劑量或連續或間歇用藥時有效。遞送液態組合物和包含微粒子組合物的液態懸浮液的最典型方式是經由傳統的針頭和注射器。此外，不同的液體噴射注射器是為本領域所知的并且可以用于施用本發明的組合物。決定施用最有效的方式和劑量的方法對本領域的技術人員是熟知的，并且會隨著遞送載體，治療的組合物，靶細胞和正被治療的受試者而改變。單一和多重(multiple)施用可以采用主治醫師選擇的劑量水平和方式完成。應該了解多聚核苷酸載體構建體可以攜帶超過一個基因組片段。此外，單獨的載體(例如，粘粒或質粒)，每一個表達一個或多個來自任何病原體的抗原也可以如本文所描述的那樣被遞送到一個受試者中。而且，也意味著，由本發明的方法遞送的多聚核苷酸可與其它合適的組合物和療法聯合。例如，為了在受試者中增加免疫應答，本文描述的組合物和方法可以進一步包括輔助的物質(例如，佐劑)，如藥理學制劑，細胞因子或等等。輔助的物質可以以例如，蛋白質或其它的高分子施用，同時、先于或晚于本文描述的DNA疫苗(例如，粘粒或質粒)的施用。核酸分子組合物也可以使用為本領域熟練人員所知的方法直接施用于受試者或，可選擇的，體外(exvivo)遞送到來自受試者細胞。包被的顆粒在一個實施方案中，包含基因組片段(例如，質粒或粘粒)的構建體，和其它的輔助成分例如佐劑可由載體顆粒遞送。施用這些核酸制劑的顆粒介導的遞送方法是本領域所知的。因此，一旦制備和適當地純化之后，上述質粒和粘粒構建體可以使用多種本領域公知的技術包被在載體顆粒(例如，核心載體)之上。載體顆粒選自在顆粒大小范圍典型地用作從一個合適的顆粒遞送設備進行細胞內遞送之內的有一個合適密度的材料。最適宜的載體顆粒大小將會，當然，依賴靶細胞的直徑。就本發明的目的而言，鎢，金，鉑和銥核心載體顆粒可以被使用。優選鎢和金顆粒。平均大小在直徑為0.5到2.0μm的鎢顆粒是容易得到的。雖然這些顆粒在用作顆粒遞送方法中有最佳的密度，而且允許高效包被DNA，但是鎢可以對某些細胞類型具有潛在的毒性。因此，金顆粒或微晶金(例如，金粉A1570，可從EngelhardCorp.，EastNewark，NJ得到)也將會用于本方法中。金顆粒在大小方面(可從AlphaChemicals得到1-3μm的顆粒大小，或從Degussa，SouthPlainfield，NJ得到包括0.95μm的顆粒大小范圍)提供一致性并且減少了毒性。許多方法是公知的并且已經就在金或鎢粉顆粒之上包被或沉淀DNA或RNA作了描述。大多數這樣的方法通常將一個預定數量的金或鎢和質粒DNA，CaCl2和亞精胺結合在一起。產生的溶液在包被過程中被不斷地渦動以確保反應混合物的一致。在核酸沉淀之后，包被的顆粒可以被轉移到合適的膜上并且在使用之前干燥，包被在樣品模塊或樣品盒表面或裝入遞送盒，用于合適的顆粒遞送設備中。肽佐劑(例如，細胞因子和細菌毒素)，也可以包被在相同或類似的核心載體顆粒之上。例如，肽可以通過根據經驗確定的比率簡單地與載體顆粒混合而附著在載體顆粒上，它是通過硫酸銨沉淀或其它為本領域技術人員所熟悉的溶劑沉淀方法或通過化學偶聯肽到載體顆粒而實現的。L-半胱氨酸殘基偶聯到金上以前已經有描述(Brown等，ChemicalSocietyReviews9271-311(1980))。其它的方法包括，例如溶解肽佐劑于無水乙醇、水或酒精/水混合物中，將溶液加入一定量的載體顆粒，然后在空氣或氮氣流之下邊渦動邊干燥混合物。此外，佐劑可以通過真空離心干燥在載體顆粒之上。一旦干燥，包被的顆粒可以重懸在一個合適的溶劑(例如，乙酸乙酯或丙酮)中，制成粉(例如，通過超聲)以提供一個基本上一致的懸浮液。然后以佐劑包被的核心載體顆粒就能與攜帶有基因組片段的構建體的核心載體顆粒聯合而且可在一個單一的顆粒注射步驟中施用，或單獨地從基因組片段組合物施用。包被顆粒施用在它們形成之后，以本發明的核酸制備物包被的核心載體顆粒，單獨或同例如，佐劑制劑聯合，使用顆粒介導的遞送技術被遞送到一個受試者。適合顆粒介導的遞送技術的不同的顆粒遞送設備是本領域公知的，并且都適合在本發明的實踐中使用。當前的設備設計使用一個爆發性的，電子或氣體的釋放以驅使包被的核心載體顆粒導向靶細胞。包被的顆粒自身可以以可釋放的方式附著在一個可移動的載體層，或可移動地附著到一個表面，氣體流沿著該表面通過，從該表面提升顆粒并加速它們朝向目標。在美國專利第5,204,253號中描述了氣體釋放設備的一個例子。在美國專利第4,945,050號中描述了一個爆發類型設備。在美國專利第5,120,657號中描述了一個電釋放類型的顆粒加速儀器的一個例子。在美國專利第5,149,655號中描述了適合本文使用的另外一個電釋放儀器。所有這些專利的公開全部引入本文作為參考。包被的顆粒被施用到受治療的實驗者中，以一種與劑量制劑相容的方式和一個將會有效引起所需免疫應答的數量。被遞送的組合物的數量，至于核酸分子，通常是在從0.001到100.0μg的范圍中，更典型的是每一劑量0.01到10.0μg的核酸分子，在肽或蛋白質分子情況是1μg到5mg，更典型肽的是1到50μg，依賴被治療的受試者而不同。必需的精確數量將會依賴被免疫的個體的年齡及綜合條件和被選擇的特別的核苷酸序列或肽，以及其它因素而改變。在讀了本說明書之后，本領域技術人員可以容易地確定合適有效的數量。因此，本文描述的基因組片段的一個有效量將會足以在一個免疫的受試者中引起合適的免疫應答，并且這個量將會落入一個經過常規試驗就可確定的相對寬的范圍。優選地，為了在被治療的受試者中引發免疫應答(例如，T細胞激活)，包被的核心顆粒被遞送到合適的受體細胞。微粒子組合物此外，本發明的基因組片段(例如攜帶有基因組片段的質粒或粘粒構建體)，還有一個或多個選擇的佐劑，可以被制成如微粒子組合物。更特別地，制成含有所關心的基因組片段的顆粒可以通過使用標準藥物制劑化學和方法而實現，這些全部的標準藥物制成化學和方法能容易地為有相當技能的技工得到。例如，一個或多個載體構建體和/或佐劑可以聯合一個或多個藥學上可接受的賦形劑或載體以提供疫苗組合物。輔助物質，如加濕或乳化劑，pH值緩沖液物質等等，可以存在于賦形劑或載體中。這些賦形劑，載體和輔助物質通常是制藥的試劑，它們本身不在接受組合物的個體中誘發免疫應答，可以施用而沒有不適當的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括，但不限于，液體例如水，鹽溶液，聚乙二醇，透明質酸，甘油和乙醇。其中也可以包括藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽如鹽酸鹽，氫溴化物，磷酸鹽，硫酸鹽類等；以及有機酸鹽如醋酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽，苯甲酸鹽等。雖然不是必需，但也是優選的是，核酸組合物將會包含一個藥學上可接受的載體作為穩定劑，特別是對肽、蛋白質或其它相似的佐劑或輔助的物質。也可充當肽的穩定劑的合適載體的例子包括，沒有限制，藥物級的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨糖醇，肌醇，葡聚糖等。其它的合適載體包括，還是沒有限制，淀粉，纖維素，磷酸鈉或鈣，檸檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量聚乙二醇類(PEGs)及它們的組合。透徹討論藥學上可接受的賦形劑，載體，穩定劑和其它輔助物質的資料可在REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCES(MackPub.Co.，N.J.1991)得到。已引入本文作為參考。如同上面所詳細說明的那樣，被制成的組合物將會包括一定數量的所關心的基因組片段，足以引發免疫應答。本領域的技術人員可以容易地確定合適有效的數量。這樣數量將會落入一相對寬的范圍，通常在大約0.1μg到25mg或更多的所關心的核酸構建體的范圍之內，而且經過常規試驗即可以確定特別合適的數量。組合物可以包含從約0.1％到約99.9％的核酸分子。如果一個佐劑被包含在組合物中，或有方法被用來提供一個微粒子佐劑組合物，佐劑將會以一個如上文所述的合適數量存在。然后，組合物使用標準的技術以顆粒形式被制備出來，這些技術如藉由簡單的蒸發(風干)，真空干燥，噴霧干燥，冷凍干燥(真空冷凍干燥)，噴霧-冷凍干燥，噴霧包被，沉淀，超臨界流體顆粒形成等。如果需要，作為結果的顆粒可以使用在普遍擁有的國際公布號WO97/48485描述的技術而使密度增加，該國際公布已引入本文作為參考。顆粒可以在使用之前包裝在單一單位劑量或多劑量的容器，該容器可以包含一個密封的包裝盒，其中封入合適量的含有合適核酸構建體(例如，質粒或粘粒)和/或被選擇的佐劑(例如，提供一個疫苗組合物)的顆粒。微粒子組合物可以以一種無菌制劑包裝，而且密封的包裝盒可以如此制成以保持制劑的無菌狀態，直到按照本發明的方法使用為止。如果需要，包裝盒可以適合在顆粒遞送設備中直接使用。這些包裝盒可以采用膠囊式，箔小袋式，香袋式，盒式等形式。本文描述了合適的顆粒遞送設備(例如，無針頭的注射器)。顆粒包裝在內的包裝盒可以進一步被貼上標簽以識別組合物并且提供有關的劑量信息。此外，包裝盒能以政府機構，例如食品和藥物管理局，規定的簡介的形式貼上標簽，其中該簡介表明包含在其中作為人類使用的抗原，佐劑(或疫苗組合物)的生產、使用或售賣在聯邦法律之下，得到政府機構的批準。然后微粒子組合物(僅包含所關心的一種或多種基因組片段，或同被選擇的佐劑組合在一起)能使用穿越皮膚的遞送技術被施用。優選地，微粒子組合物經由粉狀注射方法被遞送，例如從一個無針頭的注射器系統遞送，如那些描述在普遍擁有的國際公布WO94/24263，WO96/04947，WO96/12513和WO96/20022，全部引入本文作為參考。從這樣的無針頭注射器系統的顆粒遞送典型地是用通常有近似的大小從0.1到250μm范圍的顆粒實施，優選約10-70μm范圍。大于約250μm的顆粒也能從這些設備遞送，其上限是這樣的一個點，大小在這一點的顆粒會造成對皮膚細胞不適當的損害。被遞送的顆粒將會穿透目標表面的實際距離依賴于顆粒的大小(例如，假定一粗略球形的顆粒形狀的標稱顆粒直徑)，顆粒的密度，顆粒沖擊皮膚表面的初始速度以及皮膚的密度和動粘度。關于這一點，用于無針頭的注射的最佳顆粒密度范圍通常在約0.1和25g/cm3之間，優選在約0.9和1.5g/cm3之間，以及注射速度范圍通常在約100和3,000m/sec之間，或更大。藉由適當的氣壓，平均直徑在10-70μm的顆粒能以一個接近推進氣流的超音波速度被加速通過噴嘴。如果需要，這些無針頭的注射器系統能以預裝載(preloaded)的狀態提供，即包含含有基因組片段和/或選擇的佐劑的合適劑量的顆粒。裝載的注射器可以包裝在一個密封的包裝盒中，依照上文所描述的，可以進一步被貼上標簽。因此，本方法可以用來獲得大小范圍從約10到大約250μm的核酸顆粒，優選約10到大約150μm，和最優選約20到大約60μm；以及顆粒密度范圍從約0.1到大約25g/cm3，和約0.5到大約3.0g/cm3的體積密度，或更大。同樣地，選擇的佐劑顆粒能獲得大小范圍從約0.1到大約250μm的，優選約0.1到大約150μm，和最優選約20到大約60μm；顆粒密度范圍從約0.1到大約25g/cm3，和體積密度優選約0.5到大約3.0g/cm3，和最優選約0.8到大約1.5g/cm3。微粒子組合物的施用在形成之后，微粒子組合物(例如，粉末)藉由合適的穿越皮膚的遞送技術被穿越皮膚地遞送到脊椎動物受試者的組織中。適合施用所關心的物質的不同的顆粒遞送設備是本領域公知的，并且將會用于本發明的實踐中。一個特別優選的穿越皮膚的顆粒遞送系統使用一個無針頭的注射器來發射受控劑量的固體顆粒進入和穿過完整的皮膚和組織。參見，例如，Bellhouse等的美國專利5,630,796號，其描述了一個無針頭的注射器(名也為“PowderJect(r)顆粒遞送設備”)。其它的無針頭的注射器配置是本領域公知的而且本文已描述。包含一個治療上有效量的如本文描述的粉末狀分子的組合物能經由上文所述的顆粒遞送設備被遞送到任何合適的目標組織。例如，組合物能被遞送到肌肉，皮膚，腦，肺臟，肝臟，脾臟，骨髓，胸腺，心臟，淋巴，血液，骨骼軟骨，胰，腎臟，膽囊，胃，腸，睪丸，卵巢，子宮，直腸，神經系統，眼睛，腺體和結締組織。至于核酸分子，優選遞送到，并且分子表達在，末端分化細胞；然而，該分子也能被遞送到非分化，或部分分化了的細胞例如造血干細胞和皮膚纖維母細胞。粉末狀的組合物被施用到將受治療的實驗者中，以與劑量制成相容方式和將會預防性地和/或治療性有效性的數量。遞送的組合物的數量，通常每一劑量在從0.5μg/kg到100μg/kg的核酸分子的范圍內，依賴被治療的受試者而不同。其它藥物，例如生理學活性肽和蛋白質的劑量，通常從大約0.1μg到大約20mg范圍，優選10μg到大約3mg。必需的精確數量將會依賴被治療個體的年齡和普通條件，被治療狀況的嚴重性，遞送的特定制備物，施用的位點，以及其它因素而改變。本領域的技術人員容易地確定適當的有效數量。因此，本微粒子組合物的“治療性地有效數量”將會足以引起對疾病或病情癥狀的治療或預防，并且將會落入一個經過常規試驗就能確定的相對寬的范圍內。以下是實現本發明的具體實施方案的實施例。提供這些實施例，只是為了說明的目的，并不是以任何方式有意限制本發明的范圍。實施例1使用HSV-2粘粒的核酸免疫作用為了評價使用包含有HSV-2基因組DNA的DNA疫苗粘粒的核酸免疫作用的特異性和有效性，進行了下面的研究。A.粘粒的制備HSV-2粘粒HSV-2基因組DNA是藉由用HSV-2株系MS(ATCC#VR-54T)感染Vero細胞(ATCC#CCL-81)然后分離來自被感染的細胞基因組DNA而獲得的。包含HSV-2基因組片段的粘粒通過，如上文所述，用限制性酶EcoRI(NewEnglandBiolabs)消化HSV-2基因組DNA而產生。如圖1所示，HSV基因組已被作圖并且包含至少10個EcoR1位點，已用箭頭標明在圖中。按照制造商的說明，使用來自Stratagene的SuperCos1CosmidVectorKit將被消化的DNA連接到粘粒上。陽性粘粒首先通過純化的粘粒DNA的EcoRI消化產生的片段大小來鑒定。消化的DNA上樣到1％瓊脂糖凝膠(15小時脈沖場電解，運行時間在6V/cm，以120°角，14℃在0.5×TBE緩沖液中進行)。進一步的鑒定是基于用其它的限制性酶產生的限制性圖譜。這一初步的分析被用來確定相對于圖1所示的HSV-2基因組的片段位置。例如，粘粒#68包含一個從第7個擴展到第10個所示的EcoRI位點的HSV-2基因組片段，而克隆#74包含一個從第1個擴展到第4個描述的EcoR1位點的HSV-2片段。B.包被微粒的制備使用由Eisenbraun等，(1993)DNACellBiol.12791-797描述的技術，粘粒DNA被包被在1-3μm金顆粒(DegussaCorp.，SouthPlainfield，NJ)之上。簡而言之，藉由把13.26毫克的1-3微米金粉(Degussa)和一個適當量的粘粒DNA(每毫克金粉2μg)加入到一個含有500μl0.05M亞精胺(Sigma)的1.5毫升離心管中，粘粒DNA就被粘附到金顆粒。粘粒DNA和金通過在渦動過程中逐滴地加入500μl10％CaCl2(Fujisawa)而共沉淀，之后，沉淀物容許沉降數分鐘。金/DNA沉淀物通過在微量離心機中離心15秒而濃縮，在無水乙醇(Spectrum)中洗三次并且重懸在適量的乙醇(每毫升乙醇8.84毫克金粉)和每毫升乙醇0.05毫克聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(Spectrum)中。懸浮液然后被轉移到一個小玻璃瓶中，蓋上瓶蓋，浸入超聲水浴中2-5秒以溶解團塊。乙醇溶液然后被注射Tefzel管(McMaster-Carr)中，用離心力使金/DNA粘附到管的一邊。剩余的乙醇然后通過使用小的、受控制的氮氣流被逐出。然后將管用氮氣流干燥一小時，并被切割成半英寸的筒(cartridge)。筒在一個含有干燥劑的緊緊加蓋的玻璃閃爍小瓶中4℃存儲直到使用。如McCabe的美國專利5,584,807號所描述的，DNA包被的金顆粒然后被裝入Tefzel管，而且該管被切割成1.27cm長以在顆粒遞送設備中用作筒。氦-脈沖PowderJectXR顆粒遞送設備以前已經被描述(參見，美國專利5,584,807號)而且從PowderJectVaccines，Madison，WI可以獲得。在接種疫苗方面，每個1.27cm筒名義上包含了以1μgDNA包被的0.5毫克金顆粒。C.免疫通過包被粘粒(大約1μg粘粒/mg金，每一次射擊遞送0.5mg金)的金珠單發射擊，使用顆粒介導的遞送，免疫Balb/c小鼠。在初次免疫4星期之后動物被加強免疫。在加強免疫同時(4星期)及兩星期之后(6星期)收集血清。小鼠血清抗體水平在6星期時使用ELISA檢測。簡而言之，HSV-2抗原以10μg/mg的濃度制備在PBS中。100微升的HSV-2抗原制備劑加入到96孔板(Costar)每個孔中，濃度約為每孔1μg蛋白質。該板在4℃孵育過夜，然后用PBS/0.05％Tween20溶液洗3次。該板在室溫下用PBS/Tween5％干奶粉封閉1小時。以1∶100稀釋在PBS/Tween中的兔抗HSV-2(對照)抗體或小鼠血清(未知的)加入到合適的孔中。該板用PBS/0.05％Tween20洗3次。制備以1∶8000稀釋在PBS/Tween中的生物素偶聯的羊抗兔抗體并且取100μl加入到每個孔中。該板用PBS/0.05％Tween20洗3次。制備以1∶8000稀釋的鏈親合素-HRP，取100μl加入每個孔中，在室溫下孵育1小時。該板用PBS/0.05％Tween20洗6次。TMB僅僅在使用之前制備，取100μl加入到每個孔中并且在室溫孵育15。通過添加100μl1NH2SO4終止反應，光密度值由一個自動化的讀板儀在450nm處讀出。來自1∶160稀釋的值就個體動物(每組4個)進行平均，減去對照組(接種空載體的動物)的光密度。特別的粘粒的結果如圖2所示。條棒上面的數字是不同粘粒克隆的名字。D.細胞介導的免疫應答進行脾細胞增殖試驗以進一步評定HSV-2基因組來源的粘粒誘發細胞介導的免疫(CMI)應答的能力。這個試驗測量體外培養的脾臟來源的淋巴細胞的增殖能力，也就是，生長和分裂，因此導致在數目上的增加，以作為對HSV-2抗原的反應。藉由一個較高級的刺激指標評分，增殖的數量越大，針對抗原的免疫應答就越強。用包含有表達HSV-2gD-抗原，用PCR從HSV-2基因組DNA擴增來，并克隆進pTarget載體(Promega)的基因的質粒或用HSV-2基因組來源的粘粒(如上文所述，稱為第68號)免疫BALB/c小鼠。PowderJectXR顆粒遞送設備用來通過遞送質粒/粘粒DNA包被的金顆粒進入表皮層之內接種小鼠。小鼠進行一次初期和兩次加強(每次給予4個星期間隔)免疫。每次免疫包括遞送每0.5毫克金1μgDNA的單一注射。這些小鼠也有用蛋白質抽提物(100μg在PBS中)被注射在它們的耳廓中的，在第三次加強免疫之后的1-2個星期，來評定它們發起一個延遲類型的超敏感反應的能力。這些動物的右左耳分別用來自被HSV-2感染的和未感染的培養VERO細胞(ATCC#CCL-81)的蛋白質抽提物注射。在蛋白質注射三個星期之后，來自每一免疫組(在圖例框中標明為“gD質粒和粘粒#68”)的兩只小鼠，連同兩只未免疫的幼稚小鼠被殺死。來自這些動物的脾細胞被分離而且在體外用純的gD蛋白(0.1μg/孔)，或被HSV-2感染的VERO細胞蛋白抽提物(25或10μg/孔)，或不加抗原進行培養。在培養3天之后，抗原誘導的不同脾細胞群體的增殖反應通過被吸收進分裂細胞之內的放射性標記的胸腺嘧啶核苷(用閃爍掃描計數器每分鐘計數測量)進行定量。刺激指數(Stimulationindices)藉由吸收進抗原刺激脾細胞的放射性總量，也就是每分鐘計數(cpm)，除以它們相對應的非抗原刺激的脾細胞的cpm值而計算出來。在圖3中，抗原刺激的非免疫的幼稚脾細胞的刺激指數從來自免疫的小鼠脾細胞的值中被減去了，以便給出一個gD-抗原表達質粒引發的抗原特異的細胞介導的免疫水平的真實的表現，這是同HSV-2基因組來源的粘粒引發的相比較而言。這些結果清楚地證明HSV-2基因組來源的粘粒#68能夠在小鼠中引發抗HSV-2抗原的強的CMI應答。與來自用粘粒#68免疫的小鼠脾細胞獲得的應答相比較，來自gD質粒免疫的小鼠脾細胞的針對gD蛋白的CMI應答稍微高一些。相反，與來自用單一gD-抗原表達質粒免疫的小鼠的脾細胞獲得的應答相比較，來自用粘粒#68免疫的小鼠脾細胞產生的針對HSV-2感染的含有一個多陣列的HSV-2抗原的VERO細胞的蛋白質抽提物的CMI應答明顯要高。因此，這些數據證明了用一個基于粘粒的DNA-疫苗產生一個比較強的CMI應答的實用性。同樣地，進行了用上述HSV-2基因組來源的粘粒在豚鼠動物模型系統中的實驗。粘粒在這些動物中也引發了強的CMI應答。在隨后的在免疫的豚鼠中進行的挑戰性研究中，沒有觀察到保護性的免疫；然而，這些結果被視為是非決定性的。實施例2使用HSV-2質粒的核酸免疫A.質粒構建藉由用HSV-2株系MS(ATCC#VR-54T)感染VERO細胞(ATCC#CCL-81)并且分離來自純化的病毒顆粒的基因組DNA而獲得HSV-2基因組DNA。使用基因組DNA進行PCR來擴增用于克隆進入質體載體的片段。引物gB2，具有下面的序列CGCGTCTAGAAACGTTCGCGACCACGGGTGAC(SEQIDNO3)和引物gB3，具有下面的序列CGCGTCTAGATGATGGGGTCCCGCTAACTCGC(SEQIDNO4)，它們分別對應HSV-2基因組中的58160和52930序列，被用來藉由PCR來擴增一個大約5200bp的產物。另一種PCR產物藉由使用引物gB2(SEQIDNO3)和引物gB4，具有下面的序列CGCGTCTAGACCTTCATGACCGCGCTGGTCCT(SEQIDNO5)而產生。它們分別對應HSV-2基因組的58160和49670序列。這產生了一個大約8500bp的產物。兩種產物都包含編碼糖蛋白B蛋白的基因組序列。PCR循環詳述是98℃30秒，70℃10分鐘，進行35個循環。使用擴展的長模板PCR系統(ExpandLongtemplatePCRsystem)(BoehringerMannheim)進行PCR反應。反應條件是每個引物20pmoles，1μgHSV-2基因組DNA，1×buffer#1((5mMTris-HCl，pH9.2，1.6mM(NH4)2SO4，1.75mMMgCl2)，200μM脫氧核糖核苷(dNTPs，Sigma)，1％DMSO，10mMMgSO4，加水至50μL，并加入1個單位(U)的擴展DNA聚合酶(ExpandDNApolymerase)。PCR產物藉由在添加額外的100μMdNTPs之后，在72℃用1個單位TaqDNA聚合酶(Promega)孵育10分鐘進行“加A尾”。PCR片段從瓊脂糖凝膠純化純化出來并且按照制造商的說明書連接到pGEM-TEasy載體系統(Promega)。用連接混合物電擊轉化TOP10大腸桿菌感受態菌體(Stratagene)，保留有質粒的細菌在用氨芐青霉素制備的平板上被分離出來。從選擇的細菌菌落的過夜培養物進行DNA小量制備，純化的質粒用作測試所需要的插入物。瓊脂糖凝膠上的遷移率和一個適當的限制性模式用來鑒定陽性的質粒。B.包被微粒的制備使用Eisenbraun等(1993)DNACellBiol.12791-797描述的技術，質粒DNA被包被在1-3μm金顆粒(DegussaCorp.，SouthPlainfield，NJ)上。簡而言之，藉由把金粉和一個適當量的質粒DNA加入到一個含有亞精胺離心管中，質粒DNA就被粘附到金顆粒上。質粒DNA和金通過在渦動過程中逐滴地加入CaCl2(Fujisawa)而共沉淀，之后，沉淀物容許沉降數分鐘。金/DNA沉淀物通過在微量離心機中離心而濃縮，在無水乙醇中洗三次并且重懸在適量的乙醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中。懸浮液然后被轉移到一個小玻璃瓶中，蓋上瓶蓋，浸入超聲水浴中2-5秒以溶解團塊。乙醇溶液然后被注射到Tefzel管(McMaster-Carr)中，用離心力使金/DNA粘附到管的一邊。剩余的乙醇然后通過使用小的、受控制的氮氣流被逐出。然后管用氮氣流干燥一小時，并切割成半英寸的筒。筒在一個有緊緊加蓋的玻璃閃爍小瓶中4℃存儲直到使用。C.免疫通過包被質粒(大約每毫克金1個μg質粒，每一次射擊遞送0.5毫克金)的金珠的單發射擊，使用顆粒介導的遞送，免疫C57/black小鼠。在初次免疫4星期之后動物被加強免疫。收集在加強免疫同時(4星期)及兩星期之后(6星期)的血清。小鼠血清抗體水平在6星期時使用ELISA檢測，大體上與上文實施例1所述的完全相同。也進行了脾細胞增殖試驗以進一步評定HSV-2基因組來源的質粒誘發細胞介導的免疫(CMI)應答的能力。因此，本研究證明了基于質粒的DNA疫苗引發免疫應答的用途。因此，已經描述了引發免疫應答的新的組合物。也已描述使用這些組合物的方法。雖然描述了主題發明優選實施方案的一些細節，應當理解可以進行不離開由附加權利要求所定義的本發明精神和范圍的明顯的變化。權利要求1.遺傳構建體在藥物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有來源于病原體的至少5kb大小的基因組DNA片段，該藥物通過施用所述構建體給脊椎動物受試者，引發免疫應答，藉此包含在所述基因組DNA片段中的序列編碼的抗原得以表達，其表達量足以引發免疫應答。2.根據權利要求1的用途，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。3.根據權利要求1或2的用途，其中構建體是一個攜帶5kb到25kb大小所述基因組片段的質粒。4.根據權利要求1或2的用途，其中構建體是一個攜帶至少25kb大小的所述基因組片段的粘粒。5.根據權利要求4的用途，其中基因組DNA片段大小為大約35kb至大約50kb之間。6.根據前述任何一項權利要求的用途，其中構建體攜帶來自兩個或多個病原體的基因組片段。7.根據前述任何一項權利要求的用途，其中病原體是一種細菌。8.根據前述任何一項權利要求的用途，其中病原體是一種病毒。9.根據權利要求6的用途，其中基因組片段來自不止一種病毒。10.根據前述任何一項權利要求的用途，其中構建體藉由穿越皮膚的給藥而施用。11.根據權利要求10的用途，其中構建體提供在一個核心載體上。12.遺傳構建體在藥物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有編碼來源于一個或多個病原體的抗原的大小至少5kb的基因組DNA片段，該藥物用于在脊椎動物受試者中引發免疫應答，其中該遺傳構建體包被在核心載體上，經由穿越皮膚的顆粒介導的遞送技術施用給受試者，并且，進一步，其中由存在于基因組片段的一個編碼序列編碼的抗原得以在受試者中表達，其表達量足以引發免疫應答。13.根據權利要求12的用途，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。14.根據權利要求12或13的用途，其中構建體是一個攜帶5kb到25kb大小的所述基因組片段的質粒。15.根據權利要求12或13的用途，其中構建體是一個攜帶至少25kb大小的所述基因組片段的粘粒。16.根據權利要求12至15任何一項的用途，其中基因組DNA片段來自兩個或多個病原體。17.根據權利要求12至16任何一項的用途，其中病原體是一種病毒。18.根據權利要求12至17任何一項的用途，基因組DNA片段來自兩個或多個病毒。19.根據權利要求12至17任何一項的用途，其中病原體是一種細菌。20.根據權利要求12至19任何一項的用途，其中所述施用被重復以提供一個初始和一個加強的給藥。21.根據權利要求12至20任何一項的用途，其中核心載體有一個大約0.5至大約5μm的平均直徑和一個足以準許穿越皮膚的遞送進入受試者之內的密度。22.根據權利要求12至21任何一項的用途，其中核心載體由金屬組成。23.根據權利要求22的用途，其中金屬是金。24.遺傳構建體在組合物生產中的用途，該遺傳構建體攜帶有來源于一個或多個病原體的大小至少5kb的基因組DNA片段，該組合物通過給受試者施用所述構建體，確定編碼抗原性多肽的序列，其中基因組DNA片段包含一個所述抗原性多肽的編碼序列并且，在遞送之后，抗原性多肽能以足以引發免疫應答的表達量得以表達；并且確定構建體上編碼抗原性多肽的序列。25.根據權利要求24的用途，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。26.根據權利要求24或25的用途，其中構建體是一個攜帶5kb到25kb大小的所述基因組片段的質粒。27.根據權利要求24或25的用途，其中構建體是一個攜帶至少25kb大小的所述基因組片段的粘粒。28.根據權利要求24至27任何一項的用途，其中編碼抗原性多肽的序列藉由施用一個或多個所述遺傳構建體片段并且確定哪個片段包含編碼抗原性多肽的序列而確定。29.根據權利要求24至27任何一項的用途，其中編碼抗原性多肽的序列通過對遺傳構建體進行測序而確定。30.一種含有攜帶來自一種或多種病原體基因組DNA片段的一種或多種構建體的疫苗組合物，其中基因組片段至少5kb大小并且包含至少一個抗原編碼序列。31.一種根據權利要求30的疫苗組合物，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。32.一種疫苗組合物，其含有攜帶有來自單純皰疹病毒-2(HSV-2)的基因組DNA片段的一種或多種核酸構建體。33.一種根據權利要求32的疫苗組合物，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。34.一種根據權利要求32或33的疫苗組合物，其中來自HSV-2的基因組DNA片段包含與如圖1HSV-2基因組圖譜中所示的從第7擴展到第10個EcoR1位點的序列大體上同源的一段序列.35.一種在脊椎動物受試者中引發免疫應答的方法，所述方法包括施用攜帶有至少5kb大小基因組DNA片段的核酸構建體，其中基因組片段是從一種或多種病原體來源或獲得的而且構建體以足夠的量施用到受試者中，該量足以引發免疫應答以對抗包含在所述基因組DNA片段的序列所編碼的抗原。36.一種在脊椎動物受試者中引發免疫應答的方法，所述方法包括(a)提供一個以攜帶有來源于或獲得自一個或多個病原體的基因組DNA片段的構建體包被的核心載體，其中基因組DNA片段包含有一個抗原編碼序列，并且在大小方面大于5kb；和(b)使用顆粒介導的穿越皮膚的遞送技術，將包被的核心載體施用給受試者，藉此存在于基因組DNA片段的一個編碼的序列編碼的抗原在受試者中得以表達，其表達量足以引發免疫應答。37.確定編碼抗原性多肽序列的方法，該方法包括(a)施用一個或多個攜帶有至少5kb大小的從一個或多個病原體的基因組DNA片段獲得或來源的構建體，其中基因組DNA片段包含有一個編碼所述抗原性多肽的序列并且，當被遞送至受試者后，抗原性多肽能以足以引發免疫應答的表達量從編碼序列表達；和(b)確定構建體上的編碼抗原性多肽的編碼序列。38.根據權利要求35至37的任何一項的方法，其中包含在所述基因組片段里面的編碼序列的表達不是被異源的啟動子驅動的。全文摘要提供了通過在受試者中施用一種或多種大的基因組DNA片段引發免疫應答的方法。也提供了確定編碼抗原性多肽的序列的方法。也提供了含有一個或多個大的基因組DNA片段的疫苗組合物。文檔編號A61P31/00GK1409641SQ00816887公開日2003年4月9日申請日期2000年11月2日優先權日1999年11月3日發明者威廉·F·斯威恩,李·K·羅伯茨,蘭德恩·G·佩恩,拉爾夫·P·布勞恩申請人:寶德杰克特疫苗有限公司